Слід використовувати щонайменше п'ять різних придатних дляаналізу концентрацій досліджуваної речовини з приблизно половиноюзанесених в журнал інтервалів (тобто, Кк 10) між точкамитестування для початкового експерименту. Менші інтервали єдоцільними, якщо реакцію на концентрацію виявлено. Можливістьтестування при концентрації вище 5 мг/чашку або 5 мл/чашкурозглядається, якщо речовини, що піддаються оцінці, містятьсуттєву кількість потенційно мутагенних домішків.
1.5.2.3. Позитивний та негативний контроль
Паралельні штам-специфічні позитивні та негативні контрольнігрупи (за розчинником або середовищем), як з метаболічноюактивацією, так і без неї, мають входити до складу кожногоаналізу. Слід відбирати концентрації для позитивного контролю, щодемонструють ефективність при кожному аналізі.
Для аналізу за участю системи метаболічної активації слідвідбирати стандартні речовини для позитивного контролю на основітипу штамів бактерій, що використовуються.
Наступні речовини є прикладами для застосування у відповіднихгрупах позитивного контролю для аналізу з використаннямметаболічної активації.
------------------------------------------------------------------
| Номери РСХ | Номери ЄРІКХР | Назви |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
| 781-43-1 | 212-308-4 |9,10-диметил-антрацен |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
| 57-97-6 | 200-359-5 |7,12-диметилбенз(альфа)антрацен|
|--------------+-----------------+-------------------------------|
| 50-32-8 | 200-028-5 |бензо(альфа)пірен |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
| 613-13-8 | 210-330-9 |2-аміноантрацен |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
| 50-18-0 | |циклофосфамід |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
| 6055-19-2 | 200-015-4 |циклофосфаміду моногідрат |
------------------------------------------------------------------
Наступна речовина є відповідним засобом позитивного контролюдля спрощеного методу метаболічної активації:
------------------------------------------------------------------
| Номер РСХ | Номер ЄРІКХР | Назва |
|--------------+-----------------+-------------------------------|
| 573-58-0 | 209-358-4 |конго червоний |
------------------------------------------------------------------
2-аміноантрацен не слід використовувати в якості єдиногоіндикатора ефективності суміші S9. Якщо використовується2-аміноантрацен, кожну дозу S9 потрібно охарактеризувати задопомогою мутагену, що вимагає метаболічної активації звикористанням мікросомальних ензимів, наприкладбензо(альфа)пірену, диметилбензантрацену.
Наступні речовини є прикладами для застосування у відповіднихгрупах штам-специфічного позитивного контролю для аналізу звикористанням екзогенної системи метаболічної активації.
------------------------------------------------------------------
|Номери РСХ|Номери ЄРІКХР| Назви | Штам |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|26628-22-8| 247-852-1 |натрієвий азид |TA 1535 та TA 100 |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
| 607-57-8 | 210-138-5 |2-нітрофлуорен |TA 98 |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
| 90-45-9 | 201-995-6 |9-аміноакридин |TA 1537, TA 97 та |
| | | |TA 97a |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|17070-45-0| 241-129-4 |ОКВ 191 |TA 1537, TA 97 та |
| | | |TA 97a |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
| 80-15-9 | 201-254-7 |Гідропероксид |TA 102 |
| | |кумолу | |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
| 50-07-7 | 200-008-6 |Мітоміцин C |WP2 uvrA та TA102 |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
| 70-25-7 | 200-730-1 |N-етил-N-нітро-N- |WP2, WP2 uvrA та |
| | |нітрозогуанидин |WP2 uvrA (pKM101) |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
| 56-57-5 | 200-281-1 |4-нітроквинолін-1- |WP2, WP2 uvrA та |
| | |оксид |WP2 uvrA (pKM101) |
|----------+-------------+-------------------+-------------------|
|3688-53-7 | |Фурилфурамід (AF2) |плазмідовмісні |
| | | |штами |
------------------------------------------------------------------
Можна використати інші відповідні еталонні речовини дляпозитивного контролю. Застосування хімічної речовини, щовикористовується для позитивного контролю з огляду на клас можерозглядатись, якщо є доступним.
