Використання паперової індикаторної системи для ідентифікації та визначення біоварів C.diphtheriae
Для ідентифікації та визначення біоварів C.diphtheriae можуть використовуватись паперові індикаторні диски з глюкозою, сахарозою, сечовиною та крохмалем, з набору "Б" для ідентифікації ентеробактерій, що випускається фірмою "ІмБіо", м. Нижній Новгород. Виготовлення дисків з крохмалем та для визначення нітрат-редуктази наведено в розділі "Поживні середовища".
Готується густа суміш мікробів в об'ємі 1,2-1,5 куб. см стерильного 0,85% розчину хлориду натрію з pH 7,3 +- 0,1 і по 0,3 куб. см переноситься в 4 пробірки. В кожну пробірку занурюють диск з відповідним вуглеводом. Пробірки поміщають у термостат. Облік результатів проводять через 40 хвилин - 2 години для визначення уреазної активності і 5-24 години - для визначення сахаролітичних властивостей.
При наявності уреази білий диск з сечовиною забарвиться в рожево-малиновий колір, при відсутності - залишиться білим.
Диски з глюкозою та сахарозою при наявності відповідних ферментів змінять червоний колір на жовтий вже через 5-6 годин.
Для визначення крохмальної ознаки через 18-24 години інкубації в пробірку з відповідним субстратним диском додають індикаторний диск з йодом. Через 1-2 хвилини після цього, при негативній реакції з'являється темно синє забарвлення, при позитивній - колір розчину залишається без змін.
7. Імунобіологічні препарати та допоміжні матеріали
Якість поживних середовищ є важливою умовою при бактеріологічному дослідженні. Щоб отримати максимальну прорість та висіваність коринебактерій з матеріалу, що досліджується, необхідно створити оптимальні умови для росту та розмноження цих бактерій, збереження їх біологічних властивостей та умов для інгібіції супутньої мікрофлори. Це досягається шляхом використання універсальних поживних середовищ з доданням крові та телуриту калію. Телурит калію не перешкоджає росту коринебактерій і практично повністю інгібує ріст побічної мікрофлори. Коринебактерії здатні відновлювати телурит калію до металічного телуру (речовина чорного кольору) та накопичувати його всередині клітин. Тому на кров'яно-телуритових середовищах, які є також диференційно-діагностичними, колонії коринебактерій набувають сірого або чорного кольору.
В даний час, як основу для поживних середовищ, використовують поживні агари (СПА, еритрит-агар, АГВ).
Якщо ростові властивості поживного середовища не задовольняють вимог, агарові основи готують на бульйонах (СПБ, комерційний або виготовлений в лабораторних умовах, перевар Хоттінгера, 1% пептонна вода з вмістом амінного азоту 150-180 мг %).
Крім зазначених, для первинного посіву можна застосовувати комерційне середовище "Коринебакагар", яке не потребує додавання крові.
Для визначення токсигенних властивостей коринебактерій дифтерії випускається комерційне сухе середовище (ВТДМ), для визначення ферменту цистинази - комерційне сухе середовище для визначення ферменту цистинази, що є аналогом середовища Пізу. Кращою основою для приготування середовищ для визначення токсигенності та цистинази залишається мартенівський пептон, який готують в умовах лабораторії або у відділах поживних середовищ деяких НДІ.
При приготуванні поживних середовищ для визначення токсигенності використовують нормальні сироватки коня або великої рогатої худоби (ВРХ). Сироватки непридатні, якщо вони каламутні, гемолізовані (червоного, бурого кольору) або на них є позначення "для технічних цілей". Необхідно здійснювати попередній контроль усіх серій сироватки, що надходять до лабораторії, з токсигенним контрольним штамом на перевіреному середовищі на токсигенність і контроль на відсутність протидифтерійних антитоксичних антитіл в кінських сироватках в РПГА з дифтерійним антигенним діагностикумом (див. інструкцію до препарату).
Для відсіву колоній та культивування коринебактерій готують сироватковий агар на будь-якій поживній основі, що застосовується для культивування коринебактерій дифтерії.
