забезпеченням оптимальних умов для росту клітин під час періоду
експресії та здатності формувати колонії як мутантних, так і не
мутантних клітин.
1.4.1.3. Підготовка культур
Клітини розводяться з вихідної культури, висіваються вкультуральне середовище та вирощуються при 37 град.C. Передпроведенням тесту культури можуть потребувати очищення від ранішеіснуючих мутантних клітин.
1.4.1.4. Метаболічна активація
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини якв присутності відповідної системи метаболічної активації, так і заїї відсутності. Найчастіше використовується система доповненоїкоферментами пост-мітохондріальної фракції (S9), приготованої зпечінок гризунів, оброблених ензимами, включаючи такі агенти, якАрохлор-1254 (15)(16)(17)(18) або суміш фенобарбіталу танафтофлавону (19)(20).
Пост-мітохондріальна фракція, зазвичай, використовується вконцентраціях в діапазоні від 1-10% в об'ємному співвідношенні вкінцевому піддослідному середовищі. Вибір та стан системиметаболічної активації можуть залежати від класу хімічних речовин,що випробовуються. В деяких випадках може бути доцільнимвикористання більш ніж однієї концентрації пост-мітохондріальноїфракції.
Кількість подій, включаючи створення ліній клітин, щоекспресують специфічні аміноацил-РНК-синтетази, за допомогоюгенної інженерії, може надати потенціал для ендогенної активації.Вибір ліній клітин для використання має бути науково виправданим(наприклад, відповідністю цитохрому P450 ізоензиму для метаболізмудосліджуваної речовини).
1.4.1.5. Досліджувана речовина/Підготовка
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або довести достану суспензії за допомогою відповідного розчинника абосередовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкоюклітин. Рідкі досліджувані речовини можна додавати безпосередньодо досліджуваних систем та/або розбавити перед введенням. Слідзастосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тількидані щодо стабільності не виявляють прийнятності зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище:
Не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовищаз досліджуваною речовиною, вони також повинні бути придатними длявиживання клітин і сумісними з діяльністю S9. Якщовикористовується не добре відомий розчинник/середовище, їхвключення має підтверджуватись даними, що доводять їхнюсумісність. Рекомендується там, де можливо, використовуватиспочатку водний розчинник/середовище. При тестуванні речовин,нестабільних при взаємодії з водою, використовувані органічнірозчинники не мають містити води. Воду можна усунути шляхомдодавання молекулярного сита.
1.4.2.2. Концентрація для впливу
При визначенні найвищої концентрації слід розглянути такікритерії, як цитотоксичність, розчинність в досліджуваних системахта зміни pH або осмотичного тиску.
Цитотоксичність потрібно визначати в присутності та завідсутності метаболічної активації в ході основного експерименту,використовуючи відповідний показник цілісності та росту клітин,такий, як відносна ефективність клонування (життєздатність) абовідносний показник загального росту. Можливо, буде кориснимвизначення цитотоксичності та розчинності в ході підготовчогоексперименту.
Потрібно використати щонайменше чотири концентрації,придатних до аналізування. У випадку цитотоксичності триконцентрації повинні покривати діапазон від максимальної донезначної або відсутньої токсичності; це зазвичай означає, щорівні концентрації мають бути відділені більше, ніж фактором між2 та Кк 10. Якщо максимальна концентрація визначається на основіцитотоксичності, вона має складати приблизно 10-20% (але не менше10%) відносної життєздатності (відносної ефективності клонування)або відносного показника загального росту. Для відносно нецитотоксичних речовин максимальна концентрація для проведеннятесту має становити 5 мг/мл, 5 мю л/мл або 0,01 Моль, яка єнайнижчою.
Відносно нерозчинні речовини слід випробовувати до їх межірозчинності, використовуючи відповідні умови для культур. Доказинерозчинності мають визначатися в останньому досліджуваномусередовищі, в якому клітини піддавали впливу. Може бути кориснооцінити розчинність на початку і в кінці тестування, тому щорозчинність може змінюватися протягом періоду впливу вдосліджуваній системі завдяки присутності клітин, S9, сироватки, іт.д. Нерозчинність можна визначити неозброєним оком. Осад неповинен змінювати результати оцінювання.