До складу мають входити негативні контрольні групи, щоскладаються тільки з розчинника або тільки з середовища, бездосліджуваної речовини, яким вводяться ті ж речовини, що іпіддослідним групам. Окрім того, контрольні групи, що непіддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повиннівикористовуватись, якщо немає історично встановлених даних зконтролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливівобраного розчинника.
1.5.3. Процедура
Для чашкового методу включення (1)(2)(3)(4) без метаболічноїактивації, зазвичай, 0,05 мл або 0,1 мл досліджуваних розчинів,
8
0,1 мл свіжої бактеріальної культури (що містить приблизно 10
життєздатних клітин) та 0,5 мл стерильного буферного розчину
змішуються з 2,0 мл верхнього шару агару. Для аналізу з
метаболічною активацією, зазвичай, 0,5 мл суміші для метаболічної
активації, що містить відповідну кількість пост-мітохондріальної
фракції (в діапазоні від 5 до 30% в об'ємному співвідношенні в
суміші для метаболічної активації) змішується з верхнім шаром
агару (2,0 мл) та бактеріями і розчином досліджуваної
речовини/досліджуваним розчином. Вміст кожної пробірки
перемішується та наливається на поверхню чашки з мінімальною
кількістю агару. Верхній шар агару дозволяється перевести в
твердий стан перед вирощуванням.
Для методу преінкубації (2)(3)(5)(6) досліджуванаречовина/досліджуваний розчин попередньо вирощується з
8
піддослідним штамом (що містить приблизно 10 життєздатних клітин)
стерильним буферним розчином системи метаболічної активації
(0,5 мл) зазвичай впродовж 20 хвилин або довше при 30-37 град.C до
того, як змішується з верхнім шаром агару та наливається на
поверхню чашки з мінімальною кількістю агару. Зазвичай, 0,05 мл
або 0,1 мл досліджуваної речовини/досліджуваного розчину, 0,1 мл
бактерій та 0,5 мл суміші S9 або стерильного буферного розчину
змішуються з 2,0 мл верхнього шару агару. Під час преінкубації
слід вентилювати пробірки за допомогою шейкеру.
Для адекватної оцінки варіації слід використовувати потрійнийметод вирощування на чашках Петрі для кожного рівня дозування.Використання подвійного методу вирощування на чашках Петрі єдоцільним, якщо воно є науково виправданим. Випадкова втрата чашкине обов'язково веде до визнання недійсними результатів аналізу.
Газоподібні та летючі речовини тестуються за допомогоювідповідних методів, таких як запечатані ємкості (12)(14)(15)(16).
1.5.4. Вирощування
Всі штами вирощуються на чашках при 37 град.C впродовж48-72 годин. Після періоду вирощування підраховується кількістьколоній-ревертантів на чашку.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Дані мають бути представлені у вигляді кількостіколоній-ревертантів на чашку. Також потрібно навести кількістьколоній-ревертантів як у негативних (контроль за розчинником іконтроль без дії речовини, якщо використовується), так і упозитивних чашках контролю. Для досліджуваної речовини тапозитивних і негативних контрольних груп (без дії речовини та/абоза розчинником) мають бути представлені індивідуальні чашковіпідрахунки, середня кількість колоній-ревертантів на чашку тастандартні відхилення.
Немає вимог до перевірки чіткої позитивної реакції. Сумнівнірезультати мають перевірятися за допомогою подальших досліджень,переважно з використанням модифікації експериментальних умов.Негативні результати потрібно підтверджувати в окремих випадках. Увипадках, коли підтвердження негативних результатів не вважаєтьсянеобхідним, потрібно навести обґрунтування. Модифікація параметрівдослідження з метою розширення діапазону оцінюваних умов будерозглядатися в подальших експериментах. Параметри дослідження, щоможуть бути модифіковані, включають в себе просторовий розподілконцентрації, метод піддавання впливу речовини (чашкове включенняабо преінкубація рідини) та умови метаболічної активації.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,такі як збільшення відносно досліджуваного рівня, пов'язане зконцентрацією, та/або відтворюване збільшення при одній абодекількох варіантах концентрацій у кількості колоній-ревертантівна чашку щонайменше в одному штамі як з системою метаболічноїактивації, так і без неї (23). Перш за все необхідно враховуватибіологічну релевантність результатів. Можливе використаннястатистичних методів в якості допоміжних при оцінюваннірезультатів тестування (24). Проте, статистична значимість не маєбути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію.
