1.6.7. Час тривання досліду
Тривалість досліду на канцерогенність складає основну частинужиття піддослідних тварин. Припинення досліду відбувається на18 місяць для мишей та хом'яків і на 24 місяць для щурів; однак,для окремих видів тварин, що мають більш тривалий період життяі/або низький рівень спонтанних пухлин, припинення досліду втакому випадку здійснюється на 24 місяць для мишей і хом'яків і на30 місяць для щурів. Крім того, припинення такого подовженогодосліду є прийнятним у випадку, коли кількість тварин, що вижили,в групі з найнижчим дозуванням або в контрольній групі досягає25%. При припиненні досліду, при якому спостерігається великарізниця в результатах за окремими статями, тварини кожної статіоцінюються окремо. Якщо тільки група з найвищим рівнем дозуваннявмирає достроково через очевидні ознаки інтоксикації, це неповинно впливати на час припинення досліду, за умови, що проявиінтоксикації не викликають проблем в інших групах. Для того, щобнегативні результати досліду були прийнятними, не більше 10%кожної групи може бути втрачено під час експерименту черезавтоліз, канібалізм або проблеми в управлінні, відсоток тварин, щовижили, є не меншим за 50% на 18 місяць для мишей і хом'яків і на24 місяць для щурів.
Сателітні групи, що складаються з 20 тварин кожної статі, якіприймають дози і контрольна група з 10 тварин кожної статі, щовикористовуються для тестування хронічної інтоксикаціївикористовується в досліді принаймні впродовж 12 місяців. Цітварини умертвляються з наступним оглядом на предмет виявленняпатології, пов'язаної з дослідом, неускладненої геронтологічнимизмінами.
1.6.8. Процедура
1.6.8.1. Огляди
Щоденні огляди в клітках повинні включати в себе огляди змінв шкірі і хутрі, очах і слизових оболонках, а також в дихальнихсистемах, системах кровообігу, автономній і центральній нервовійсистемі, схемі соматомоторної активності і поведінки.
Клінічні огляди проводяться через відповідні проміжки часудля тварин в сателітній групі (групах), що піддаються діїдослідної речовини.
Регулярні огляди тварин є необхідними для уникнення,наскільки це можливо, втрати тварин впродовж досліду через такіпричини як канібалізм, автоліз тканин або зміщення. Тварини, щовмирають, умертвляються і піддаються розтину.
Клінічні прояви, включаючи невробіологічні і окулярні зміни,а також смертність необхідно реєструвати для всіх тварин. Особливуувагу необхідно звернути на розвиток пухлин: реєструється часпочатку формування пухлини; розташування, розміри, вигляд іпрогресування кожної пухлини, що є значно помітною або відчутноюна дотик, необхідно також зареєструвати час утворення іпрогресування проявів інтоксикації.
Оцінка обсягу їжі, що споживається (об'єму води, щоспоживається, коли дослідна речовина подається з питною водою)здійснюється щотижнево впродовж перших 13 тижнів досліду, а потімприблизно через кожні три місяці, окрім випадків, коли станздоров'я або зміни ваги тіла вимагають протилежного.
Вага тіла кожної тварини записується окремо один раз на деньвпродовж перших 13 тижнів періоду дослідження і принаймні один разна чотири тижні після цього.
1.6.8.2. Клінічні дослідження
Гематологія
Гематологічні дослідження (наприклад, вміст гемоглобіну,показник гематокриту, кількість еритроцитів, загальну кількістьлейкоцитів, кількість тромбоцитів та інші характеристикипотенціалу згортання крові) необхідно проводити через кожні тримісяці, шість місяців і приблизно через кожні шість місяців післяцього, після закінчення досліду проби крові збираються у10 щурів/на стать з усіх груп. Якщо це можливо, проби кровіберуться від тих самих тварин в кожний інтервал.
У випадку, коли в результаті огляду в клітках виявленопогіршення здоров'я тварин впродовж досліду, необхідно здійснитивизначення лейкоцитарної формули крові уражених тварин.Диференційне визначення лейкоцитарної формули крові виконується назразках крові тварин з групи, що отримувала найвищу дозу і зтварин контрольної групи. Диференційне визначення лейкоцитарноїформули групи (груп) з меншими дозами виконується тільки в томувипадку, коли виявлено значну невідповідність в результатах,отриманих в групі з найвищою дозою і в контрольній групі, або якщоце необхідно у відповідності до результатів патологічнихдосліджень.
Аналіз сечі
Для аналізу відбираються проби сечі від тварин, що не єгризунами і від 10 щурів/на, якщо можливо, від тих самих щурів вті самі інтервали часу, що і гематологічні дослідження. Дляокремих тварин або для відповідних проб/статей/груп гризуніввизначаються наступні показники:
- вигляд: розміри і вага окремих тварин,
- білок, глюкоза, кетони, прихована кров (напів-кількісно),
- мікроскопія осаду (напів-кількісно).
