Умови тестування:
- позитивні та негативні контрольні групи (з використаннямрозчинника або середовища),
- дані досліджень з виявлення діапазону, якщо вонипроводилися,
- обґрунтування вибору рівня дозування,
- докладна інформація щодо приготування досліджуваноїречовини,
- докладна інформація застосування досліджуваної речовини,
- обґрунтування вибору маршруту введення,
- методи перевірки того, що досліджувана речовина досяглазагального кровообігу або цільової тканини, у випадкузастосування,
- перехід від концентрації досліджуваної речовини уїжі/питній воді (в мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг масатіла/день), у випадку застосування,
- докладна інформація щодо якості їжі і води,
- детальний опис введення речовини та графіки забору зразків,
- методи вимірювання токсичності,
- ідентичність речовини, що спричиняє блокування метафази, їїконцентрація та тривалість введення,
- методи підготовки мікроскопічних препаратів,
- критерії для оцінки аберацій,
- кількість проаналізованих клітин на одну тварину,
- критерії віднесення дослідження до позитивного,негативного, або сумнівного розряду.
Результати:
- ознаки токсичності,
- мітотичний індекс,
- тип і кількість аберацій, наведені окремо для кожноїтварини,
- загальна кількість аберацій у групі з середніми показникамита стандартними відхиленнями,
- загальна кількість клітин з абераціями у групі з середнімипоказниками та стандартними відхиленнями,
- зміни в плоїдності, якщо вони помітні,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз, якщо він має місце,
- дані паралельних негативних контрольних групп,
- історично встановлені дані негативних контрольних груп здіапазонами, середніми показниками та стандартними відхиленнями,
- дані паралельних позитивних контрольних груп.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. В:Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S.Venitt and J.M.Parry(Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275-306.
(2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H.,McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo CytogeneticAssays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells.Mutation Res., 189, p. 157-165.
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G.,Bootman, J. and Henderson, L., (1990) In Vivo Cytogenetic Assays.В: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS RecommendedProcedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for MutagenicityTesting. Report. Part I revised. Cambridge University Press,Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
(4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D.,Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B.,Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou,S. and Vannier, B., (1994) Report from the Working Group on the InVivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. MutationRes., 312, p. 305-312.
(5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A.,Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G.,Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report ofBritish Toxicology Society/UK Environmental Mutagen SocietyWorking Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays.Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E.,Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage,J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays.В: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing.Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data.D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge.p. 184-232.
(7) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinesehamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. MutationRes. 119, с. 403-413.
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983)Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells.Cancer Res., 43, p. 1362-1364.
B.12. МУТАГЕННІСТЬ - МІКРОЯДЕРНИЙ ТЕСТ IN VIVO
НА ЕРИТРОЦИТАХ ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЄСР 474,Мікроядерний Тест на Еритроцитах Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Мікроядерний тест in vivo на еритроцитах ссавціввикористовується для виявлення пошкоджень хромосом веретена поділуеритробластів, спричинених досліджуваною речовиною, шляхом аналізуеритроцитів, взятих з кісткового мозку та/або клітин периферичноїкровоносної системи тварин, зазвичай гризунів.
Метою мікроядерного тесту є визначення речовин, щоспричиняють цитогенетичні пошкодження, результатом яких єформування мікроядер, які містять уповільнені фрагменти хромосомабо цілі хромосоми.
Якщо еритробласт кісткового мозку розвивається в поліхромнийеритроцит, головне ядро виштовхується; будь-яке мікроядро, щосформувалося, може залишитись в іншій без'ядерній цитоплазмі.Візуалізація мікроядер в цих клітинах полегшена через відсутністьу них головного ядра. Збільшення концентрації мікроядернихполіхромних еритроцитів у піддослідних тварин є показникоміндукованих хромосомних пошкоджень.
Зазвичай для цього тесту використовується кістковий мозокгризунів, оскільки поліхромні еритроцити виробляються у ційтканині. Вимірювання мікроядерних незрілих (поліхромних)еритроцитів у периферичній крові є однаково прийнятним длябудь-якого біологічного виду, в межах якого проявилася нездатністьселезінки видаляти мікроядерні еритроцити або адекватна чутливістьдля виявлення речовин, що спричиняють кількісні хромосомніаберації. Мікроядра можна вирізнити за допомогою кількохкритеріїв. Вони включають визначення присутності чи відсутностікінетохорної або центромірної ДНК в мікроядрах. Концентраціямікроядерних незрілих (поліхромних) еритроцитів є основноюкінцевою точкою. Кількість зрілих (нормохромних) еритроцитів впериферичній крові, що містить мікроядра у заданій кількостізрілих еритроцитів, може також використовуватись, як кінцева точкааналізу, якщо тварин постійно піддають дії речовини впродовжчотирьох тижнів або довше.