1.4.2.3. Контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (зарозчинником або середовищем), як з метаболічною активацією, так ібез неї, мають входити до складу кожного експерименту. Привикористанні метаболічної активації хімічна речовина, щовикористовується для позитивної контрольної групи, має бути такою,що вимагає активації для мутагенної реакції.
До речовин для позитивного контролю належать:
------------------------------------------------------------------
| Умови для | Локус | Речовина | Номер | Номер |
|метаболічної| | | РСХ | ЄРІКХР |
| активації | | | | |
|------------+---------+--------------------+---------+----------|
|Відсутність |ГГФТ |Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7|
|екзогенної | |--------------------+---------+----------|
|метаболічної| |Етилннитрозосечовина|759-73-9 | 212-072-2|
|активації |---------+--------------------+---------+----------|
| |ТК |Метилметансульфонат | 66-27-3 | 200-625-0|
| |(маленькі| | | |
| |та великі| | | |
| |колонії) | | | |
| |---------+--------------------+---------+----------|
| |КГФТ |Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7|
| | |--------------------+---------+----------|
| | |Етилннитрозосечовина|759-73-9 | 212-072-2|
|------------+---------+--------------------+---------+----------|
|Присутність |ГГФТ |3-метилхолантрен | 56-49-5 | 200-276-4|
|екзогенної | |--------------------+---------+----------|
|метаболічної| |N-нітрозодиметиламін| 62-75-9 | 200-549-8|
|активації | |--------------------+---------+----------|
| | |7,12- | 57-97-6 | 200-359-5|
| | |диметилбензантрацен | | |
| |---------+--------------------+---------+----------|
| |ТК |Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-015-4|
| |(маленькі|--------------------+---------+----------|
| |та великі|Циклофосфаміду |6055-19-2| |
| |колонії) |моногідрат | | |
| | |--------------------+---------+----------|
| | |Бензо(альфа)пірен | 50-32-8 | 200-028-5|
| | |--------------------+---------+----------|
| | |3-метилхолантрен | 56-49-5 | 200-276-5|
| |---------+--------------------+---------+----------|
| | КГФТ |N-нітрозодиметиламін| 62-75-9 | 200-549-8|
| | |(для високих рівнів | | |
| | |S-9) | | |
| | |--------------------+---------+----------|
| | |Бензо(альфа)пірен | 50-32-8 | 200-028-5|
------------------------------------------------------------------
Можна використати інші відповідні еталонні речовини дляпозитивного контролю, якщо, наприклад, в лабораторії є історичнабаза даних з 5-бромо-2'-дезоксиуридину (номер РСХ 59-14-3, номерЄРІКХР 200-415-9), ця еталонна речовина також може бутивикористана. За наявності може розглядатись застосування хімічноїречовини, що використовується для позитивного контролю з огляду наклас.
Негативна контрольна група, що складається окремо зрозчинника або середовища у досліджуваному середовищі, якомувводяться ті ж речовини, що і досліджуваним групам, також має бутивключена. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалися впливудосліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщо немаєісторично встановлених даних з контролю, що показують відсутністьшкідливих та мутагенних впливів обраного розчинника.
1.4.3. Процедура
1.4.3.1. Введення досліджуваної речовини
Клітини, що розростаються, потрібно піддати впливудосліджуваної речовини як за участю, так і без метаболічноїактивації. Дія речовини має тривати відповідний період часу(зазвичай, ефективним є період від трьох до шести годин). Періоддії можна подовжити на один або більше клітинних циклів.
При кожній випробуваній концентрації можуть використовуватисьяк подвійні, так і одиночні культури. При використанні одиночнихкультур кількість використовуваних концентрацій слід збільшити зметою забезпечення достатньої кількості культур для аналізу(наприклад, принаймні вісім концентрацій, придатних доаналізування). Слід використовувати подвійні культури длянегативного (за розчинником) контролю.
Газоподібні та летючі речовини випробовуються за допомогоювідповідних методів, таких як запечатані ємкості длякультур (21)(22).
1.4.3.2. Вимірювання частоти виживання, мутацій тажиттєздатності
По закінченні періоду впливу клітини змивають та вирощують зметою визначення частоти виживання та визначення вираженнямутантного фенотипу. Вимірювання цитотоксичності за допомогоювизначення відносної ефективності клонування (життєздатності) абовідносного показника загального росту культур, зазвичай, починаютьпо закінченні періоду дослідження.