Клінічна хімія
Через кожні шість місяців і в кінці дослідження відбираютьсязразки крові від всіх тварин, що не є гризунами і від10 щурів/стать всіх груп, з метою виконання досліджень клінічноїхімії, якщо можливо, зразки крові відбираються від тих самих щурівв кожний період. Крім того, до-тестовий зразок необхідно взяти відтварин, що не є гризунами. Зі зразків готується плазма крові, крімтого, необхідно визначити наступні характеристики:
- загальну концентрацію білку,
- концентрацію альбуміну,
- функціональні дослідження печінки наприклад, дію алкалінфосфатази, дію глютамінової пировиноградної транзамінази(1),глютамінової щавелево-уксусної транзамінази сироватки(2),гамаглуматил транспептидаз, орнітин декарбоксилази,
----------------
(1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.
(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.
- вуглеводний обмін речовин, наприклад, рівень глюкози вкрові, відібраної після утримання від їжі,
- дослідження функції нирок, наприклад, дослідження азотусечовини.
Загальний розтин
Повний загальний розтин здійснюється для всіх тварин,включаючи тих, що вмерли впродовж досліду або були вбиті під час,коли вони знаходились в передсмертному стані. До умертвіннянеобхідно взяти зразки крові у всіх тварин для визначеннялейкоцитарної формули. Всі значно помітні ушкодження, пухлини абоушкодження, що за підозрою є пухлинами, зберігаються. Необхіднодокласти зусиль щодо кореляції основних оглядів за допомогоюмікроскопічних досліджень.
Всі органи і тканини повинні бути законсервовані длягістопатологічних досліджень. Це звичайно стосується наступнихорганів і тканин: мозку(3) (варулієва моста, кори мозку) слизовіоболонки, щитовидні залози (включаючи пара-щитовидні залози),зобні тканини (включаючи трахею), серце, аорту, слинні залози,печінку(3), селезінку, нирки(3), надниркові залози(3), стравохід,шлунок, дванадцятипалу кишку, тонку кишку, підвздошну кишку, сліпукишку, товсту кишку, пряму кишку, сечовий міхур, лімфатичні вузли,підшлункову залозу, гонади(3), інші статеві органи, жіночі груднізалози, шкіру, мускулатуру, периферійну нервову систему, хребет натрьох рівнях (шийному, середньо-грудному, поперековому), груднукістку з кістковим мозком, стегно (включаючи суглоби) і очі.
----------------
(3) Ці органи від 10 тварин різної статі для кожної групигризунів мають бути зважені.
Заповнення легенів і сечового міхура фіксатором є оптимальнимспособом для збереження цих тканин; заповнення легенів приінгаляційних дослідах є важливим для проведення відповідногогістопатологічного дослідження. При проведенні спеціальнихдосліджень, таких як інгаляційні дослідження, необхідно дослідитивесь дихальний тракт, включаючи ніс, глотку і дихальне горло.
При проведенні інших досліджень інформація, отримана післяпроведення цих процедур, повинна бути доступною до мікроскопічногоогляду, оскільки вона може виявитись важливою для патологоанатома.
Гістопатологія
Для дослідження хронічної інтоксикації:
Необхідно виконати огляд всіх збережених органів всіх тваринсателітної групи з високим дозуванням і контрольних груп. Привиявлені патології, пов'язаної з дослідною речовиною в сателітнійгрупі з високим дозуванням, органи-мішені всіх інших тварин вінших сателітних групах, що приймають дослідну речовину,піддаються повному і детальному гістологічному огляду, так само,як і тварини, в групах канцерогенного дослідження після завершеннятакого дослідження.
Для дослідження канцерогенності:
(а) необхідно провести повну гістопатологію органів і тканинвсіх тварин, що вмерли, або були вбиті впродовж досліду і всіхтварин в контрольній групі і групі з високим рівнем дозування;
(b) всі очевидні пухлини або ушкодження, що за підозрою єпухлинами повинні досліджуватись під мікроскопом. Зокрема,рекомендується здійснити наступні процедури;
(с) якщо наявні значні розбіжності в частоті неопластичнихушкоджень в групах тварин з високим рівнем дозування і контрольнихгрупах, необхідно провести гістопатологію окремих органів аботканин в інших групах,
(d) якщо виживання в групі з високим рівнем дозування єзначно нижчим ніж в контрольній групі, необхідно повністюдослідити групи з нижчим рівнем дозування,
(е) якщо є очевидні докази в групі з високим рівнем дозуваннянаявності токсичного або іншого ефекту, що можуть вплинути нанеопластичну реакцію, необхідно повністю дослідити групи з нижчимрівнем дозування.
2. ДАНІ
Дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляєтьсязагальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження,кількість тварин, у яких впродовж досліду виявлені пухлини аботоксичний ефект, час виявлення пухлини і кількість тварин, у якихвиявлено пухлини після їх умертвіння. Результати оцінюються увідповідності до прийнятного статистичного методу. Можевикористовуватись будь-який визнаний статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступнуінформацію:
- породи, штам, джерело тварин, що використовувались,оточуючі умови, дієту,
- умови дослідження:
3.1.1. Опис апарату, для розповсюдження речовини:
включаючи конструкцію, тип, габарити, джерело повітря,систему для генерації часток і аерозолів, метод кондиціонуванняповітря, обробки відпрацьованого повітря і метод розміщення тваринв дослідних камерах, якщо вона використовується. Необхідно описатипристрій для вимірювання температури, вологи, при необхідності,стабільність концентрації аерозолю або розміру частки.