Цей мікроядерний тест in vivo на еритроцитах ссавців маєособливе значення для оцінки мутагенної загрози, оскільки він даєзмогу розглянути фактори метаболізму in vivo, фармакокінетику тапроцеси репарації ДНК, хоча вони можуть змінюватися в залежностівід біологічного виду, тканини та генетичних кінцевих точок.Аналіз in vivo також є корисним для подальших дослідженьмутагенного впливу, визначеного за допомогою системи in vitro.
Якщо є докази того, що досліджувана речовина або реактивніметаболіти не досягнуть цільової тканини, застосування цього тестуне є доцільним.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Центромер (Кінетохор): зона(и) хромосоми, яка(і) з'єднуєволокна мітотичного веретена під час поділу клітин, надаючи змогудочірнім хромосомам впорядковано рухатись до полюсів дочірніхклітин.
Мікроядра: маленькі ядра, відділені від головних ядер клітині додаткові до них, що утворюються під час телофази мітозу(мейозу) шляхом уповільнення фрагментів хромосом або цілиххромосом.
Нормохромний еритроцит: зрілий еритроцит, якому не вистачаєрибосом; його можна відрізнити від незрілих, поліхромнихеритроцитів за плямами, що сприяють виділенню рибосом.
Поліхромний еритроцит: незрілий еритроцит, в проміжній стадіїрозвитку, який все ще містить рибосоми і його можна відрізнити відзрілих, нормохромних еритроцитів за плямами, що сприяють виділеннюрибосом.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Тварин піддають впливу досліджуваної речовини, використовуючивідповідний шлях введення. Якщо використовується кістковий мозок,тварин знищують у зазначений час після втручання, кістковий мозоквитягується, препарати готуються і зафарбовуються(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Якщо використовується периферична кров,кров беруть у зазначений час після піддавання дії речовини,готують і зафарбовують мазкові препарати (4)(8)(9)(10). Длядосліджень з використанням периферичної крові між останнімвведенням речовини і збором клітин має пройти якомога менше часу.Препарати аналізують з метою виявлення присутності мікроядер.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Вибір біологічних видів тварин
Якщо використовується кістковий мозок, дослідженнярекомендується проводити на мишах або щурах, хоча можливе такожвикористання інших придатних видів ссавців. Якщо використовуєтьсяпериферична кров, дослідження рекомендується проводити на мишах.Проте, можливе використання будь-яких придатних біологічних видівссавців, у яких проявилася нездатність селезінки видалятимікроядерні еритроцити або адекватна чутливість для виявленняречовин, що спричиняють кількісні хромосомні аберації. Слідзалучити до тестування лабораторні лінії здорових молодих тварин,що зазвичай використовуються. На початку дослідження коливанняваги тварин має бути мінімальною і не перевищувати +- 20% відсередньої ваги для кожної статі.
1.4.1.2. Умови утримання і годування
Застосовуються загальні умови викладені у Загальному вступі,Частині B, проте, оптимальним показником вологості є 50-60%.
1.4.1.3. Підготовка тварин
Здорових молодих дорослих тварин навмання призначають впіддослідну групу. Тварини ідентифікуються окремо. Тваринпристосовують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів.Клітки повинні розташовуватись таким чином, щоб мінімізуватиможливі впливи їх місця розташування.
1.4.1.4. Підготовка доз
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути задопомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщоце є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовиниможна ввести безпосередньо або розбавити перед введенням. Слідзастосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тількидані щодо стабільності не виявляють прийнятності зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище:
Розчинник/середовище не мають спричиняти токсичних впливівпри використаному рівні дозування, а також не має бути підозри нахімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною.Якщо використовується не добре відомий розчинник/середовище, їхвключення повинне підтверджуватись посиланнями, що доводять їхнюсумісність. Рекомендується там, де можливо, використовуватиспочатку водний розчинник/середовище.
1.4.2.2. Контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (звикористанням розчинника або середовища) мають входити до складугрупи кожної статі при кожному тестуванні. За вийнятком введеннядосліджуваної речовини, за тваринами в контрольній групідоглядають так само, як і за тваринами піддослідних груп.