Кожний локус має визначені мінімальні часові вимоги длянаближеного до оптимального вираження фенотипу новоутворенихмутантів (ГГФТ та КГФТ вимагають щонайменше 6-8 днів, а ТК -щонайменше 2 дні). Клітини вирощують у середовищі як ізселективним реагентом (реагентами), так і без нього (них) з метоювизначення кількості мутантів та ефективності клонування,відповідно. Вимірювання життєздатності (що використовується дляпідрахунку частоти мутацій) починається по закінченні періодувираження; для цього клітини поміщають в чашку з неселективнимсередовищем.
Якщо досліджувана речовина дає позитивну реакцію у тестуванніна L5178Y TK+/-, потрібно провести калібрування колоній принаймніщодо однієї з досліджуваних культур (в найвищій позитивнійконцентрації) та в негативній та позитивній контрольних групах.Якщо досліджувана речовина дає негативну реакцію у тестуванні наL5178Y TK+/-, потрібно провести калібрування колоній в негативнійта позитивній контрольних групах. У дослідженнях з використаннямTK6TK+/- також можна використовувати калібрування колоній.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Дані повинні включати визначення цитотоксичності тажиттєздатності, підрахунки колоній та частоти мутацій длядосліджуваних та контрольних культур. Якщо досліджувана речовинадає позитивну реакцію у тестуванні на L5178Y TK+/-, колоніїоцінюють, використовуючи критерії малих та великих колоній напринаймні одній концентрації досліджуваної речовини (в найвищійпозитивній концентрації) та на негативній та позитивнійконтрольних групах. Молекулярну та цитогенетичну природу мутантівяк у малих, так і у великих колоніях, було детальнодосліджено (23)(24). У тестуванні на TK+/-колонії оцінюють,використовуючи критерії колоній з нормальним ростом (великих) та зповільним ростом (малих). Для мутантних клітин, що зазналиусебічних генетичних пошкоджень, час подвоєння збільшується і,таким чином, відбувається формування малих колоній. Ціпошкодження, зазвичай, знаходиться у проміжку від повних генних довидимих у каріотипах хромосомних аберацій. Провокування появимутантів малих колоній було пов'язано з хімічними речовинами, яківикликають значні хромосомні аберації (26). Менш ураженіклітини-мутанти доростають до розмірів материнських клітин іформують великі колонії.
Слід надати дані про життєздатність (відносну ефективністьклонування) або відносний показник загального росту. Частотамутацій повинна виражатись у вигляді кількості клітин-мутантів повідношенню до кількості клітин, що вижили.
Потрібні індивідуальні дані. Також всі дані повинні бутипідсумовані у формі таблиці.
Немає вимог щодо перевірки чіткої позитивної реакції.Сумнівні результати мають перевірятися шляхом проведення подальшихдосліджень, переважно з використанням модифікаціїекспериментальних умов. Негативні результати потрібнопідтверджувати в окремих випадках. У випадках, коли підтвердженнянегативних результатів не вважається необхідним, потрібно навестиобґрунтування. Модифікація параметрів дослідження з метоюрозширення діапазону оцінюваних умов буде розглядатися в подальшихекспериментах як з сумнівним, так і з негативним результатом.Параметри дослідження, що можуть бути модифіковані, включають всебе просторовий розподіл концентрації та умови метаболічноїактивації.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,такі як збільшення, пов'язане з концентрацією, або відтворюванезбільшення частоти мутацій. Перш за все необхідно враховуватибіологічну релевантність результатів. Можливе використаннястатистичних методів в якості допоміжних при оцінюваннірезультатів тестування. Статистична значимість не має бути єдинимфактором, що визначає позитивну реакцію.
Досліджувана речовина, результати тестування якої невідповідають вищезазначеним критеріям, вважається немутагенною вцій системі.
Хоча більшість досліджень дає чітко позитивні або негативнірезультати, в поодиноких випадках сукупність даних виключаєможливість визначеного судження про активність досліджуваноїречовини. Результати можуть залишатись сумнівними абопроблематичними, не зважаючи на кількість повторень експерименту.