3.1.2. Дані, що стосуються дії речовини:
повинні бути представлені у вигляді таблиці як середнізначення і показники змінності (наприклад, стандартне відхилення)і повинні включати в себе:
(а) обсяг повітряного потоку в інгаляційному обладнанні;
(b) температуру і вологість повітря;
(с) номінальну концентрацію (загальний обсяг дослідноїречовини, що подається в інгаляційне обладнання, поділений наоб'єм повітря);
(d) природу середовища-носія, якщо використовується,
(e) дійсну концентрацію в дослідній зоні дихання;
(f) середній розмір частки (якщо цього вимагає ситуація),
- рівні доз (включаючи середовище, якщо використовується) іконцентрації,
- частоту появи пухлин за статтю, дозою і типом пухлини,
- час смерті впродовж досліду або факт виживання тварин доумертвіння, включаючи сателітну групу,
- дані щодо реакцію на токсичність за статтю і дозою,
- опис наслідків токсичності або інших наслідків,
- час спостерігання кожного аномального прояву і наступнідії,
- офтальмологічні дослідження,
- дані щодо харчування і ваги тіла,
- виконані гематологічні досліди і всі результати,
- дослідження клінічної біохімії і всі результати (включаючианаліз сечі),
- результати розтину,
- детальний опис всіх гістопатологічних дослідів,
- статистичну обробку результатів з описом використанихметодів,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
В.34. ДОСЛІДЖЕННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ТОКСИЧНОСТІ
ОДНОЇ ГЕНЕРАЦІЇ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідна речовина подається мірними дозами декільком групамсамців і самок. Самцям доза надається впродовж періоду зростання івпродовж принаймні одного циклу сперматогенезу (приблизно 56 дніву мишей і 70 днів у щурів), з метою викликання різноманітнихнегативних наслідків впливу дослідної речовини на сперматогенез.
Самки з генерації (Р) отримують дози принаймні впродовжостанніх двох тічкових циклів для викликання шкідливого впливудослідної речовини на статеву систему. Після цього твариниспарюються. Дослідна речовина подається особинам обох статейвпродовж періоду спарювання, а потім тільки самкам впродовжвагітності і періоду лактації. Використання інгаляційного методупотребує внесення відповідних змін.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
До початку досліду здорові молоді тварини випадкововідбираються до дослідних і контрольних груп. Тварини знаходятьсяв експериментальних умовах проживання і харчування впродовж,принаймні, п'яти днів до початку досліду. Рекомендується подаватидослідну речовину з їжею або питною водою. Інші шляхи подаваннядослідної речовини також є прийнятними. Всі тварини отримують дозидослідної речовини тим самим методом впродовж відповідногоекспериментального періоду. Якщо використовується середовище-носійабо інші добавки для спрощення дозування, вони повинні бутивизнані такими, що не викликають токсичного ефекту. Дозуванняздійснюється сім днів на тиждень.
1.6.2. Піддослідні тварини
Вибір видів тварин
Для досліду бажано використовувати щурів або мишей.Використовуються здорові тварини, що раніше не використовувалисьдля дослідів. Використовуються штами з низькою плодючістю.Піддослідні тварини характеризуються за видом, штамом, статтю,вагою і/або віком.
Для адекватного оцінювання плодючості необхідно дослідити яксамців, так і самиць. Лактація всіх піддослідних і контрольнихтварин до початку дозування повинна бути припинена.
Кількість і стать
Кожна піддослідна і контрольна група повинна містити достатнюкількість тварин для того, щоб приблизно 20 вагітних самокнародили в день закінчення досліду або до нього.
Метою досліду є отримання достатньої кількості вагітностей іпотомства для забезпечення достовірної оцінки потенціальноговпливу речовини на плодючість, вагітність і материнську поведінкуу тварин і генерації Р, а також на ссання, ріст і розвитокпотомства F від зачаття до припинення лактації.
1
1.6.3. Умови досліду
Їжа та вода надається на власний розсуд. При наближенні часунастання пологів самок необхідно розмістити в окремі клітки,призначені для пологів і годування, клітки можуть бути забезпеченіспеціальним устілковим матеріалом.
1.6.3.1. Рівні доз
В досліді використовується принаймні три дослідні і однаконтрольна група. Якщо використовується середовище-носій дляподання дослідної речовини, контрольна група повинна отримуватийого в найбільшому можливому об'ємі. Якщо дослідна речовинавикликає зниження споживання або використання їжі, дорученняконтрольної групи з відповідним графіком годування може виявитисьнеобхідним. Якщо доза не обмежується фізико-хімічними абобіологічними властивостями речовини, найбільша доза повиннавикликати інтоксикацію, але не смертельні випадки в групі тваринбатьків Р. Середня доза повинна викликати мінімальні наслідкиінтоксикації, що можуть бути віднесені до дослідної речовини, анизька доза не повинна викликати будь-яких очевидних шкідливихефектів на батьків або потомство. Якщо речовина подається череззонд або в капсулах, дози, що надаються кожній тварині,призначаються у відповідності до ваги тіла кожної тварини ірегулюються щотижня у відповідності до зміни ваги тіла. Для самокв період вагітності дози призначаються у відповідності до вагитіла в день 0 або 6 вагітності, якщо вона є бажаною.