Досліджувана речовина, результати тестування якої невідповідають вищезазначеним критеріям, вважається немутагенною прицьому тестуванні.
Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні абонегативні результати, в поодиноких випадках сукупність данихвиключає можливість однозначного судження про активністьдосліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівнимиабо проблематичними, не зважаючи на кількість повтореньексперименту.
Позитивні результати бактеріального тесту на зворотну мутаціюозначають, що речовина викликає точкові мутації шляхом заміниоснов або зсувів рамки в геномі як тифозної сальмонели, так ікишкової палички. Негативні результати означають, що задосліджуваних умов досліджувана речовина не є мутагенною длядосліджуваних біологічних видів.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
Звіт про проведення тестування містити наступну інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника/середовища,
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини врозчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Штами:
- використовувані штами,
- кількість клітин на культуру,
- характеристики штамів.
Умови тестування:
- кількість досліджуваної речовини на чашку (мг/чашку абомл/чашку) з обґрунтуванням вибору дозування і кількістю чашок наодну концентрацію,
- використовуване середовище,
- тип і склад системи метаболічної активації, включаючиприйнятності,
- процедури введення речовини.
Результати:
- ознаки токсичності,
- ознаки преципітації,
- індивідуальні чашкові підрахунки,
- середня кількість колоній-ревертантів на чашку тастандартні відхилення,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз, якщо він має місце,
- паралельні дані позитивних та негативних контрольних груп(за розчинником або середовищем), з діапазонами, середнімипоказниками та стандартними відхиленнями,
- історично встановлені дані позитивних та негативнихконтрольних груп (за розчинником або середовищем), з діапазонами,середніми показниками та стандартними відхиленнями.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methodsfor Detecting Carcinogens and Mutagens with theSalmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res.,31, p. 347-364.
(2) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods forthe Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier,L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger,E., (1994) Recommendations for the Performance of BacterialMutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217-233.
(4) Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S.,Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K.,Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The Salmonellatyphimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S.Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res.,168, p. 69-240.
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T.,Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., (1975) Mutagenicity ofCarcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1,p. 91-96.
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T.,Shirai, A. and Sawamura, M., (1980) Factors ModulatingMutagenicity Microbial Tests. В: Short-term Test Systems forDetecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C.,Springer, Berlin-Heidelberg-New York. p. 273-285.
(7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender,R.D. and Foster, R., (1980) Bacterial Mutation Assays. В: BasicMutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed.D.J. Kirkland,Cambridge University Press, p. 13-61.
(8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L., (1987)Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety,8, p. 167-177.
(9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A., (1976) Useof a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens.Mutation Res., 38, p. 33-42.
(10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W.Bridges (1984) The Fluctuation Test in Bacteria. В: Handbook ofMutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J.,Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-NewYork-Oxford, p. 141-161.
(11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J., (1981) An Examinationof the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strainsof Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3,p. 453-465.
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima(1994) Improved Method for Mutagenicity Testing of GaseousCompounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307,p. 335-344.
(13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D.and Vaughn, V.L., (1984) Mutagenicity of Benzidine andBenzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a ModifiedSalmonella Assay. Mutation Res., 136, p. 33-47.
(14) Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. andMortelmans, K., (1992) Salmonella Mutagenicity Tests. V. Resultsfrom the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19,p. 2-141.
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G., (1977)Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. InProgress in Genetic Toxicology, D.Scott, B.Bridges and F.Sobels(Eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249-258.
(16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton,L.D., (1987) Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activityof Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay.Environmental Mutagenesis, 9, p. 421-441.
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M.,and Sugimura, T., (1979) Mutagenicity of the Naturally OccurringCarcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates inSalmonella typhimurium. Cancer Res., 39, p. 3780-3782.
(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N.,(1980) Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides toMutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,p. 4961-4965.
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G.,(1990) Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 withEscherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285-291.
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T.,(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as anInducer or Metabolic Activation Systems. В: 'In vitro metabolicActivation in Mutagenesis Testing' Eds. F.J. de Serres et al.Elsevier, North Holland, p. 85-88.