Позитивні результати тесту in vitro на генну мутацію клітинссавців означають, що досліджувана речовина викликає генні мутаціїу використаних для тестування культивованих клітинах ссавців.Позитивна відтворювана реакція на концентрацію є більш значущою.Негативні результати означають, що в умовах тестуваннядосліджувана речовина не викликає генних мутацій у використанихдля тестування культивованих клітинах ссавців.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості, звіт про проведення тестування має міститинаступну інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору середовища/розчинника,
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини врозчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Клітини:
- тип і джерело клітин,
- кількість клітинних культур,
- кількість клітинних пасажів, у випадку застосування,
- метод збереження культури клітин, у випадку застосування,
- відсутність мікоплазми.
Умови тестування:
- обґрунтування для вибору концентрацій і кількості культур,включаючи, наприклад, дані про цитотоксичність та обмеження щодорозчинності, якщо вони є доступними,
- склад середовища, концентрація CO ,
2
- концентрація досліджуваної речовини,
- об'єм середовища і доданої досліджуваної речовини,
- температура вирощування,
- час вирощування,
- тривалість дії речовини,
- щільність клітин під час дії речовини,
- тип і склад системи метаболічної активації, включаючиприйнятності,
- позитивні та негативні контрольні групи,
- тривалість періоду вираження (включаючи кількість висіянихклітин, субкультур та графіки федінгу, якщо це є доцільним),
- селективні реагенти,
- критерії віднесення тестування до позитивного, негативного,або сумнівного розряду,
- методи, використані для рахування кількості життєздатнихклітин та клітин-мутантів,
- визначення колоній, розмір і тип яких розглядалися(включаючи визначення "малих" та "великих" колоній, якщо це єдоцільним).
Результати:
- ознаки токсичності,
- ознаки преципітації,
- дані про pH та осмотичний тиск впродовж періоду введеннядосліджуваної речовини, якщо визначено,
- розмір колонії, якщо він оцінювався, принаймні длянегативної та позитивної контрольних груп,
- компетентність лабораторії для визначення мутантів малихколоній за допомогою системи L5178Y TK+/-, де це доцільно,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз, якщо він має місце,
- паралельні дані позитивних та негативних контрольних груп(розчинник або середовище),
- історично встановлені дані позитивних та негативнихконтрольних груп (розчинник або середовище), з діапазонами,середніми показниками та стандартними відхиленнями,
- частота мутацій.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall,K.R. (Eds.), (1987) Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis,Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
(2) Chu, E.H.Y. and Malling, H.V., (1968) Mammalian CellGenetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations inChinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61,p. 1306-1312.
(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G., (1982) Mutation Assay atthe Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. MutationRes., 94, p. 467-485.
(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. andDearfield, K.L., (1989) Differential Mutant Quantitation at theMouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, p. 394-403.
(5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F., (1989) Comparison ofthe AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six DrugCandidates. Mutation Res., 223, p. 121-128.
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M.,Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E.,(1994) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report.Report of the International Workshop on Standardisation ofGenotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, p. 235-239.
(7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.,Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity UnderExtreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9.Mutation Res., 257, p. 147-204.
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. andMavournin, K.H., (1983) Specific Gene Mutations in L5178Y Cells inCulture. A Report of the U.S. Environmental Protection AgencyGene-Tox Program. Mutation Res., 115, p. 225-251.
(9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S.,(1988) A Review and Analysis of the Chinese HamsterOvary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System toDetermine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of PhaseIII of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program.Mutation Res., 196, p. 17-36.
(10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta,R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski,L.F.Jr. and Yang, L.L., (1987) A Guide for the Performance of theChinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine PhosphoribosylTransferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, p. 135-141.
(11) Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B., (1989) AComparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in HumanLymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to anAdditional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. MutationRes., 216, p. 9-17.
(12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W.,(1986) Quantitative and Molecular Analyses of EthylMethanosulphonate-and ICR 191-Induced Molecular Analyses of EthylMethanosulphonate-and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells.Mutation Res., 160, p. 133-147.
(13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D., (1984)Procedures for the L5178Y/TK+/- - TK+/- Mouse Lymphoma CellMutagenicity Assay. В: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook ofMutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, NewYork, p. 239-268.