Застосування звернутої сироватки недоцільне.
Для визначення сахаролітичних властивостей використовуються середовища на 1% пептонній воді.
Дозволяється використовувати тільки ті імунобіологічні препарати, що зареєстровані і дозволені до використання в Україні.
Перелік імунобіологічних препаратів, що зареєстровані і дозволені до використання в Україні надано в додатку 3.
Терміни та умови зберігання діагностичних препаратів, поживних середовищ, їх компонентів, фарб та індикаторів наведені в додатку 1.
Усі хімічні реактиви, що використовуються при приготуванні поживних середовищ, повинні бути кваліфікації ЧДА, якщо в рецептурі нема інших вказівок.
Виготовлення поживних середовищ
Загальні вимоги до виготовлення поживних середовищ викладені в ГОСТ 10.444.1-84.
7.1. Транспортні середовища
Транспортне напіврідке середовище (модифікація Ю.М.Фельдмана)
З сухих комерційних агарових препаратів готують середовище з розрахунку 1 г поживного агару на 100 куб. см перевару Хоттінгера або поживного бульйону. Вміст амінного азоту - 150-180 мг %, pH - 7,6.
Стерилізують в автоклаві при 121 +- 1 град. C протягом 20 хвилин або при 112 +- 1 град. C - 30 хвилин, асептично додають 10 куб. см сироватки та 1 куб. см 2% телуриту калію. Розливають в пробірки по 5 куб. см. Середовище вибірково контролюють на стерильність в термостаті протягом 48 годин.
Транспортне середовище ЕМЄС (AMIES)
(модифіковане Стюартом)
Дистильована або очищена вода 1 куб. дм
Агар 4 г
Розчинити, нагріваючи до кипіння, охолодити і внести такі інгредієнти:
NaCl 3,0 г
KCl 0,2 г
Na PO безводний 1,15 г
2 4
KH PO 0,2 г
2 4
Тіогліколат натрію 1,0 г
CaCl (1 % щойно приготований розчин) 10 куб. см
2
MgCl |6P O (1 % розчин) 10 куб. см
2 2
Перемішати до повного розчинення і додати 10 г деревного вугілля. Ретельно перемішати, розлити у пробірки об'ємом 7 куб. см, наповнюючи їх майже до вінець, і закрити пробками, що закручуються. При відсутності таких пробірок, використовують звичайні, зберігаючи той же принцип. Автоклавувати при 121 +- 1 град. C протягом 15 хвилин. Переконатися, що пробірки закриті щільно, і охолоджувати в перевернутому вигляді, щоб вугілля в середовищі розподілилось рівномірно. Кінцева pH середовища - 7,2.
Зберігати в темному прохолодному місці.
7.2. Середовища для первинного посіву досліджуваного матеріалу
Кров'яний агар
До 100 куб. см 2% розплавленого і охолодженого до 50 град. C поживного агару (pH - 7,6) стерильно додають 10 куб. см крові, ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі.
Кров'яно-телуритовий агар (КТА)
До 100 куб. см 2% поживного агару pH - 7,6 (3,5 або 5 г сухого поживного агару, виходячи з пропису на етикетці, на 100 куб. см різних бульйонів або дистильованої води), розплавленого і охолодженого до 50 град. C, додають 2 куб. см 2% розчину телуриту калію і 10-15 куб. см гемолізованої крові (або кров'яної суміші).
Поживні агарові основи розливають в стерильні флакони і стерилізують при 112 +- 1 град. C протягом 30 хвилин з попереднім прогрівом текучою парою при 100 град. C протягом 3 хвилин.
Пам'ятати! Поживні середовища для первинного посіву розливають у чашки Петрі шаром 3-4 мм.
Середовище Клауберга II
До 100 мл 3% поживного агару pH = 7,6, розплавленого і охолодженого до 50 град. C, додають 3 мл 2% розчину телуриту калію, 10 мл гліцеринової суміші та 50 мл "лакової" крові.