Позитивні контрольні групи утворюють мікроядра in vivo прирівнях дозування, при яких очікувалося зростання по відношенню довихідних даних, яке можна виявити. Концентрації для позитивнихконтрольних груп слід обирати таким чином, щоб впливи чіткопроявлялися, проте, щоб ідентичність кодованих мікроскопічнихпрепаратів не одразу виявлялася пристроєм для зчитування. Можливимє варіант введення речовини позитивній контрольній групі іншимшляхом, ніж вводилася досліджувана речовина, потім зразок беретьсятільки один раз. Окрім того, у випадку наявності може розглядатисьзастосування хімічної речовини, що використовується дляпозитивного контролю з огляду на клас. До речовин для позитивногоконтролю належать:
------------------------------------------------------------------
| Речовина | Номер РСХ | Номер ЄРІКХР |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|N-Етил-N-нитрозосечовина | 759-73-9 | 212-072-2 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Мітоміцин C | 50-07-7 | 200-008-6 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-015-4 |
|Циклофосфаміду моногідрат | 6055-19-2 | |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Триетилнемеламін | 51-18-3 | 200-083-5 |
------------------------------------------------------------------
Негативні контрольні групи, яким вводиться тільки розчинникабо середовище, а в інших випадках вводяться ті ж речовини, що ідосліджуваним групам, мають включатися до кожного часу відборупроб, якщо тільки не є прийнятною міжтваринна варіативність, іконцентрація клітин з мікроядрами виявляється завдяки історичновстановленим даним з контролю. Якщо зразки у негативнихконтрольних групп беруться один раз, найкращим часом є перший часвідбору проб. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалисявпливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщонемає історично встановлених або опублікованих даних з контролю,що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраногорозчинника.
Якщо використовується периферична кров, може такожрозглядатися варіант забору зразків перед введенням речовини уякості паралельного негативного контролю, але тільки длякороткотривалих досліджень периферичної крові (наприклад,1-3 введення), коли результати будуть у межах очікуваного згідно зісторично встановленими даними з контролю діапазону.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Кількість і стать тварин
Кожна піддослідна і контрольна група мають включатищонайменше п'ять придатних для аналізу тварин кожної статі (11).Якщо на час дослідження наявні дані інших досліджень на такихсамих видах з використанням такого самого шляху введення, щодемонструють відсутність суттєвої різниці у токсичності,пов'язаної зі статтю тварин, буде достатньо проведення тестуванняна одній статі. Якщо вплив хімічних речовин на людину можезалежати від статі, як наприклад для деяких фармацевтичнихзасобів, випробування слід проводити на тваринах відповідноїстаті.
1.5.2. Графік введення
Немає рекомендацій щодо стандартного графіку введенняречовини (тобто, 1, 2, чи більше введень впродовж 24 годин).Зразки з розширеного режиму введення дози приймаються до тих пір,поки не проявиться позитивний вплив для цього дослідження або, длянегативного дослідження, до тих пір, поки не проявитьсятоксичність або не буде застосована гранична доза, і дозування небуде продовжене до часу збору зразків. Досліджувані речовиниможуть також вводитися розділеною дозою, тобто робиться двавведення у той самий день з перервою не більше ніж у кілька годиндля полегшення введення великого об'єму речовини.
Проведення тесту можливе з використанням двох способів:
а) тваринам одноразово вводиться досліджувана речовина.Зразки кісткового мозку беруться щонайменше двічі, починаючи нераніше ніж через 24 години, але й не пізніше ніж 48 годин, післявведення речовини з відповідними інтервалам між забором зразків.Забір зразків раніше ніж через 24 години після введення речовинимає бути виправданим. Зразки периферичної крові берутьсящонайменше двічі, починаючи не раніше ніж через 36 годин, але й непізніше ніж 72 години, після введення речовини з відповіднимиінтервалам між забором зразків. Якщо позитивний результат отриманопри одному заборі зразків, додатковий забір зразків непотрібен.
b) якщо речовина вводиться два чи більше разів на день(наприклад, два чи більше введення за 24-годинний проміжок часу),зразки слід брати один раз між 18 та 24 годинами після останньоговведення для кісткового мозку та один раз між 36 та 48 годинамипісля останнього введення для периферичної крові (12); додатковоможливе використання іншого часу для забору зразків, якщо цепотрібно.
1.5.3. Рівень дозування
Якщо дальнометричне дослідження проводиться тому, що немаєпридатних наявних відповідних даних, воно має проводитися в тійсамій лабораторії з використанням тих самих біологічних видів,ліній, статі та режиму введення, що використовувались у основномудослідженні (13). Якщо проявляється токсичність, для першого часузабору зразка використовується три рівні дозування. Ці рівнідозування повинні покривати діапазон від максимальної до незначноїтоксичності або її відсутності. При подальшому заборі зразків слідвикористовувати лише найвищу дозу. Найвища доза визначається якдоза, за якої з'являються такі ознаки токсичності, які при вищихрівнях дозування з дотриманням того самого режиму можутьспричиняти смерть. Речовини зі специфічними видами біологічноїактивності при низьких нетоксичних дозах (такі, як гормони тамітогени) можуть бути винятками з критеріїв встановлення дозуванняі мають оцінюватись в окремих випадках. Найвища доза може такожвизначатися як доза, за якої з'являються деякі показникитоксичності у кістковому мозку (наприклад, зменшення долі незрілихеритроцитів у загальній кількості еритроцитів кісткового мозку чипериферичної крові).