(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L.,Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C., (1989) Mammalian CellGene Mutation Assays Based upon Colony Formation. В: StatisticalEvaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed.,Cambridge University Press, p. 66-101.
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R.,Loprieno, N. and Mazzaccaro, A., (1977) Induction of6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells byMouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. MutationRes., 46, p. 365-373.
(16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methodsfor Detecting Carcinogens and Mutagens with theSalmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res.,31, p. 347-364.
(17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G.and Brown M.M.M., (1979) Validation and Characterisation of theL5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59,p. 61-108.
(18) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods forthe Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.
(19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse,D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992)Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro GenotoxicityAssays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T.,(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as anInducer of Metabolic Activation Systems. В: In vitro MetabolicActivation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R.,Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland,p. 85-88.
(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982)CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and VolatileLiquids. В: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds).Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91-103.
(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L.,(1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown onCollagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in theCHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5,p. 795-801.
(23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A.and Hozier, J.C., (1990) Molecular Dissection of Mutations at theHeterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 51-55.
(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E.,Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J., (1985) Analysis ofTrifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- MouseLymphoma Cells. Mutation Res., 151, p. 161-174.
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B., (1990)Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at aHeterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229,p. 89-102.
(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L., (1990) Comparison ofChromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-DeficientMutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells.Mutagenesis, 5, p. 609-614.
B.18. ПОШКОДЖЕННЯ ТА РЕПАРАЦІЯ ДНК - НЕРЕПАРТИВНИЙ
СИНТЕЗ ДНК - КЛІТИНИ ССАВЦІВ IN VITRO
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Тест на нерепаративний синтез ДНК (НСД) визначає синтезрепарації ДНК після ексцизії та усунення ділянки ДНК, що міститьзону з пошкодженням, спричиненим хімічними та фізичними агентами.Тест ґрунтується на введенні тимідину, міченого тритієм (3H-TdR),в ДНК клітин ссавців, які знаходяться не в S-фазі клітинногоциклу. Поглинання 3H-TdR може визначатись за допомогоюавторадіографії або сцинтиляційного рахунку (СР) ДНК, взятої зклітин, що піддавалися дії речовини. Клітини ссавців у культурі,якщо тільки вони не є первинними гепатоцитами щурів, піддаютьсядії випробуваних агентів як в присутності екзогенної системиметаболічної активації, так і за її відсутності. НСД також можевимірюватись в системах in vivo.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Досліджувані хімічні речовини та контрольні або еталонніречовини потрібно готувати в середовищі росту, розчинити абоусунути за допомогою відповідного середовища, а потім розбавити усередовищі росту для використання в процесі аналізу. Остаточнаконцентрація середовища не повинна впливати на життєздатністьклітин.
Первинні культури гепатоцитів щурів, лімфоцитів людини абоусталених ліній клітин (наприклад, диплоїдних фібробластів людини)можуть використовуватись для аналізу.
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічноїречовини як в присутності відповідної системи метаболічноїактивації, так і за її відсутності.
Умови тестування:
Кількість клітин
Для кожної експериментальної точки необхідні принаймні двіклітинні культури для визначення НСД за допомогою авторадіографіїі шість (або менше, якщо це є науково виправданим) - за допомогоюСР.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (безпіддавання впливу досліджуваної речовини/або за середовищем), як зметаболічною активацією, так і без неї, мають входити до складукожного експерименту.
Приклади позитивного контролю для аналізу гепатоцитів щуріввключають 7,12-диметилбензатрацен (7,12-ДМБА) або2-ацетиламінофлуорен (2-ААФ). Випадок використання усталених лінійклітин 4-нітроквінолін-N-оксид (4-НКО) є прикладом для позитивногоконтролю як для авторадіографічного, так і для СР-аналізу, щопроводиться без метаболічної активації; N-диметилнітрозамін єприкладом сполуки для позитивного контролю за умови використаннясистем метаболічної активації.
Концентрація для впливу
Потрібно використовувати різні концентрації досліджуваноїречовини у відповідному діапазоні, що дозволяє визначити реакцію.Найвища концентрація може викликати певні цитотоксичні ефекти.Відносно нерозчинні в воді сполуки потрібно тестувати до їх межірозчинності. Для нетоксичних хімічних речовин, що вільнорозчиняються у воді, найвища досліджувана концентраціявизначається для кожного окремого випадку.