1.6.3.2. Дослід на граничний вміст
У випадку використання речовини з низькою токсичністю, якщорівень дози 1 000 мг/кг не викликає жодного очевидного впливу наплодючість, в проведенні дослідження інших рівнів доз неманеобхідності. Якщо попереднє дослідження при високому Рівні дозпри очевидній материнські інтоксикації не виявляє шкідливоговпливу на плодючість, в проведенні дослідження інших рівнів дознема необхідності.
1.6.3.3. Виконання досліду
Графіки експериментів
Щоденне дозування батьківських самців (Р) повинно починатисьу віці від п'яти до дев'яти тижнів, після припинення їх годуваннямолоком і акліматизації впродовж приблизно п'яти днів. У випадкувикористання щурів дозування триває 10 тижнів до спарювання (длямишей - вісім тижнів). Самці умертвляються і досліджуються або вкінці періоду спарювання, або продовжують приймати досліднийраціон для можливого народження другого посліду, вбиваються ідосліджуються за певний проміжок часу перед закінченням досліду.Для батьківських самок (Р) дозування має початись післяакліматизації впродовж принаймні п'яти днів і тривати принаймнідва тижні до спарювання. Щоденне дозування Р самок повинно триватитри тижні періоду спарювання, період вагітності і до припиненнялактації потомства F . Необхідно звернути увагу на зміну графіку
1
дозування на підставі іншої наявної інформації щодо дослідної
речовини, такої як метаболізм або біо-акумуляція.
Процес спарювання
При дослідженні репродуктивної токсичності використовуєтьсяпропорція 1:1 (один самець на одну самку) або 1:2 (один самець надві самки).
При пропорції 1:1 самка перебуває з одним самцем довагітності або впродовж трьох тижнів. Кожного ранку самкиоглядаються на предмет присутності сперми або вагінальних пробок.День 0 вагітності визначається як день, в який помічено вагінальнупробку або сперму.
Пари, які призначені до спарювання оцінюються на предметознак безпліддя.
Цей процес може включати в себе такі процедури як наданнядодаткових можливостей для спарювання з іншими затвердженимисамцями або самками, огляд під мікроскопом репродуктивних органіві дослідження тічкового циклу або сперматогенезу.
Розмір посліду
Тварини, що отримують дози речовини, впродовж дослідженняплодючості приводять послід в звичайному режимі і вирощуютьпотомство до припинення лактації без стандартизації посліду.
Після того, як стандартизацію здійснено, пропонуєтьсянаступна процедура. В проміжок часу між днем 1 та 4 післянародження розмір кожного посліду регулюється шляхом усуненнязайвих новонароджених особин - чотири самки і 4 чотири самці напослід.
Якщо кількість новонароджених самців і самок не складаєчотири особини кожної статі на послід, можливі незначні відхилення(наприклад, п'ять самців і три самки). Відхилення є неприйнятнимидля послідів, кількість новонароджених тварин в яких складає меншевосьми особин.
1.6.4. Огляди
Впродовж дослідного періоду кожна тварина піддається оглядупринаймні один раз на день. Відповідні зміни в поведінці, ознакиускладнень або затримки пологів, а також всі ознаки інтоксикації,включаючи смертність повинні бути зареєстровані. В період, щопередує спарюванню і в період спарювання обсяг споживання їжі можевимірюватись щодня. Після пологів і впродовж лактації визначенняобсягу їжі, що споживається (і визначення обсягу питної води, якщодослідна речовина подається з питною водою) здійснюється в деньзважування посліду. Самці і самки Р зважуються в перший деньпочатку дозування і потім щотижня. Ці огляди проводяться окремодля кожної дорослої тварини.
Період вагітності визначається з дня 0 вагітності. Кожнийпослід оглядається якнайшвидше після народження для визначеннякількості і статі новонароджених особин, кількостімертвонароджених особин, кількості живих новонароджених особин інаявності значних аномалій.
Мертві новонароджені особини і особини, які були вбиті вдень 4 зберігаються і досліджуються на предмет виявлення можливихдефектів. Живі новонароджені особини мають бути пораховані, апослід зважено на ранок після народження, в день 4 і 7, а потімщотижня до припинення досліду, коли тварини зважуються окремо.
Фізичні аномалії або аномалії в поведінці самок або потомствамають бути зареєстровані.
1.6.5. Патологія
1.6.5.1. Розтин
В час вбивання або смерті тварин впродовж досліду, тваринигенерації Р піддаються макроскопічному огляду на предмет виявленняструктурних аномалій або патологічних змін, при цьому особливуувагу необхідно приділити органам репродуктивної системи. Мертвіабо вмираючі новонароджені особини мають бути оглянуті на предметвиявлення дефектів.