1.5.4. Тестування на граничний вміст
Якщо тестування на одному рівні дозування, який становитьщонайменше 2000 мг/кг маси тіла з використанням введення за одинраз, або двох введень у той же день, не спричиняє видимихтоксичних впливів, і якщо генотоксичність не передбачається зогляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, невиникне необхідності в проведенні розгорнутого дослідження звикористанням трьох рівнів дозування. Для більш довготривалихдосліджень гранична доза становитиме 2000 мг/кг маса тіла/день длявведення речовини тривалістю до 14 днів, та 2000 мг/кг маситіла/день для введення речовини тривалістю довше 14 днів.Очікуваний вплив на людину може визначати потребу в використаннівищого рівня дозування під час тестування на граничний вміст.
1.5.5. Призначення доз
Досліджувана речовина, зазвичай, вводиться з їжею,використовуючи зонд для штучного харчування або відповіднуінтубаційну трубку, або шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Іншішляхи введення можуть використовуватися, якщо вони є виправданими.Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз з їжею абоін'єкцією, залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не маєперевищувати 2 мл/100 г маси тіла. Використання об'ємів, більшихза ці, має бути виправданим. За винятком подразнюючих чироз'їдаючих речовин, які зазвичай проявляють ускладнені впливи прибільшій концентрації, варіативність досліджуваного об'єму потрібномінімізувати шляхом пристосування концентрації до забезпеченняпостійного об'єму на всіх рівнях дозування.
1.5.6. Препарат кісткового мозку/крові
Клітини кісткового мозку, зазвичай, беруть зі стегна абовеликої берцової кістки одразу після знищення тварини. Як правило,клітини відокремлюються зі стегна або великої берцової кістки,препаруються і зафарбовуються згідно усталених методів.Периферичну кров беруть з хвостової вени або іншої придатноїкровоносної судини. Клітини крові одразу зафарбовуютьсясуправітально (8)(9)(10), або готуються мазкові препарати, а потімзафарбовуються. Використання специфічного зафарбовування ДНК(наприклад, акридин оранжевий (14) або хехст 33258 плюс піролін-Y(15)) може знищити деякі артефакти, пов'язані з використаннямнеспецифічного зафарбовування ДНК. Ця перевага не виключаєвикористання стандартних видів зафарбовування (наприклад, задопомогою барвника Гімза). Додаткові системи (наприклад, целюлозніколонки для усування клітин з ядром (16)) також можутьвикористовуватись за умови, якщо про ці системи відомо, що вониадекватно використовуються для мікроядерного препарування влабораторії.
1.5.7. Аналіз
Частка незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитів(незрілих + зрілих) визначається для кожної тварини шляхомпідрахунку суми щонайменше 200 еритроцитів для кісткового мозкуабо 1000 еритроцитів для периферичної крові (17). Всімікроскопічні препарати, включаючи препарати позитивної танегативної контрольних груп, повинні отримати незалежний код передмікроскопічним аналізом. Щонайменше 200 незрілих еритроцитів наодну тварину оцінюються з точки зору частки мікроядерних незрілихеритроцитів. Додаткову інформацію можна отримати шляхом оцінкизрілих еритроцитів на вміст мікроядер. При аналізі мікроскопічнихпрепаратів частка незрілих еритроцитів у загальній кількостіеритроцитів має становити не менше 20% від контрольного значення.Якщо тварин постійно піддають дії речовини впродовж чотирьохтижнів або довше, щонайменше 2000 зрілих еритроцитів на однутварину також можуть оцінюватися з точки зору долі мікроядер.Системи для автоматизованого аналізу (аналізу зображення іцитометрії потоку клітинних суспензій) є прийнятнимиальтернативами ручного способу оцінювання, якщо він є відповіднимчином обґрунтованим та затвердженим.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Індивідуальні дані тварин мають бути представлені у формітаблиці. Експериментальною одиницею є тварина. Кількість оціненихнезрілих еритроцитів, мікроядерних незрілих еритроцитів, ікількість незрілих еритроцитів у загальній кількості еритроцитівмає вноситись до списку окремо для кожної піддослідної тварини.Якщо тварин постійно піддають дії речовини впродовж чотирьохтижнів або довше, дані щодо зрілих еритроцитів теж потрібнонаводити, якщо вони були зібрані. Частка незрілих еритроцитів узагальній кількості еритроцитів та, у випадку застосування,кількість мікроядерних еритроцитів наводиться для кожної тварини.Якщо немає доказів на підтвердження різниці в реакції в залежностівід статі, для статистичного аналізу можливе об'єднання даних щодообох статей.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,такі як збільшення кількості клітин з мікроядерними клітинами,пов'язане з дозуванням, або чітке збільшення кількостімікроядерних клітин у групі, якій вводилася єдина доза приодноразовому заборі зразків. Перш за все необхідно враховуватибіологічну релевантність результатів. Можливе використаннястатистичних методів в якості допоміжних при оцінюваннірезультатів дослідження (18)(19). Статистична значимість не маєбути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію. Сумнівнірезультати мають перевірятися за допомогою подальших досліджень,переважно з використанням модифікації експериментальних умов.