Приготування гліцеринової суміші. До 40 мл дефібринованої крові (або розбитих у фізіологічному розчині згустків, еритроцитарної маси) додати 20 мл стерильного (при температурі 110 град. C протягом 30 хвилин) гліцерину. Якщо кров, згустки, еритроцитарна маса, які використовуються, були не стерильні, то кров'яну гліцеринову суміш необхідно витримати в холодильнику при температурі 6 +- 2 град. C протягом 3 тижнів. Зберігають в умовах холодильника протягом 4-х місяців.
Приготування "лакової" крові. До 34 мл стерильної дистильованої води додати 16 мл дефібринованої крові (або розбитих у фізіологічному розчині згустків).
Приготування розчину телуриту калію (K TeO ) 2 3
Для приготування телуритових середовищ використовують комерційний препарат 2% розчин телуриту калію або його готують таким чином: у 100 куб. см дистильованої води розчиняють 2 г телуриту калію. Розчин стерилізують нагріванням на киплячій водяній бані протягом 30 хвилин і зберігають при кімнатній температурі. При випаданні осаду розчин знову нагрівають на водяній бані до повного його розчинення. При поганій розчинності реактиву готують 1% розчин, але відповідно додають його до середовищ у подвійному об'ємі. Сухий телурит калію зберігають в посудині з темного скла з притертою пробкою, зважаючи на його гігроскопічність та токсичність. Розчин перевіряють, виготовивши середовища, титрованою кількістю коринебактерій дифтерії і стафілокока у відповідності з описаною методикою.
Приготування крові, кров'яних і кров'яно-телурових сумішей
Використовують найрізноманітніші джерела одержання крові і кров'яних сумішей. Найкращою є дефібринована кров великої рогатої худоби, коней, свиней, овець, кролів. Кров забирають в стерильні бутлі з намистинами, монтуючи спеціальні системи з дотриманням усіх правил асептики. В окремих випадках кров збирають, зливаючи перші порції крові поза бутлем.
Можна використовувати кров людини (цитратну і з консервантами), готуючи з неї спеціальні кров'яні суміші. Необхідною умовою є зливання рідкої відстояної частини крові з цитратом чи іншими консервантами. В залишену еритроцитарну масу додають стільки ж, скільки злили рідкої частини крові, стерильної дистильованої води або фізіологічного розчину чи сироватки і телуриту калію.
Хорошою сировиною для отримання кров'яної суміші є еритроцитарна маса - відходи гамаглобулінового виробництва. Її заливають стерильною дистильованою водою або гліцерином з розрахунку 1/4-1/5 об'єму еритроцитарної маси і додають телурит калію.
Можна використовувати кров'яні згустки після відсмоктування сироватки для виробництва гамаглобуліну, згустки плацентарної крові, одержані безпосередньо від породіль, згустки абортної крові. Згустки збирають в стерильні бутлі зі скляними намистинами або битим склом і розбивають їх. Якщо не вдається розбити, згустки заморожують і розморожують (2-3 рази на добу ставлять в морозильну камеру), після чого вони легко руйнуються. Потім додають стерильний фізіологічний розчин або дистильовану воду 1/4-1/5 об'єму згустків і телурит калію.
Для кращого збереження крові чи кров'яної суміші до кожної порції об'ємом 10-15 куб. см, додають до 100 куб. см агару, доливають 1 куб. см 2% розчину телуриту калію. Таку суміш можна зберігати в холодильнику до 2-х місяців.
Для приготування кров'яного телуритового середовища на кожні 100 куб. см поживного агару додають від 11 до 16 куб. см кров'яної телуритової суміші і 0,1 куб. см 2% розчину телуриту калію. Приклад розрахунку: до 200 куб. см еритроцитарної маси, що лишилась після того, як злили 30 куб. см рідкої відстояної частини крові з консервантом, додали 30 куб. см сироватки або дистильованої води чи фізрозчину. Таким чином, отримали 230 куб. см кров'яної суміші, що складає приблизно 21 порцію, якщо додавати по 11 куб. см цієї кров'яної суміші до кожних 100 куб. см агару. Для консервації 230 куб. см кров'яної суміші необхідно додати 1/2 порції телуриту калію, тобто 21 куб. см. Надалі готувати кров'яні телуритові середовища потрібно наступним чином - до 100 куб. см агару додати 12 куб. см кров'яної телуритової суміші і 1 куб. см 2% розчину телуриту калію.