1.6.5.2. Гістопатологія
Яєчники, матки, шийки маток, вагіни, яєчка, епідерміс,сім'яні міхури, простати, згортувальна залоза, гіпофіз і орган(органи)-мішені всіх тварин Р мають бути збережені длямікроскопічного дослідження. У випадку, якщо ці органи залишилисьне оглянутими в інших дослідах з повторним дозуванням, їхнеобхідно оглянути під мікроскопом в групах з високим дозуванням ів контрольний групі, також в окремих випадках необхідно оглянутиоргани тварин, що вмерли впродовж досліду.
Органи, тварин, у яких виявлено ознаки аномалій, мають бутиоглянуті у інших тварин Р. В цих випадках необхідно провестимікроскопічне дослідження всіх тканин, що виявляють ознаки значнихпатологічних змін. Як запропоновано в розділі, що описує процедуруспарювання, репродуктивні органи тварин, що за підозрою єбезплідними, піддаються мікроскопічному огляду.
2. ДАНІ
Дані можуть бути представлені у вигляді таблиці, в якійпредставляється загальна кількість тварин в кожній групі напочатку дослідження, кількість плідних тварин, кількість вагітнихсамок, типи змін і відсоток тварин, що виявляють кожен тип змін.
Якщо можливо, кількісні результати оцінюються відповіднимстатистичним методом. Може використовуватись будь-якийзагальноприйнятий статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступнуінформацію:
- породи/ штам, що використовувались,
- дані щодо реакції на токсичну речовину у відповідності достаті і дози, включаючи плодючість, вагітність і життєздатність,
- час смерті впродовж досліду або факт виживання тварин допланового умертвіння або до закінчення досліду,
- таблицю, що представляє вагу кожного посліду, середнєзначення ваги новонародженої особини і вага кожної тварини призакінченні досліду,
- токсичний або інший ефект на репродуктивні функції,потомства і постнатальне зростання,
- день виявлення кожного випадку аномалії і наступні дії,
- дані щодо ваги тіла тварин Р,
- результати розтину,
- детальний опис всіх мікроскопічних дослідів,
- статистичну обробку результатів, в необхідних випадках,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
В.35. ДОСЛІДЖЕННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ТОКСИЧНОСТІ
ДВОХ ГЕНЕРАЦІЙ
1. МЕТОД
Цей метод дослідження є копією OECD TG 416 (2001).
1.1. ВСТУП
Цей метод дослідження репродуктивної токсичності двохгенерацій призначений для того, щоб надати загальну інформаціющодо дії дослідної речовини на цілісність і функції жіночої ічоловічої репродуктивної системи, включаючи функції гонад,тічковий цикл, поведінку при спарюванні, зачаття, вагітність,пологи, лактацію, припинення лактації, ріст і розвиток потомства.Дослідження також може надати інформацію про ефект дослідноїречовини на смертність новонародженого потомства, смертність, атакож попередні дані про пренатальну і постнатальну інтоксикацію вперіод розвитку і служити посібником для подальших дослідів. Крімтого для дослідження росту і розвитку генерації F , цей метод
1
дослідження також призначений для оцінки цілісності і
функціональності чоловічої і жіночої репродуктивної систем, а
також розвитку генерації F . Для отримання подальшої інформації
2
про інтоксикацію в період розвитку і функціональну недостатність,
в протокол необхідно внести або додаткові сегменти дослідження, що
охоплюють методи інтоксикації в період розвитку і/або
нейротоксичності в період розвитку, Ці пункти також можуть бути
вивчені при інших дослідженнях, використовуючи відповідні методи
дослідження.
1.2. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідна речовина подається мірними дозами декільком групамсамців і самок. Самцям генерації Р доза надається впродовж періодузростання і впродовж принаймні одного циклу сперматогенезу(приблизно 56 днів у мишей і 70 днів у щурів), з метою викликаннярізноманітних негативних наслідків впливу дослідної речовини насперматогенез. Вплив на сперму визначається набором параметрів длясперми (наприклад, морфологія і рухомість сперми), припрепаруванні тканин і детальній гістопатології. Якщо дані просперматогенез отримані в результаті дослідження попередньогодозування впродовж відповідного періоду, наприклад, 90-деннедослідження самців генерації Р не повинно включатись дооцінювання. Якщо існують відповідні рекомендації, проби абочислові дані щодо сперми генерації Р зберігаються для подальшогооцінювання. Самки з генерації (Р) отримують дози принаймнівпродовж останніх двох тічкових циклів для виявлення шкідливоговпливу дослідної речовини на періодичність тічкового циклу.Дослідна речовина надається батьківським тваринам (Р) впродовж їхспарювання, вагітності, і в період припинення лактації потомстваF . При припиненні лактації дослідна речовина надається потомству
1
F впродовж періоду зростання до дорослого віку, спарювання і
1
народження генерації F до припинення лактації генерації F .
2 2
Клінічні і патологічні огляди здійснюються для всіх тварин напредмет виявлення ознак інтоксикації з наголосом на вплив націлісність і функціонування жіночої і чоловічої статевих систем,на зростання і розвиток потомства.