Досліджувана речовина, результати якої не відповідаютьвищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цьомутестуванні.
Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні абонегативні результати, в поодиноких випадках сукупність данихвиключає можливість визначеного судження про активністьдосліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівнимиабо проблематичними, не зважаючи на кількість повтореньексперименту.
Позитивні результати мікроядерного тесту означають, щоречовина викликає утворення мікроядер, що є результатомхромосомних ушкоджень або ушкоджень веретена поділу еритробластівдосліджуваних біологічних видів. Негативні результати означають,що за досліджуваних умов досліджувана речовина не викликаєутворення мікроядер у незрілих еритроцитах досліджуванихбіологічних видів.
Ймовірність того, що досліджувана речовина або її метаболітидосягнуть загального кровообігу або, особливо, цільової тканини(наприклад, системна токсичність), підлягають обговоренню.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
Звіт про проведення тестування має містити наступнуінформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника.
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини врозчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Піддослідні тварини:
- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,
- кількість, вік і стать тварин,
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.,
- вага кожної тварини на початку випробування, включаючидіапазон ваги тіла, середні та стандартні відхилення для кожноїгрупи.
Умови тестування:
- дані позитивних та негативних контрольних груп (звикористанням розчинника або середовища),
- дані досліджень з виявлення діапазону, якщо вонипроводилися,
- обґрунтування вибору рівня дозування,
- докладна інформація щодо приготування досліджуваноїречовини,
- докладна інформація застосування досліджуваної речовини,
- обґрунтування вибору маршруту введення,
- методи перевірки того, що досліджувана речовина досяглазагального кровообігу або цільової тканини, у випадкузастосування,
- перехід від концентрації досліджуваної речовини уїжі/питній воді (в мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг масатіла/день), у випадку застосування,
- докладна інформація щодо якості їжі і води,
- детальний опис введення речовини та графіки забору зразків,
- методи підготовки мікроскопічних препаратів,
- методи вимірювання токсичності,
- критерії оцінювання мікроядерних незрілих еритроцитів,
- кількість проаналізованих клітин на одну тварину,
- критерії віднесення дослідження до позитивного,негативного, або сумнівного розряду.
Результати:
- ознаки токсичності,
- доля незрілих еритроцитів у загальній кількостіеритроцитів,
- кількість мікроядерних незрілих еритроцитів, наведенаокремо для кожної тварини,
- середні +- стандартні відхилення мікроядерних незрілихеритроцитів на групу,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз та застосовані методи,
- паралельні та історично встановлені дані негативнихконтрольних груп,
- дані паралельних позитивних контрольних груп.
- Обговорення результатів.
- Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Heddle, J.A., (1973) A Rapid In Vivo Test for ChromosomalDamage, Mutation Res., 18, p. 187-190.
(2) Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res.,31, p. 9-15.
(3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B.,Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). TheInduction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. MutationRes., 123, p. 61-118.
(4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone,M.F. and Heddle, J.A., (1990) The In Vivo Micronucleus Assay inMammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S.Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res.,239, p. 29-80.
(5) MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M.,(1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen forChromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. В'Developments in Science and Practice of Toxicology', Ed.A.W.Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam,p. 555-558.
(6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H.,Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D., (1987)Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in MammalianBone Marrow Erytrocytes. Mutation Res., 189, p. 103-112.
(7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby,M.E., (1990) The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test:Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and PermitsIntegration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14,p. 513-522.
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. andIshidate, M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with MousePeripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-CoatedSlides. Mutation Res., 245, p. 245-249.
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test,(1992) Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytesby Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res.,p. 278, 83-98.
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test(CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of theEnvironmental Mutagen Society of Japan), (1995) Protocolrecommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleustest. Mutagenesis, 10, p. 153-159.
(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D.,Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F.B., Pacchierotti,F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) InVivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312,p. 293-304.
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal,generalised sampling time of 30 +- 6 h after double dosing in themouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10,p. 313-319.