Сироватковий агар
До 100 куб. см розплавленого і охолодженого до 50 град. C поживного агару (pH 7,6) стерильно додають 10 куб. см сироватки. Перемішують, розливають в стерильні пробірки по 3-4 куб. см і скошують. Кожна партія сироваткового агару перевіряється на стерильність: декілька пробірок цієї партії ставлять на добу в термостат. У випадку проростання середовища знищується вся партія.
7.3. Середовища для визначення токсигенності
Пам'ятати! Поживний агар для визначення токсигенності, розлитий у флакони, вимагає багаторазового розплавлення, а тривала термічна дія значно погіршує його якість. При невеликому об'ємі роботи середовище доцільно розливати в пробірки по 17 куб. см (кількість, необхідна для приготування однієї чашки). При великому об'ємі роботи для одноразового використання розливають в стерильні флакони (70-80 куб. см).
Сухий поживний агар для визначення токсигенних властивостей дифтерійних мікробів (ВТДМ)
3 г сухого порошку ВТДМ розчиняють у 100 куб. см води, ретельно розмішують на слабому вогні, нагрівають до повного розплавлення агару при постійному помішуванні, кип'ятять протягом 5-7 хвилин під закритою ватно-марлевою пробкою, фільтрують через ватно-марлевий або тканинний фільтр. Розливають в стерильній посуд. Стерилізують одноразово текучою парою протягом 30 хвилин. Перед розливанням у чашки Петрі до розплавленого і охолодженого до 50 град. C середовища додають 20% сироватки.
Агар для визначення токсигенних властивостей C.diphtheriae з середовищем 199
Вода дистильована 300 куб. см, середовище 199 - 700 куб. см, агар ВТДМ - 30 г.
Агар ВТДМ розмішати у суміші дистильованої води і середовища 199, кип'ятити до повного розчинення 3-5 хвилин, профільтрувати через ватно-марлевий фільтр, прогріти 30 хвилин на водяній бані. Розлити по 20-22 куб. см в чашки або пробірки.
Середовище для визначення токсигенних властивостей C.diphtheriae на агарі АГВ
Вода дистильована - 90 куб. см, АГВ - 2,7 г, цистин (в 5%
розчині NaHCO ) - 2 куб. см
3
Наважку АГВ внести до дистильованої води, кип'ятити до
повного розчинення. Розчинити 0,5 г NaHCO в 10 куб. см
3
дистильованої води, внести 0,1 г цистину і кип'ятити до повного
розчинення цистину. 2 куб. см киплячого лужного розчину цистину
внести до розплавленого АГВ. Довести pH до 7,7. Розлити по 17 куб.
см в пробірки. Стерилізувати 10 хвилин при 112 +- 1 град. C.
Додати асептично 3 куб. см сироватки. Розлити у чашки по
20 куб. см.
Середовище для визначення токсигенних властивостей C.diphtheriae на основі середовища Пізу
Сухий поживний агар 2% (наважка за прописом на етикетці), м'ясо-пептонний бульйон - 100 куб. см, цистин (розчин в 1N HCl) - 1 куб. см.
Встановити pH 7,7-7,8 10 % розчином NaOH. Розлити по 17 куб. см в пробірки. Стерилізувати 10 хвилин при 112 +- 1 град. C. Охолодити до 50 град. C. Додати стерильно 3 куб. см сироватки. Розлити у чашки по 20 куб. см.
Виготовлення цистину. 1 г цистину розчинити в 20 куб. см 1N HCl (порошок додавати поступово розчиняючи). 1N HCl готують з фіксаналу або 10 куб. см HCl + 90 куб. см води.