(21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse,D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992)Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro GenotoxicityAssays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N., (1981)Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/MicrosomeTest. Mutation Res., p. 88343-350.
(23) Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K.,Nestmann, E. and Zeiger, E., (1987) Guide for the Salmonellatyphimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity.Mutation Res. 189, с. 83-91.
(24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell,I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J., (1989) Analysis of Data fromMicrobial Colony Assays. В: UKEMS Sub-Committee on Guidelines forMutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation ofMutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge UniversityPress, p. 28-65.
B.15. ДОСЛІДЖЕННЯ МУТАГЕННОСТІ ТА СКРИНІНГ
НА ГЕНЕТИЧНІ МУТАЦІЇ КАНЦЕРОГЕННОЇ ДІЇ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Різноманітність гаплоїдних і диплоїдних штамів заквасокпивних дріжджі можна використовувати для вимірювання виходугенних мутацій, спричинених хімічними речовинами як з метаболічноюактивацією, так і без неї.
Використовуються системи прямих мутацій у гаплоїдних штамах,такі, як вимірювання мутацій від червоних мутантів, що потребуютьаденіну, (ade-1, ade-2), до подвійних білих мутантів, щопотребують аденіну, і системи відбору, такі, як провокуваннярезистентності до канаваніну та циклогексиміду.
Найбільш усебічно оцінена система зворотної мутації включає всебе використання гаплоїдного штаму XV 185-14C, який несенонсенс-мутації охри ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 та trp 5-48, які єзворотними завдяки мутагенам заміни основ, що викликаютьнаправлені мутації або мутації супресорів охри. XV 185-14C такожнесе маркер his 1-7, міссенс-мутації здебільшого повертаються допочаткового стану шляхом мутацій у зворотний бік, тамаркер hom 3-10, що повертається до початкового стану завдякимутагену, що викликає мутації зі зсувом рамки.
В диплоїдних штамах пивних дріжджі в єдинимзагальновикористовуваним штамом є D , який є гомозиготним
7
за ilv 1-92.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ВИПРОБУВАНЬ
Підготовка
Розчини піддослідних хімічних речовин та контрольна речовинаповинні готуватися безпосередньо перед проведенням тестування звикористанням відповідного середовища. У випадку з органічнимисполуками, які не є розчинними у воді, потрібно використовувати небільше 2% розчину органічних розчинників, таких як етанол, ацетончи диметилсульфоксид (ДМСО). Остаточна концентрація середовища неповинна відчутно впливати на життєздатність клітин іхарактеристики їх росту.
Метаболічна активація
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічноїречовини як в присутності відповідної екзогенної системиметаболічної активації, так і за її відсутності.
Найчастіше використовується система доповненої коферментамипост-мітохондріальної фракції з печінок гризунів, попередньооброблених реагентами з включенням ензимів. Використання іншихбіологічних видів, тканин, пост-мітохондріальних фракцій абопроцедур також може бути доцільним для метаболічної активації.
Умови тестування:
Лінії-аналізатори
Гаплоїдний штам XV 185-14C та диплоїдний штам D найбільше 7використовуються в дослідженнях генної мутації. Також може бутибільш доцільним використання інших штамів.
Середовище
Відповідне середовище для культур використовується длявизначення кількості одиниць, що вижили, і мутантів.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Позитивний контроль, контроль без піддавання впливудосліджуваної речовини та контроль за розчинником маютьздійснюватись одночасно. Потрібно використовувати відповідніречовини позитивного контролю для кожної окремої кінцевої точкимутації.
Концентрація для впливу
Слід використовувати щонайменше п'ять концентраційдосліджуваної речовини з адекватними проміжками між ними. Длятоксичних речовин найвища досліджувана концентрація не повинназменшувати показника одиниць, що вижили, менш ніж на 5-10%.Відносно нерозчинні у воді речовини потрібно випробовувати до їхмежі розчинності з використанням відповідних процедур. Длянетоксичних речовин, що вільно розчиняються у воді, найвищаконцентрація визначається для кожного окремого випадку.