(13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A.,Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G.,Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report ofBritish Toxicology Society/UK Environmental Mutagen SocietyWorking Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays.Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) AnApplication of Acridine Orange Fluorescent Staining to theMicronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241-247.
(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) ASimple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA inErythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res.,120, p. 269-275.
(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automatedbone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91-104.
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size forthe estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyteratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347,p. 97-99.
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A.,Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990) In Vivo CytogeneticsAssay. В: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMSRecommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines forMutagenicity Testing. Report, Part I, revised. CambridgeUniversity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne,Sydney, p. 115-141.
(19) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett,G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. andSavage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo CytogeneticAssays. В: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation ofMutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines forMutagenicity Testing. Report Part III. Cambridge University Press,Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184-232.
B.13/14. МУТАГЕННІСТЬ: ТЕСТ НА ЗВОРОТНУ МУТАЦІЮ
З ВИКОРИСТАННЯМ БАКТЕРІЙ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 471,Бактеріальний Тест на Зворотну Мутацію (1997).
1.1. ВСТУП
Для бактеріального тесту на зворотну мутацію використовуютьсяштами тифозної сальмонели та кишкової палички, що потребуютьамінокислоти для виявлення точкових мутацій, які спричиняютьзаміну, додавання чи делецію однієї або кількох пар основ ДНК(1)(2)(3). Принцип бактеріального тесту на зворотну мутаціюполягає у виявленні мутацій, що повертають до початкового станумутації, присутні в піддослідних штамах і відновлюютьфункціональну властивість бактерії синтезувати необхіднуамінокислоту. Бактерії-ревертанти виявляють за їх здібністю дозростання за відсутності амінокислоти, якої потребує материнськийпіддослідний штам.
Точкові мутації є причиною багатьох генетичних хвороб людиниі є суттєві докази того, що точкові мутації в онкогенах ігенах-супрессорах соматичних клітин, пов'язані з утворенням пухлину людини і піддослідних тварин. Бактеріальний тест на зворотнумутацію швидкий, недорогий, має відносно легкий механізмпроведення. Багато з піддослідних штамів мають декількахарактеристик, які роблять їх більш чутливими для визначеннямутацій, включаючи чутливі послідовності ДНК на ділянках реверсії,збільшену проникність клітин для великих молекул та знищеннясистем репарації ДНК або посилення вразливих для небезпечнихвпливів процесів репарації ДНК. Специфічність піддослідних штамівможе надати деяку корисну інформацію щодо типів мутацій, щовикликані генотоксичними реагентами. Для бактеріального тесту назворотну мутацію наявна велика база даних результатів для широкогодіапазону структур, а також розроблені усталені методології длятестування хімічних речовин з різними фізико-хімічнимивластивостями, включаючи летючі складові.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Тест на зворотну мутацію як тифозної сальмонели , так ікишкової палички виявляє мутацію в штамах, що потребуютьамінокислоти (гістидин або триптофан відповідно) для розробкиштаму, незалежного від зовнішнього постачання амінокислоти.
Мутагени заміщення пари основ є реагентами, які спричиняютьбазові зміни в ДНК. У тесті на зворотну мутацію ця зміна можевідбуватися як на ділянці вихідної мутації, так і на другійділянці бактеріального геному.
Мутаген, що викликає мутації зі зсувом рамки: реагенти, щоспричиняють додавання або делеції однієї чи більше пар основ уДНК, змінюючи, таким чином, рамку зчитування в РНК.
1.3. ПОЧАТКОВИЙ РОЗГЛЯД
Для бактеріального тесту на зворотну мутацію використовуютьклітини, що відносяться до прокаріотів, які відрізняються відклітин ссавців такими показниками, як поглинання, метаболізм,хромосомна структура та процеси репарації ДНК. Дослідження, щопроводяться in vitro, зазвичай вимагають використання екзогенногоджерела метаболічної активації. Система метаболічної активації invitro не може повністю імітувати умов функціонування організмуссавців in vivo. Таким чином, тест не надає повної інформації промутагенний і канцерогенний потенціал речовини при застосуванні доссавців.
Бактеріальний тест на зворотну мутацію, зазвичай,застосовується в якості початкового обстеження на генотоксичнуактивність та, зокрема, інтенсивності стимуляції точкових мутацій.З обширної бази даних видно, що велика кількість хімічних речовин,які є позитивними в цьому тесті, також проявляють мутагеннуактивність в інших тестах. Є приклади мутагенних реагентів, що невиявляються під час цього тесту, причини цих недоліків можнавіднести на рахунок специфічної природи визначеної кінцевої точки,різниці в метаболічній активації, або різниці в біодоступності. Зіншого боку, фактори, що підвищують чутливісь бактеріального тестуна зворотну мутацію, можуть призвести до переоцінки мутагенноїактивності.