1.3. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.3.1. Вибір видів тварин
Для досліду бажано використовувати щурів. Якщовикористовуються інші види тварин, необхідно обґрунтувати їхвикористання з внесенням відповідних змін. Штами з низькоюплодючістю або відомі як такі, що мають високий відсоток дефектіврозвитку не можуть використовуватись в досліді. На початку дослідурозбіжність в вазі тварин повинна бути мінімальною і неперевищувати 20% середньої ваги тварин кожної статі.
1.3.2. Розміщення і умови харчування
Температура в дослідних приміщеннях, де здійснюєтьсягодування тварин, повинна складати 22 град.С (+- 3 град.). Хочавідносна вологість повинна складати принаймні 30% і бажано, щобвона не перевищувала 70% поза часом прибирання приміщення,необхідно слідкувати за тим, щоб її рівень знаходився в межах50-60%. Освітлення повинно бути штучним, з наступним циклом:12 годин-світло, 12 годин - темно. Для харчування використовуєтьсялабораторний корм з необмеженим доступом до питної води. Вибірдієти залежить від потреби забезпечити відповідний рівеньдослідної речовини, якщо вона подається цим способом.
Тварини розміщуються окремо або в клітках невеликими групами,що складаються з тварин тієї самої статі. Процедура спарюванняздійснюється в клітках, спеціально призначених для цієї мети.Після отримання підтвердження копуляції самки розміщуються вокремих клітках, призначених для пологів або годування потомства.Спарені тварини також можуть утримуватись малими групами і бутивідокремлені за статтю за один або два дня до пологів. Спаренихтварин необхідно забезпечити відповідним устілковим матеріалом принаближенні пологів.
1.3.3. Підготовка тварин
Необхідно використовувати здорових тварин, що пройшлиакліматизацію в лабораторних умовах впродовж щонайменш, п'яти дніві які не були предметом попередніх експериментальних процедур.Піддослідні тварини повинні бути охарактеризовані за породою,штамом, джерелом, статтю, вагою і/або віком. Потомство тих самихбатьків має бути виявлено, оскільки спарювання потомства тих самихбатьків дозволяється. Тварини вибираються випадково до контрольноїі дослідної груп (рекомендується стратифікація за вагою тіла).Клітки повинні бути облаштовані таким чином, щоб мінімізуватиможливий ефект, викликаний розташуванням клітки. Кожній твариніприсвоюється унікальний ідентифікаційний номер. Для генерації Р ценеобхідно зробити до початку дозування. Для генерації F це
1
необхідно зробити в період припинення лактації для тварин, яких
відібрано для спарювання. Записи з зазначенням вихідного посліду
ведуться для всіх вибраних тварин F . Крім того, рекомендується
1
здійснити індивідуальну ідентифікацію новонародженого потомства
якнайшвидше після народження, якщо до уваги приймаються результати
індивідуального зважування новонароджених тварин або
функціональних дослідів.
Вік батьківських тварин Р повинен складати від п'яти додев'яти тижнів на початку дозування. Тварини всіх дослідних групповинні, наскільки це можливо, бути однієї ваги і віку.
1.4. ПРОЦЕДУРА
1.4.1. Кількість і стать тварин
Кожна піддослідна і контрольна група повинна містити достатнюкількість тварин для того, щоб приблизно 20 вагітних самокнародили в день закінчення досліду або до нього. Для речовин, щовикликає небажаний ефект (наприклад, стерильність, надмірнуінтоксикацію при вживанні високих доз) це може бути неможливим.Метою є отримання найбільшої можливої кількості вагітностей дляоцінювання потенціалу речовини щодо впливу на плодючість,вагітність, материнську поведінку, лактацію, ріст і розвитокпотомства F1 від зачаття до зрілості і розвиток їхнього потомства(F2) до припинення лактації. Таким чином, неможливість отриматидостатню кількість вагітних тварин (тобто 20) необов'язково робитьрезультати досліду недійсними і така кількість час від часу єприйнятною.
1.4.2. Підготовка доз
Рекомендується, щоб дослідна речовина подавалась перорально(з їжею, питтям або через зонд) окрім випадків коли інший спосібприймання речовини (наприклад, термальний або інгаляційний)вважається більш прийнятним.
При необхідності дослідна речовина розчиняється абопідвішується у відповідному середовищі. Рекомендується заможливістю спочатку розглянути можливість використання водногорозчину/суспензії, потім олійного розчину/емульсії (наприклад, вкукурудзяній олії), а потім використання розчинів в іншихсередовищах. Для всіх середовищ, крім води, необхідно визначититоксичні характеристики. Необхідно визначити стабільністьдослідної речовини в умовах вживання.
1.4.3. Дозування
Використовуються принаймні три рівні доз з одночаснимпоточним контролем. Якщо нема обмежень, пов'язаних зфізико-хімічною природою або біологічним ефектом дослідноїречовини, найвищий рівень дози вибирається таким чином, щобвикликати інтоксикацію, але не смертність або значні страждання.