Умови інкубації
Чашки вирощують від чотирьох до семи днів при 28-30 град.C утемряві.
Частота спонтанних мутацій
Субкультури повинні використовуватись зі спонтанною частотоюмутацій в межах прийнятого звичайного діапазону.
Кількість повторень
Для аналізу фототрофів, що утворилися в результаті генноїмутації, та життєздатності клітин потрібно використати щонайменшетри чашки для повторення для кожної концентрації. У випадкупроведення експериментів з використанням таких маркерів, якhom 3-10 з низьким рівнем мутації, кількість використовуванихчашок потрібно збільшити для отримання статистично відповіднихданих.
Процедура
Піддавання пивних дріжджів впливу речовини, зазвичай,здійснюється згідно з процедурою випробування рідин, включаючи якстаціонарні клітини, так і клітини у стадії росту. Початковийексперимент потрібно здійснити на клітинах у стадії росту:
7
1-5 x 10 клітин/мл піддають впливу досліджуваної хімічної
речовини впродовж 18 годин при температурі 28-37 град.C,
збовтуючи; відповідна кількість елементів системи метаболічної
активації додається під час введення речовини, коли це доцільно.
Наприкінці періоду дії речовини клітини центрифугують, змивають та
висівають у відповідне культуральне середовище. Після інкубації
чашки оцінюють за ступенем виживання клітин та генних мутацій.
Якщо перший експеримент дає негативні результати, потрібно
провести другий експеримент з використанням клітин у стаціонарній
фазі. Якщо перший експеримент дає позитивні результати, їх слід
підтвердити шляхом проведення відповідного незалежного
експерименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці з зазначеннямкількості підрахованих колоній, кількості мутантів, частотимутацій і виживання. Всі результати слід підтверджувати шляхомнезалежного експерименту. Дані слід оцінювати, використовуючивідповідний статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
За можливості звіт про проведення тесту має містити наступнуінформацію:
- використовувані штами,
- умови проведення тесту: клітини у стаціонарній фазі абоклітини у стадії росту, склад середовища, температура і тривалістьінкубації, система метаболічної активації,
- умови піддавання дії речовини: рівень введення, процедура ітривалість введення, температура введення, позитивний танегативний контроль,
- кількість підрахованих колоній, кількість мутантів, частотамутацій і виживання, співвідношення дози/реакції, у випадкузастосування, статистична оцінка даних,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
B.16. МІТОТИЧНА РЕКОМБІНАЦІЯ - ПИВНІ ДРІЖДЖІ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Мітотична рекомбінація в пивних дріжджах може визначатися міжгенами (або, більш узагальнено, між геном і його центромером) тавсередині генів. Перший варіант називається мітотичнимкросинговером зі взаємним генеруванням продуктів, в той час, якостанній найчастіше не є взаємним і називається конверсією гена.Кросинговер, зазвичай, аналізується за виробленням рецесивнихгомозиготних колоній або секторів, утворених в гетерозиготномуштамі, в той час, як конверсія гена аналізується за виробленнямфототрофічних ревертантів, утворених в ауксотрофномугетероалельному штамі з двома різними дефектними алелями одного йтого ж гену. Найбільш часто використовуваними штамами длявизначення мітотичної конверсії гена є D4 (гетероалельний вade 2 та trp 5), D7 (гетероалельний у trp 5), BZ34 (гетероалельнийв arg 4) та JDl (гетероалельний в his 4 та trp 5). Мітотичнийкросинговер, що продукує червоні та рожеві гомозиготні сектори,може оцінюватись через D або D (який також використовується для
5 7
вимірювання мітотичної конверсії гена та зворотної мутації в
ilv 1-92), обидва штами є гетероалельними для комплементарних
алелів ade 2.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ВИПРОБУВАНЬ
Підготовка
Розчини піддослідних хімічних речовин та контрольні абобазові сполуки повинні готуватися безпосередньо перед проведеннямтесту з використанням відповідного середовища. У випадку зорганічними сполуками, які є нерозчинними у воді, потрібновикористовувати не більше 2% розчину органічних розчинників, такихяк етанол, ацетон чи диметилсульфоксид (ДМСО). Остаточнаконцентрація середовища не повинна відчутно впливати нажиттєздатність клітин і характеристики їх росту.