Середовище для визначення токсигенних властивостей C.diphtheriae на мартенівському агарі
Мартенівський пептон - 0,5 куб. дм, м'ясна вода - 0,5 куб. дм, агар-агар 15-18 г (1,5%-1,8%), (1,5% агар використовують при додаванні 20% кінської сироватки, 1,8% - при додаванні 30% сироватки ВРХ), оцтовокислий натрій - 5 г, мальтоза - 3 г.
Агар-агар промивають протягом робочого дня у проточній водопровідній воді, ретельно відтискають і переносять в 1 куб. дм мартенівського бульйону (0,5 куб. дм мартенівського пептону і 0,5 куб. дм м'ясної води). Встановлюють pH 7,8-8,0 по папірцю з індикатором крезоловий червоний, який при цій реакції змінює жовтий колір на рожево-малиновий, шляхом додавання лугу (20% розчину NaOH) до бульйону. Бульйон кип'ятять протягом 10 хвилин, з моменту закипання, потім додають 0,5% (5 г на 1 куб. дм) оцтовокислого натрію, 0,3% мальтози (3 г на 1 куб. дм), перевіряють pH і, якщо потрібно, знову доводять до 7,8-8,0, кип'ятять протягом 15 хвилин, дають відстоятися в термостаті 2-3 години і фільтрують через тканинний або ватно-марлевий фільтр. Розливають в стерильний посуд і стерилізують одноразово текучою парою протягом 30 хвилин.
Поживну основу розплавляють на водяній бані при 90 град., охолоджують до 50 град. C і додають 20% кінської сироватки (1,5% агар) або 30% сироватки ВРХ (1,8% агар). Так, до агару, розлитого в пробірки, додають 2 куб. см кінської сироватки або 3 куб. см сироватки ВРХ, обпалюють краї пробірки і виливають (асептично) в стерильну чашку Петрі, рівномірно розподіляючи по дну чашки обережним похитуванням, не спінюючи середовища.
Мартенівський пептон
Свинячі шлунки, бажано свіжі, з пружними стінками, великою кількістю слизу і без катаральних явищ очищають від жиру (шлунки, просочені жовччю, відкидають), не промиваючи, подрібнюють у м'ясорубці. Фарш складають в бутлі місткістю 3-5 куб. дм і заливають підігрітою (40-50 град. C) водопровідною водою з розрахунку 1 куб. дм води на 300-500 г фаршу. Температура повинна бути 40 град. C. Додають 1% хімічно чистої соляної кислоти (питома вага 1,19). Масу добре перемішують і ставлять в термостат на 15-18 годин (або більше) при 37-40 град. C, або при 42-45 град. C на 18 годин (або більше). Під час процесу переварювання бутель струшують, спочатку через 1-1,5 годин, потім рідше. В добре перевареному пептоні на дні бутля лежить невеликий шар дрібного темного осаду.
Повноту осадження баластних білків перевіряють шляхом додавання до 5 куб. см профільтрованого пептону 1-2 крапель 10% NaOH. При цьому не повинна з'являтися каламуть.
Надосадову рідину обережно зливають, прогрівають при 80 град. C протягом 10 хвилин для зупинення дії ферментів. Стерилізують текучою парою 30 хвилин, зберігають в сухому прохолодному місці. Використовують не раніше ніж через 5 діб після приготування.
М'ясна вода подвійної концентрації
Знежирене, звільнене від сухожиль м'ясо середньої вгодованості пропускають через м'ясорубку, заливають гарячою водою в пропорції 1 куб. дм води на 1 кг фаршу і залишають на ніч в холодильнику при 6 +- 2 град. C, вранці суміш кип'ятять протягом 15-20 хвилин з моменту закипання. Готовий настій фільтрують, фарш віджимають, одержану м'ясну воду розливають в стерильні бутлі по 250-500 куб. см і стерилізують при 121 +- 1 град. C протягом 20 хвилин.
Паперові смужки з індикатором крезоловий червоний
0,1 г крезолового червоного розчиняють в 100 куб. см 96 град. C етанолу, залишають при 37 +- 1 град. C на 24 години, часто струшуючи. Наступного дня змочують в цьому розчині смужки фільтрувального паперу і швидко висушують. Яскраво-жовтий колір папірців у лужному середовищі переходить в різні відтінки червоного.