У випадку неочікувано-високого рівня смертності, досліди зрівнем смертності менше приблизно 10% батьківських тварин (Р)вважаються прийнятними. Зменшення дозування застосовується з метоюдемонстрації реакції, пов'язаної з дозуванням і рівня при якому неспостерігається шкідливих наслідків (NOAEL) при найнижчій дозі.Двократні або чотирикратні інтервали є оптимальними длявстановлення рівнів дозування, що знижуються, а введення четвертоїдослідної групи є часто необхідним при використанні дуже значнихінтервалів (наприклад, з коефіцієнтом більше 10) між дозуваннями.При вживанні дослідної речовини з їжею впродовж досліду інтервалміж дозами не повинен бути більшим за трьохкратний. Рівні дозобираються з урахуванням будь-яких наявних даних щодо токсичності,особливо результатів, отриманий після повторного вживаннядослідної речовини. До уваги також приймається будь-яка наявнаінформація щодо метаболізму або кінетики дослідної речовини абопов'язаних матеріалів. Ця інформація також є корисною длядемонстрації адекватності режиму дозування.
Паралельна контрольна група не приймає дослідної речовини абовикористовує середовище-носія, якщо для дозування дослідноїречовини використовується середовище-носій. Тварини в контрольнійгрупі знаходяться в однакових умовах дозування з тваринами вдослідній групі окрім приймання дослідної речовини. Групи, щопіддаються дії середовища-носія, отримують його в найбільшомуоб'ємі. Якщо дослідна речовина подається з їжею і викликаєзниження споживання або використання їжі, необхідно розглянутиможливість використання контрольної групи з однаковим раціономхарчування. Данні з контрольних дослідів, призначені для оцінкивпливу зниження споживання їжі на репродуктивні параметри можутьвикористовуватись замість даних, отриманих з вищезазначеноїконтрольної паралельної групи.
Наступні характеристики середовища-носія та інших добавокповинні розглядатись як відповідні: вплив на засвоюваність,розподіл, метаболізм, або утримання дослідної речовини; вплив нахімічні якості дослідної речовини, що можуть змінити її токсичніхарактеристики; і вплив на споживання їжі або води або харчовогостатусу тварин.
1.4.4. Дослід на граничний вміст
Якщо пероральний дослід при одному рівні доз, еквівалентному1 000 мг/кг маси тіла/день при прийманні речовини з їжею абоводою, еквівалентний відсоток їжі або питної води, щовикористовується при здійсненні процедур, описаних для цьогодосліду не викликає помітного токсичного ефекту ні у батьківськихтварин, ні у їхнього потомства і якщо наявність не очікується напідставі даних щодо структурно і/або метаболічно пов'язанихскладових, в проведенні повного дослідження декількох рівнів дознема необхідності. Дослід на граничний вміст застосовується завинятком ситуацій, коли небезпека для людей викликає потребузастосування вищого рівня дози. Для інших типів вживання дослідноїречовини, таких як інгаляція або дермальне проникнення,фізико-хімічні властивості дослідної речовини, такі якрозчинність, часто можуть визначати або обмежувати максимальнийрівень експозиції.
1.4.5. Приймання доз
Тваринам надаються дози дослідної речовини впродовж 7 днів натиждень. Пероральний шлях прийому дослідної речовини (з їжею,питною водою або через зонд) є бажаним. При використанні іншихшляхів прийому речовини необхідно надати відповідні обґрунтування,внесення певних змін може виявитись необхідним. Всім тваринамнадаються дози тим самим методом впродовж відповідногоекспериментального періоду. Якщо дослідна речовина подається череззонд, необхідно використовувати катетер. Об'єм води, що подаєтьсяза один раз, не повинен перевищувати 1 мл/100 г ваги тіла(0,4 мл/100 ваги тіла є максимальним об'ємом для кукурудзяногомасла), окрім випадків, використання водних розчинів, де можевикористовуватись об'єм 2 мл/100 г ваги тіла. Окрім випадків, девикористовуються речовини, що викликають подразнення або корозію,що призводить до загострень при високих концентраціях, необхідноуникати значних розбіжностей в об'ємі дослідної речовини завдякирегулюванню концентрації для забезпечення постійного об'єму привсіх рівнях дозування. При наданні дослідної речовини через зондновонароджені особини отримують дослідну речовину виключно внепрямий спосіб з молоком до тих пір, поки безпосереднє наданнядослідної речовини не почнеться після припинення лактації. Придослідах з наданням речовини з їжею або водою новонародженіособини безпосередньо додатково отримують дослідну речовину, коливони починають їсти самостійно впродовж останнього тижнялактаційного періоду.
Для речовин, що подаються з їжею або питною водою важливо,щоб об'єм дослідної речовини не порушував нормальний режимхарчування або водний баланс. Якщо дослідна речовина подається зїжею може використовуватись або постійна складова харчування(ppm), або постійний рівень дози у відповідності до ваги тілатварини; якщо використовуються альтернативні методи, необхіднонадати відповідні пояснення. Якщо речовина подається через зонд,доза повинна надаватись кожен день в той самий час і регулюватисьпринаймні щотижня для підтримання постійного рівня дози увідповідності до ваги тіла. При регулюванні рівня дози, щоприймається через зонд у відповідності до ваги тіла, необхідноврахувати інформацію, що стосується плацентного розподілу.