Клітини
Для підтримання культур потрібно використовувати відповіднесередовище росту, концентрацію CO , температуру і вологість.
2
Усталені лінії клітин потрібно періодично перевіряти на зараження
мікоплазмою.
Метаболічна активація
Система метаболічної активації не використовується зпервинними культурами гепатоцитів. Усталені лінії клітин талімфоцити повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини як вприсутності відповідної системи метаболічної активації, так і заїї відсутності.
Процедура
Підготовка культур
Усталені лінії клітин генеруються з вихідних культур(наприклад, шляхом трипсинізації або відриву), що висіваються вємкості для культур за відповідної щільності та інкубуються притемпературі 37 град.C.
Короткострокові культури гепатоцитів щурів створюються задопомогою способу, що дозволяє щойно розчиненим у відповідномусередовищі гепатоцитам приєднуватись до поверхні, що росте.
Культури лімфоцитів людини готують шляхом використаннявідповідних технік.
Піддавання культур дії досліджуваної речовини
Первинні гепатоцити щурів
Щойно ізольовані гепатоцити щурів піддають дії досліджуваноїречовини в середовищі, що стримує 3H-TdR на певний період часу.Наприкінці періоду введення речовини середовище виливається зємкості, де знаходяться клітини, які потім промивають, фіксують тависушують. Мікроскопічні препарати потрібно занурити уавторадіографічну емульсію (можна використати як альтернативуплівку зі зйомною емульсією), піддати впливу речовини, проявити,зафарбувати та підрахувати.
Усталені лінії клітин і лімфоцити
Техніки авторадіографії: клітинні культури піддають впливудосліджуваної речовини впродовж певного періоду, після чого їхпіддають дії 3H-TdR. Час визначається, виходячи з природиречовини, активності систем метаболізму та типу клітин. Щобвизначити пік НСД, слід додати 3H-TdR або одночасно здосліджуваною речовиною, або через кілька хвилин після введеннядосліджуваної речовини. На вибір між цими двома процедурами можутьвпливати можливі взаємодії між досліджуваною речовиною та 3H-TdR.Для визначення різниці між НСД та напівконсервативною реплікацієюДНК, останню слід інгібітувати, наприклад, шляхом використанняаргінін-недостатнього середовища, низького вмісту сироватки абогідроксикарбаміду в культуральному середовищі.
Ср-вимірювання НСД: перед введенням досліджуваної речовинивходження клітин в S-фазу слід блокувати, як описано вище; потімклітини слід піддати впливу досліджуваних хімічних речовин, якописано в процедурі для авторадіографії. Наприкінці інкубаційногоперіоду ДНК потрібно вилучити з клітин і визначити загальний вмістДНК та об'єм 3H-TdR з визначеною інкорпорацією.
Слід зазначити, що, коли у вищезазначених технікахвикористовуються лімфоцити людини, пригнічення напівконсервативноїреплікації ДНК не є необхідним для культур, які не було підданостимуляції.
Аналіз
Авторадіографічні визначення
Про визначенні НСД в клітинах культури ядра S-фази непідраховуються. Потрібно підрахувати щонайменше 50 клітин наконцентрацію. Мікроскопічні препарати перед підрахунком слідзакодувати. На кожному мікроскопічному препараті потрібнообрахувати декілька віддалених випадкових полів. Кількістьінкорпорацій 3H-TdR в цитоплазму повинна визначатись шляхомобрахування трьох зон ядра певних розмірів в цитоплазмі кожноїобрахованої клітини.
Визначення СР
Для кожної концентрації і в контрольних групах для визначенняСР методом НСД слід використовувати достатню кількість культур.
Всі результати потрібно підтверджувати шляхом незалежногоексперименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці.
2.1. АВТОРАДІОГРАФІЧНІ ВИЗНАЧЕННЯ
Об'єм 3H-TdR в цитоплазмі та кількість гранул, знайдених наклітинному ядрі, повинні фіксуватись окремо.
Для описання розподілу об'єму 3H-TdR в цитоплазмі такількості гранул на ядро можливе використання середньогопоказника, медіани та моди.