Бактеріальний тест на зворотну мутацію може не підходити дляоцінки певних класів хімічних речовин, наприклад, сполук з високимбактерицидним ефектом (наприклад, певних антибіотиків) і тих, яківважаються (або відомі) як такі, що особливим чином змінюютьсистему реплікації клітин ссавців (наприклад, деякі топоізомеразніінгібітори та певні нуклеозидні аналоги). В таких випадках тестина мутацію ссавців можуть бути більш доцільними.
Хоча багато сполук, що дають позитивний результат у цьомудослідженні, є канцерогенами ссавців, це співвідношення не єабсолютним. Воно залежить від класу хімічних речовин, і єканцерогени, що не виявляються за допомогою цього дослідження,оскільки вони діють через інші, негенотоксичні, механізми, щовідсутні в бактеріальних клітинах.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Суспензії бактеріальних клітин піддають впливу досліджуваноїречовини як в присутності екзогенної системи метаболічноїактивації, так і за її відсутності. У чашковому методі включенняці суспензії змішуються з агаровою накладкою та одразу поміщаютьсяу чашку на мінімальний шар субстрату. У методі преінкубаціїпіддослідна суміш вирощується, а потім змішується з агаровоюнакладкою перед тим, як помістити її у чашку на мінімальний шарсубстрату. Для обох технік після двох чи трьох днів вирощуванняколонії-ревертанти підраховуються та порівнюються з кількістюспонтанних колоній-ревертантів у чашках для контролю розчинника.
Для здійснення бактеріального тесту на зворотну мутаціюописано декілька процедур. Серед цих загально використовуванихметодів є чашковий метод включення (1)(2)(3)(4), методпреінкубації (2)(3)(5)(6)(7)(8), метод флуктуації (9)(10) та методтимчасового призупинення (11). Також описані модифікації методівдля проведення тестування на газах і пароподібних речовинах (12).
Процедури, описані в межах методу, мають відношення перш завсе до чашкового включення та методів преінкубації. Обидва з нихпридатні для проведення експериментів як з метаболічноюактивацією, так і без неї. Деякі речовини можна визначити більшефективно, використовуючи метод преінкубації. Ці речовини належатьдо класів хімічних речовин, які включають аліфатичні нітрозаміникороткого ланцюга, двохвалентні метали, альдегіди, азобарвники тадіазосполуки, піролізідинові алкалоїди, сполуки та нітросполукиалілу (3). Також визнано, що певні класи мутагенів не завждивизначаються при використанні стандартних процедур, таких, якчашковий метод включення або метод преінкубації. Це явищерозглядається як "вийнятки", і для визначення цих мутагенівнаполегливо рекомендується використання альтернативних процедур.Можна ідентифікувати наступні "винятки" (разом з прикладамипроцедур, які можуть використовуватись для їх визначення):азобарвники та діазосполуки (3)(5)(6)(13), гази та летючі хімічніречовини (12)(14)(15)(16) та глікозиди (17)(18). Відхилення відстандартної процедури має бути науково виправданим.
1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.5.1. Підготовка
1.5.1.1. Бактерії
Свіжі культури бактерій вирощують до пізньої експоненційної 9або ранньої стаціонарної фази росту (приблизно 10 клітин на мл).Культури в пізній стаціонарній фазі використовувати непотрібно.Необхідно, щоб культури, які використовуються для експерименту,містили високий титр життєздатних бактерій. Титр може виявлятисязавдяки історично встановленим даним з контролю кривих росту або впроцесі кожного аналізу шляхом визначення кількості життєздатнихклітин під час чашкового експерименту.
Рекомендована температура вирощування - 37 град.C.
Потрібно використати щонайменше п'ять штамів бактерій. Вонимають включати чотири штами тифозної сальмонели (TA 1535; TA 1537або TA97a або TA97; TA98; та TA100), які продемонстрували своюнадійність і репродуктивну реактивність під час лабораторнихдосліджень. Ці чотири штами тифозної сальмонели мають пари основгенетичного коду в первинній реверсивній ділянці і, як відомо,можуть не визначати певних окислюючих мутагенів, реагентівперехресного зшивання та гідразинів. Такі речовини можна визначитиза допомогою штамів кишкової палички WP2 або тифозної сальмонелиTA102 (19), які мають пару основ кислотної обробки в первиннійреверсивній ділянці. Таким чином, рекомендованою комбінацієюштамів є:
- тифозна сальмонела TA1535, та
- тифозна сальмонела TA1537 або TA97 або TA97a, та
- тифозна сальмонела TA98, та
- тифозна сальмонела TA100, та
- кишкова паличка WP2 uvrA або WP2 uvrA (pKM101), або тифознасальмонела TA102.