1.4.6. Графіки експериментів
Щоденне дозування батьківських самців і самок (Р) повиннопочинатись у віці від п'яти до дев'яти тижнів. Щоденне дозуваннясамців і самок F починається після припинення лактації; необхідно
1
взяти до уваги, що у випадках, коли дослідна речовина подається з
їжею або водою, безпосереднє піддавання новонародженого потомства
дії дослідної речовини може розпочатись впродовж періоду лактації.
Обидві статі (Р і F ) дозування триває принаймні 10 тижнів до
1
спарювання. Дозування продовжується для обох статей вподовж двох
тижнів періоду спарювання. Самці безболісно умертвляються і
досліджуються, якщо вони більше не потрібні для оцінювання
репродуктивних ефектів. Для батьківських самок (Р) дозування має
тривати впродовж періоду вагітності і до припинення лактації
потомства F . Необхідно звернути увагу на зміну графіку дозування
1
на підставі наявної інформації щодо дослідної речовини, включаючи
дані щодо токсичності, метаболізму або біо-акумуляції. Доза для
кожної тварини призначається на підставі останньої інформації щодо
ваги тіла кожної тварини. Однак, при регулюванні доз впродовж
останнього триместру вагітності необхідно бути обережним.
Піддавання дії дослідної речовини самців і самок Р і F 1повинно тривати до закінчення досліду. Дорослі особини чоловічої іжіночої статі Р і F безболісно вбиваються. Якщо вони більше не
1
потрібні для оцінки репродуктивного ефекту. Потомство F , що не
1
вибрано для спарювання і все потомство F безболісно вбивається
2
після припинення лактації.
1.4.7. Процес спарювання
1.4.7.1. Батьківське спарювання (Р)
При кожному спарюванні кожна самка перебуває з одним самцем,що отримує той самий рівень дозування (спарювання в пропорції 1:1)до спарювання впродовж трьох тижнів. Кожного дня самки оглядаютьсяна предмет присутності сперми або вагінальних пробок. День 0вагітності визначається як день, в який помічено вагінальну пробкуабо сперму. У випадку, коли спарювання є неуспішним, необхіднорозглянути можливість повторного спарювання самок з перевіренимисамцями тієї самої групи. Дані зі спарювання пар мають бутидокладно ідентифіковані. Слід уникати спарювання потомства тихсамих батьків.
1.4.7.2. Спарювання F1
Для спарювання потомства F1 в період припинення лактаціївибирається, принаймні один самець і одна самка з кожного послідудля спарювання з іншими новонародженими особинами іншого посліду,що піддавались дії такої самої дози для народження генерації F2.Відбір новонароджених особин з кожного посліду необхідноздійснювати неупереджено, слідкуючи за тим, щоб не було значноїрозбіжності в вазі тіла або в зовнішності між парами посліду. Увипадку виявлення таких розбіжностей вибираються найкращіпредставники кожного посліду. Досвід показує, що відбір необхідноздійснювати на підставі ваги тіла але в деяких випадках відбір зазовнішністю може виявитись більш доцільним. Спарювання потомстваF1 не повинно відбуватись до досягнення повної статевої зрілості.
Пери без потомства мають бути оглянуті на предмет виявленняочевидних ознак безпліддя. Цей процес може включати в себе такіпроцедури як додаткове спарювання з іншими перевіреними самцямиабо самками, дослідження під мікроскопом репродуктивних органів,дослідження менструального циклу або сперматогенезу.
1.4.7.3. Друге спарювання
В деяких випадках, таких як зміна кількості посліду,пов'язана з вживанням речовини, або виявлення неоднозначногоефекту при першому спарюванні, рекомендується провести повторнеспарювання дорослих особин Р або F1 для народження другогопосліду. Рекомендується провести повторне спарювання самок абосамців, що не народжували потомства з перевіреними особинамипротилежної статі. Якщо народження другого посліду вважаєтьсянеобхідним в усіх генераціях, тварини повинні пройти повторнеспарювання приблизно через тиждень після припинення лактаціїостаннього посліду.
1.4.7.4. Розмір посліду
Тваринам надається можливість народити послід в нормальнихумовах і доглядати за ним до припинення лактації. Стандартизаціярозміру посліду не є обов'язковою. Якщо виконуєтьсястандартизація, метод, що використовується повинен бути детальноописаний.
1.5. ОГЛЯДИ
1.5.1. Клінічні огляди
Загальні клінічні огляди проводяться щодня, а у випадку, колидослідна речовина подається через зонд, при визначенні часу подачіхімічної речовини необхідно приймати до уваги очікуваний піковийперіод ефектів після дозування. Зміни в поведінці, ознакиускладнених або затриманих пологів, а також всі ознакиінтоксикації повинні бути зареєстровані. Додатковий, більшдетальний огляд кожної тварини проводиться, принаймні, щотижня,цей огляд може проводитись в час зважування тварин. Два рази надень, а у вихідні - один раз на день, якщо це необхідно, всітварини оглядаються на предмет клінічних проявів і смертності.