Метаболічна активація
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної хімічноїречовини як в присутності відповідної екзогенної системиметаболічної активації, так і за її відсутності. Найчастішевикористовується система доповненої коферментамипост-мітохондріальної фракції з печінок гризунів, попередньооброблених реагентами з включенням ензимів. Використання іншихбіологічних видів, тканин, пост-мітохондріальних фракцій абопроцедур також може бути доцільним для метаболічної активації.
Умови тестування:
Штами-аналізатори
Штамами, що найчастіше використовуються, є диплоїди D , D , 4 5D та JD1. Може бути більш доцільним використання інших штамів.
7
Середовище
Відповідне середовище для культур використовується длявизначення кількості одиниць, що вижили, і частоти мітотичноїрекомбінації.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Позитивний контроль, контроль без піддавання впливудосліджуваної речовини та контроль за розчинником маютьздійснюватись одночасно. Потрібно використовувати відповідніречовини позитивного контролю для кожної окремої кінцевої точкирекомбінації.
Концентрація для впливу
Потрібно використовувати щонайменше п'ять концентраційдосліджуваної речовини з адекватними проміжками між ними. Середфактів, які потрібно взяти до уваги, слід зазначитицитотоксичність та розчинність. Найнижча концентрація може невпливати на життєздатність клітин. Для токсичних хімічних речовиннайвища досліджувана концентрація не повинна зменшувати показникаодиниць, що вижили, менш ніж на 5-10%. Відносно нерозчинні у водіхімічні речовини потрібно випробовувати до їх межі розчинності звикористанням відповідних процедур. Для нетоксичних речовин, щовільно розчиняються у воді, найвища концентрація визначається длякожного окремого випадку.
Клітини можна піддавати впливу досліджуваної речовини як підчас стаціонарної фази, так і під час росту на періоди не більше18 годин. Проте, якщо передбачається використання культур впродовжбільшого періоду часу, культури потрібно мікроскопічно дослідитина предмет утворення спор, за умови присутності яких результатитестування вважатимуться недійсними.
Умови інкубації
Чашки вирощують у темряві від чотирьох до семи днів при28-30 град.C. Чашки, що використовуються для аналізу червоних тарожевих гомозиготних секторів, утворених шляхом мітотичногокросинговеру, потрібно тримати в холодильнику (при температуріблизько 4 град.C) впродовж 1-2 днів перед оцінюванням, що даєзмогу розвиватися відповідним пігментованим колоніям.
Частота спонтанних мітотичних рекомбінацій
Суб-культури повинні використовуватись зі спонтанною частотоюмутацій при мітотичних рекомбінаціях в межах прийнятого звичайногодіапазону.
Кількість повторень
Для аналізу фототрофів, що утворилися в результаті мітотичноїконверсії генів, та життєздатності потрібно використати щонайменшетри чашки для повторення для кожної концентрації. У випадкупроведення аналізу рецесивної гомозиготності, утвореної шляхоммітотичного кросинговеру, кількість чашок слід збільшити длязабезпечення відповідної кількості колоній.
Процедури
Піддавання пивних дріжджів впливу речовини, зазвичай,здійснюється згідно з процедурою випробування рідин, включаючи якстаціонарні клітини, так і клітини у стадії росту. Початковийексперимент потрібно здійснити на клітинах у стадії росту.
7
1-5 х 10 клітин/мл піддають впливу досліджуваної хімічної
речовини впродовж 18 годин при температурі 28-37 град.C,
збовтуючи; відповідна кількість елементів системи метаболічної
активації додається під час введення речовини, коли це доцільно.
Наприкінці періоду дії речовини клітини центрифугують,змивають та висівають у відповідне культуральне середовище. Післяінкубації чашки оцінюють за ступенем виживання клітин тамітотичної рекомбінації.
Якщо перший експеримент дає негативні результати, потрібнопровести другий експеримент з використанням клітин у стаціонарнійфазі. Якщо перший експеримент дає позитивні результати, їх слідпідтвердити шляхом незалежного експерименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці з зазначеннямкількості підрахованих колоній, кількості рекомбінацій, колоній,що вижили, та частоти рекомбінацій.