2.2. ВИЗНАЧЕННЯ СР
Для визначень СР інкорпорація 3H-TdR має вноситись до звіту,як кількість розпадків на хвилину/мг ДНК. Середня кількістьрозпадків на хвилину/мг ДНК зі стандартним відхиленням можевикористовуватись для опису розподілу інкорпорації.
Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичнийметод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має міститинаступну інформацію:
- клітини, що використовувались, щільність та кількістьпасажів за час дії речовини, кількість клітинних культур,
- методи, що використовувались для збереження клітиннихкультур, включаючи середовище, температуру і концентрацію CO ,
2
- досліджувану речовину, середовище, концентрації таобґрунтування для вибору концентрацій, використаних для аналізу,
- детальний опис систем метаболічної активації,
- графік введення,
- позитивні та негативні контрольні групи,
- техніки авторадіографії, що використовувались,
- процедури, що використовувались для блокування входженняклітин в S-фазу,
- процедури, що використовувались для вилучення ДНК тавизначення загального вмісту ДНК у межах визначення СР,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичну оцінку,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
B.19. АНАЛІЗ ОБМІНУ СЕСТРИНСЬКИМИ
ХРОМАТИДАМИ IN VITRO
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Аналіз обміну сестринськими хроматидами (ОСХ) єкороткостроковим дослідженням на визначення взаємних обмінів ДНКміж двома сестринськими хроматидами хромосоми, що знаходяться упроцесі дуплікації. ОСХ являють собою взаємний обмін продуктамиреплікації ДНК на ймовірно гомологічних локусах. Процес обміну,ймовірно, включає в себе розрив і возз'єднання ДНК, хоча промолекулярну основу цих процесів є мало відомостей. Виявлення ОСХвимагає деяких середніх значень для сестринських хроматид, якимнадаються окремі етикетки, що може досягатися інкорпорацієюбромдезоксиуридину (БДУ) в хромосомну ДНК для двох клітиннихциклів.
Клітини ссавців in vitro піддаються впливу досліджуваноїхімічної речовини як з екзогенною системою метаболічної активаціїу ссавців, так і без неї, якщо це є доцільним, і вирощуютьсякультури за два цикли реплікації в середовищі, що містить БДУ.Після піддавання дії інгібітору веретена (наприклад, колхіцину)для накопичення клітин у метафазоподібній стадії мітозу(с-метафазі) клітини збирають і роблять хромосомні препарати.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
- Первинні культури (лімфоцити людини) або усталені лініїклітин (наприклад, клітини яєчників китайського хом'яка) можутьвикористовуватись для аналізу. Лінії клітин потрібно перевіряти назараження мікоплазмою.
- потрібно використовувати відповідне середовище та умовивирощування (наприклад, температуру, ємкості для культур,концентрацію CO і вологість).
2
- досліджувані речовини можуть бути приготовані укультуральному середовищі, розчинені або доведені до станусуспензії у відповідних середовищах перед обробкою клітин.Остаточна концентрація середовища в культуральній системі неповинна відчутно впливати на життєздатність клітин та їх рівеньросту, а впливи на частоту ОСХ можна відслідковувати за допомогоюконтролю розчинника.
- клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної речовинияк в присутності екзогенної системи метаболічної активації уссавців, так і за її відсутності. Як альтернатива, там, девикористовуються типи клітин із внутрішньою метаболічноюактивністю, рівень та природа активності має відповідатидосліджуваному класу хімічних речовин.
1.6.2. Умови тестування:
Кількість клітин
Для кожної експериментальної точки потрібно використовуватищонайменше подвійні культури.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Позитивні контрольні групи з використанням як сполуки прямоїдії, так і сполуки, що вимагає метаболічної активації, повиннібути включені у кожний експеримент, також потрібно проводитиконтроль за середовищем.
Нижче наведено приклади речовин, що можуть використовуватисядля позитивного контролю:
- сполука прямої дії:
- етилметансульфонат,
- сполука непрямої дії:
- циклофосфамід.
Якщо це є доцільним, можливе включення додатковогопозитивного контролю для того самого хімічного класу, що й хімічнаречовина, що тестується.