Для виявлення мутагенів перехресного зшивання бажано включатиTA102 або додавати спеціальний штам репарації ДНК кишкової палички(наприклад, кишкова паличка WP2 або кишкова паличка WP2 (pKM.101))
Для препарату вихідної культури, перевірки маркерів тазберігання потрібно використовувати встановлені процедури. Потребав амінокислоті для росту повинна демонструватися для кожногозамороженого препарату вихідної культури (гістидин для штамівтифозної сальмонели та триптофан для штамів кишкової палички).Інші фенотипові властивості також мають бути перевірені; йдетьсяпро наступні характеристики: присутність чи відсутність R-плазмідтам, де це доцільно (тобто, резистентність штамів TA98, TA100 таTA97a або TA97, WP2 uvrA та WP2 uvrA (pKM101) до ампіциліну тарезистентність штаму TA102 до ампіциліну+тетрацикліну);присутність характерних мутацій (тобто, мутація rfa в тифознійсальмонелі через чутливість до кристалвіолету та мутація uvrAв кишковій паличці через чутливість до ультрафіолетовогосвітла) (2)(3). Штами також повинні призводити до спонтаннихчашкових підрахунків колоній-ревертантів в межах діапазонівчастоти, виявлених завдяки лабораторним історично встановленимданим з контролю та переважно в діапазоні, зазначеному влітературі.
1.5.1.2. Субстрат
Відповідний мінімальний агар (наприклад, що міститьмінімальний субстрат E Фогеля-Боннера та глюкозу) та верхній шарагару, що містить гістидин та біотин або триптофан,використовується для кількох поділів клітин.
1.5.1.3. Метаболічна активація
Бактерії повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини якв присутності відповідної системи метаболічної активації, так і заїї відсутності. Найчастіше використовується система доповненоїкоферментами пост-мітохондріальної фракції (S9), приготованої зпечінок гризунів, оброблених ензимами, включаючи такі агенти, якАрохлор-1254 (1)(2) або суміш фенобарбіталу та нафтофлавону(18)(20)(21). Пост-мітохондріальна фракція, зазвичай,використовується в концентраціях в діапазоні від 5 до 30% воб'ємному співвідношенні в суміші S9. Вибір та стан системиметаболічної активації можуть залежати від класу хімічних речовин,що випробовуються. В деяких випадках може бути доцільнимвикористання більш ніж однієї концентрації пост-мітохондріальноїфракції. Для азобарвників та діазосполук найбільш придатним можебути використання спрощеної системи метаболічної активації(6)(13).
1.5.1.4. Досліджувана речовина/Підготовка
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути задопомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщоце є доцільним, перед обробкою бактерій. Рідкі досліджуваніречовини можна додавати безпосередньо до досліджуваних системта/або розбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжіпрепарати, якщо тільки дані щодо стабільності не виявляютьприйнятності зберігання.
Не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовищаз досліджуваною речовиною, вони також повинні бути придатними длявиживання бактерій і сумісними з діяльністю S9(22). Якщовикористовується не добре відомий розчинник/середовище, їхвключення має підтверджуватись даними, що доводять їхнюсумісність. Рекомендується там, де можливо, використовуватиспочатку водний розчинник/середовище. При тестуванні речовин,нестабільних при взаємодії з водою, використовувані органічнірозчинники не мають містити води.
1.5.2. Умови тестування:
1.5.2.1. Піддослідні штами (див. 1.5.1.1)
1.5.2.2. Концентрація для впливу
При визначенні найвищої кількості досліджуваної речовини, щовикористовується, слід розглянути такі критерії, якцитотоксичність та розчинність в останній піддослідній суміші.
Можливо, буде корисним визначення токсичності танерозчинності в ході підготовчого експерименту. Цитотоксичністьможна визначити за зменшенням кількості колоній-ревертантів,очищенням чи зменшенням вихідного газону або ступенем виживаннякультур, підданих дії речовини. Цитотоксичність речовини можепідвищуватися в присутності систем метаболічної активації.Нерозчинність в останній суміші слід оцінювати як преципітацію занаявних умов тестування; вона має визначатись неозброєним оком.
Рекомендована максимальна концентрація для тестуваннярозчинних не цитотоксичних речовин складає 5 мг/чашку або5 мл/чашку. Для не цитотоксичних речовин, які не є розчинними приконцентрації 5 мг/чашку або 5 мл/чашку, один або більшевипробуваних варіантів концентрацій мають бути нерозчинними востанній піддослідній суміші. Досліджувані речовини, що єтоксичними вже при концентрації нижчій, ніж 5 мг/чашку або5 мл/чашку, мають досліджуватись до виявлення цитотоксичноїконцентрації. Осад не повинен змінювати результати оцінювання.