Результати потрібно підтверджувати шляхом незалежногоексперименту.
Дані слід оцінювати, використовуючи відповідний статистичнийметод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
За можливості, звіт про проведення тесту має містити наступнуінформацію:
- використовувані штами,
- умови тестування: клітини у стаціонарній фазі або клітини устадії росту, склад середовища, температура і тривалістьінкубації, система метаболічної активації,
- умови піддавання дії речовини: концентрація введення,процедура і тривалість введення, температура введення, позитивнийта негативний контроль,
- кількість підрахованих колоній, кількість рекомбінантів,частота рекомбінацій і виживання, співвідношення дози/реакції, увипадку застосування, статистична оцінка даних,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
B.17. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO НА ГЕННУ
МУТАЦІЮ КЛІТИН ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 476, ТестIn Vitro на Генну Мутацію Клітин Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Тест in vitro на генну мутацію клітин ссавців можнавикористовувати для визначення генних мутацій, спричинениххімічними речовинами. Придатними лініями клітин є клітини лімфомимишей L5178Y, штами клітин китайського хом'яка CHO, CHO-AS52 таV79 та лімфобластоїдні клітини людини TK6 (1). В цих лініях клітиннайбільш часто використовувані генетичні кінцеві точки вимірюютьмутацію в тимідин-кіназі (ТК) та гіпоксантин-гуаніновійфосфорибосил трансферази (ГГФТ) та трансгену ксантин-гуаніновійфосфорибосил трансферази (КГФТ). Тести на мутації ТК, ГГФТ та КГФТвизначають різні спектри генетичних процесів. Аутосомнерозташування ТК та КГФТ дає можливість виявлення генетичнихпроцесів (наприклад, великих делецій), що не виявляються у локусіГГФТ X-хромосом (2)(3)(4)(5)(6).
Для тесту in vitro на генну мутацію клітин ссавців можнавикористовувати культури усталених ліній клітин або штамів клітин.Клітини для використання відбираються, спираючись на здатністькультури до зростання та стабільність частоти спонтанних мутацій.
Дослідження, що проводяться in vitro, зазвичай вимагаютьвикористання екзогенного джерела метаболічної активації. Цясистема метаболічної активації не може повністю імітувати умовфункціонування організму ссавців in vivo. Необхідно подбати проте, щоб уникнути умов, які призводять до результатів, які невідображають спадкової мутагенності. Результати, які невідображають спадкової мутагенності, можуть походити від змін pH,осмотичного тиску або високого рівня цитотоксичності (7).
Це дослідження використовується для обстеження на можливімутагени і канцерогени у ссавців. Багато сполук, що даютьпозитивний результат у цьому дослідженні, є канцерогенами ссавців;проте, немає абсолютного співвідношення між цим дослідженням таканцерогенністю. Співвідношення залежить від класу хімічнихречовин, і збільшується кількість даних, які доводять існуванняканцерогенів, що не виявляються за допомогою цього дослідження,оскільки є припущення, що вони діють через інші, не генотоксичні,механізми або механізми, відсутні у бактеріальних клітинах (6).
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Пряма мутація: генна мутація від материнського типу домутантної форми, яка спричиняє зміну або втрату ензимноїактивності функції закодованого протеїну.
Мутагени заміщення пари основ: речовини, що спричиняютьзаміну однієї або кількох пар основ у ДНК.
Мутагени, що викликають мутації зі зсувом рамки: речовини, щоспричиняють додавання чи делецію одиничних чи множинних пар основу молекулі ДНК.
Час експресії фенотипу: період, впродовж якого незмінні генніпродукти вичерпуються з клітин, що нещодавно мутували.
Частота мутацій: кількість виявлених клітин-мутантів,поділена на кількість життєздатних клітин.
Відносне загальне зростання: збільшення кількості клітин зчасом у порівнянні з контрольною популяцією клітин; підраховуютьсяяк продукт росту суспензії по відношенню до часу для ефективностіклонування негативної контрольної групи задля негативногоконтролю.
Відносне зростання суспензії: збільшення кількості клітин заперіод експресії по відношенню до негативної контрольної групи.