Концентрація для впливу
Потрібно використовувати щонайменше три концентраціїдосліджуваної речовини з адекватними проміжками між ними. Найвищаконцентрація повинна обумовити значний токсичний вплив, але не маєвпливати на адекватність реплікації клітин. Відносно нерозчинні вводі речовини слід тестувати до межі розчинності з використаннямвідповідних процедур. Для нетоксичних речовин, що вільнорозчиняються у воді, найвища концентрація досліджуваної речовинивизначається для кожного окремого випадку.
1.6.3. Процедура
Підготовка культур
Усталені лінії клітин генеруються з вихідних культур(наприклад, шляхом трипсинізації або відриву), що висіваються вємкості для культур за відповідної щільності та інкубуються притемпературі 37 град.C. Для моношарових культур кількість клітин наємкість слід відрегулювати таким чином, щоб культури зливалися ненабагато більше, ніж на 50% на час збору. В якості альтернативи,клітини можуть використовуватись у суспензійній культурі. Культурилімфоцитів людини готують шляхом застосування відповідних технікта вирощуються при температурі 37 град.C.
Піддавання дії речовини
Клітини в експоненціальній фазі росту піддають впливудосліджуваної речовини на відповідний період часу; в більшостівипадків ефективність досягається за 1-2 години, але у певнихвипадках період дії можна подовжити до двох повних клітиннихциклів. Клітини з достатньою внутрішньою метаболічною активністюповинні піддаватись впливу досліджуваної хімічної речовини як вприсутності відповідної системи метаболічної активації, так і заїї відсутності. По закінченні періоду впливу з клітин змиваютьдосліджувану речовину та вирощують культури за два циклиреплікації за наявності БДУ. В якості альтернативної процедури,клітини можна одночасно піддавати впливу досліджуваної хімічноїречовини та БДУ на повний період вирощування культури, що складаєдва клітинних цикли.
Культури лімфоцитів людини піддають дії речовини, коли вонизнаходяться в напівсинхронному стані.
Клітини аналізують на етапі другого поділу після діїречовини, щоб переконатись, що найбільш чутливі стадії клітинногоциклу було піддано впливу хімічної речовини. З усіма культурами,до яких додається БДУ, слід працювати в темряві або при тьмяномусвітлі від ламп розжарювання до моменту збору клітин з метоюмінімізації фотолізу ДНК, що містить БДУ.
Збір клітин
Клітинні культури піддають дії інгібітору веретена(наприклад, колхіцину) впродовж часу від 1 до 4 годин до моментузбору. Кожну культуру збирають і обробляють окремо для підготовкихромосом.
Підготовка хромосомних препаратів і зафарбовування хромосом
Хромосомні препарати роблять за допомогою стандартнихцитогенетичних технік. Зафарбовування мікроскопічних препаратівможе здійснюватись з використанням декількох технік (наприклад,флуоресценція плюс метод Гімза).
Аналіз
Кількість клітин, підданих аналізу, має засновуватися наспонтанній контрольній частоті ОСХ. Як правило, для ОСХ аналізуютьщонайменше 25 метафаз, що добре розрослися, на культуру.Мікроскопічні препарати отримують перед аналізом. В лімфоцитахлюдини аналізуються тільки метафази, що містять 46 центромерів. Вусталених лініях клітин аналізуються тільки метафази, що містять+- 2 центромери модального числа. Слід зазначити, чи мала місцецентромерна зміна етикетки, оцінена як ОСХ. Результати потрібнопідтверджувати шляхом незалежного експерименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці. Кількість ОСХдля кожної метафази та кількість ОСХ на хромосому для кожноїметафази має вноситись до списку окремо для всіх піддослідних іконтрольних культур.
Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичнийметод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має міститинаступну інформацію:
- клітини, що використовувались, метод збереження культуриклітин,
- умови тестування: склад середовища, концентрація CO , 2концентрація досліджуваної речовини, використане середовище,температура інкубації, період дії, використаний інгібіторверетена, його концентрація і тривалість його введення,використаний тип системи активації клітин ссавців, позитивні танегативні контрольні групи,
- кількість клітинних культур на експериментальну точку,
- детальний опис техніки, що використовувалась для підготовкимікроскопічних препаратів,