Життєздатність: ефективність клонування клітин, що піддаютьсядії речовини, за час знаходження у чашці за селективних умов післяперіоду експресії.
Виживання: ефективність клонування клітин, що піддаються діїречовини, по завершенні періоду цієї дії; виживання, зазвичай,виражається по відношенню до ступеню виживання у контрольнійпопуляції клітин.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Клітини, позбавлені тимідин-кінази (ТК) завдяки мутаціїTK+/- -> TK-/- є стійкими до цитотоксичних впливів аналогупіримідину трифлюоротимідину (ТФТ). Спеціальні клітинитимідин-кінази чутливі до ТФТ, що спричиняє пригнічення клітинногометаболізму та припиняє подальший поділ клітин. Таким чином,клітини-мутанти здатні розростатися в присутності ТФТ, в той часяк звичайні клітини, що містять тимідин-кіназу, до цього нездатні.Подібним чином, клітини, позбавлені ГГФТ або КГФТ, відбирають заознакою резистентності до 6-тіогуаніну (ТГ) та 8-азагуаніну (АГ).Властивості досліджуваної речовини слід детально розглядати, якщовипробування основного аналогу або сполуки, пов'язаної зселективним реагентом, проводиться в рамках будь-якого тесту нагенну мутацію клітин ссавців. Наприклад, будь-яка підозрюванавибіркова токсична дія досліджуваної речовини на мутантні або немутантні клітини повинна досліджуватись. Таким чином, діясистеми/реагента відбору має бути підтверджена, якщо досліджуваніхімічні речовини структурно пов'язані з селективним реагентом.
Клітини у вигляді суспензії або моношарової культурипіддаються впливу досліджуваної речовини як в присутності системиметаболічної активації, так і за її відсутності, на відповіднийперіод часу та пасеруються з метою визначення цитотоксичності тадля надання змоги вираження фенотипу перед відбороммутантів (9)(10)(11)(12)(13). Цитотоксичність, зазвичай,визначається за допомогою вимірювання відносної ефективностіклонування (коефіцієнту виживання) або відносного показниказагального росту культур по закінченні періоду дослідження.Культури, піддані дії речовини, утримуються в середовищі ростувпродовж достатнього періоду часу, характерного для кожноговідібраного локусу та типу клітини, з метою надання змогимаксимально наближеного до оптимального вираження фенотипуспровокованих мутацій. Частота мутацій визначається за допомогоювисівання певного числа клітин у середовище, що міститьселективний реагент для визначення клітин-мутантів, та усередовище без селективного реагенту для визначення ефективностіклонування (життєздатності). По завершенні відповідного періодуінкубації колонії підраховують. Частота мутацій виводиться зкількості колоній-мутантів у селективному середовищі та кількостіколоній у неселективному середовищі.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Клітини
Різноманітність типів клітин, доступна для використання вцьому тесті, включає субклони клітин L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79або TK6. Типи клітин, що використовуються в цьому тесті, повиннімати явну чутливість до хімічних мутагенів, високу ефективністьклонування та стабільну частоту спонтанних мутацій. Клітинипотрібно перевіряти на зараження мікоплазмою; при виявленнізараження їх не слід використовувати.
Тест має бути розроблено з урахуванням попередньо визначеноїчутливості та сили впливу. Кількість клітин, культур таконцентрацій використаної досліджуваної речовини повиннавідображати ці визначені параметри (14). Мінімальна кількістьжиттєздатних клітин, що переживають піддавання дії речовини івикористовуються на кожній стадії дослідження, має обумовлюватисьчастотою спонтанних мутацій. Основною рекомендацією євикористовувати кількість клітин, що є принаймні вдесятероінверсивнішою за частоту спонтанних мутацій. Проте, рекомендується
6
використовувати щонайменше 10 клітин. Адекватні історично
встановлені дані про систему клітин мають бути доступними для
зазначення послідовних результатів дослідження.
1.4.1.2. Середовище і умови для культур
Для підтримання культур потрібно використовувати відповіднесередовище та умови вирощування (ємкості для культур, температури,концентрації CO і вологості). Середовище слід вибирати згідно з
2
системами відбору та типу клітин, що використовувалися для
дослідження. Особливо важливо, щоб умови для культур обиралися з