7.4. Середовища для визначення біохімічних властивостей
Середовище Пізу для визначення ферменту цистинази на мартенівському агарі
До 90 куб. см розплавленого 1,5% мартенівського агару (агар
Хоттінгера не допускається!), pH - 7,6, додають 2 куб. см 1%
розчину цистину, виготовленого на 0,1 N розчині H SO (або HCl),
2 4
ретельно перемішують і додають такий же об'єм 0,1 N розчину NaOH
для нейтралізації відповідної кількості кислоти. Розчини кислот і
лугів повинні бути взаємно відтитровані, можна використовувати
стандартні фіксанали. Розливають у флакони. Стерилізують при
температурі 112 +- 1 град. C 30 хвилин.
Агар з цистином розплавляють при 90 град. (не кип'ятіть!) для збереження цистину. До охолодженого до 40-45 град. C середовища асептично додають 1 куб. см 10% розчину оцтовокислого свинцю і 9 куб. см сироватки. Розливають в аглютинаційні пробірки стовпчиком висотою 3, краще 4 см.
Пам'ятати! При 50 град. C сироватка в присутності оцтовокислого свинцю згортається і середовище набуває молочного кольору, що ускладнює облік реакції.
Середовище Пізу для визначення ферменту цистинази (модифікація Ю.М.Фельдмана)
В 90 куб. см дистильованої води розчинити 3 г сухого поживного агару (краще агару "Д" або еритритагару) і прокип'ятити. Наважка сухого поживного агару розраховується, виходячи з пропису на етикетці, щоб його густина складала 1,5 %. Додати 2 куб. см 1,5% розчину цистину в 0,1 N розчині HCl з наступним підведенням pH середовища до 7,6 2 куб. см 0,1 N розчину NaOH (як вказано вище). Мутні або забарвлені серії агару не використовують. Середовище стерилізують 10-15 хвилин при 112 +- 1 град. C.
До розплавленого і охолодженого до 40-45 град. C середовища додають 1 куб. см 10% розчину оцтовокислого свинцю, 2 куб. см стерильного 10% розчину гіпосульфіту натрію, 10 куб. см сироватки. Розливають, як в попередньому рецепті.
Пам'ятати! Розчини 10% оцтовокислого свинцю і 10% гіпосульфіту натрію готують ex tempore, використовуючи стерильні пробірки і дистильовану воду, стерилізують текучою парою або на водяній бані при 80-90 град. C 30 хвилин.
Середовища для визначення ферменту уреази
Бульйон з сечовиною. До 100 куб. см стерильного м'ясо-пептонного або бульйону Хоттінгера (pH 7,0) додають 1 г сечовини і 0,2 куб. см 1,6% спиртового розчину індикатора крезолрот. Розливають над полум'ям по 2-3 куб. см в стерильні пробірки і стерилізують текучою парою протягом 10 хвилин.
Метод Заксе. Готується 2 реактиви: A і B.
РЕАКТИВ A:
Сечовина - 2 г.
96 град. етиловий спирт - 2 куб. см.
Дистильована вода - 4 куб. см.
РЕАКТИВ B:
0,2 % розчин фенолрот - 1 куб. см,
Однозаміщений фосфат калію (KH PO ) - 0,1 г.
2 4
Двозаміщений фосфат калію (K HPO ) - 0,1 г.
2 4
Хлористий натрій (NaCl) - 0,5 г.
Дистильована вода - 100 куб. см.
Реактив A не стерилізують і зберігають при температурі від 6 +- 2 град. C. Реактив B стерилізують в автоклаві текучою парою.
Середовище для відновлення нітратів в нітрити
До 100 куб. см поживного бульйону pH 7,3-7,5, вільному від
нітритів (перевірити реактивом Грісса або Касаткіна), додають
0,1% вільної від нітритів калійної селітри (0,1 г KNO ),
3
перевіривши ще раз на вміст нітритів, розливають по 5 куб. см в
промиті дистильованою водою не менше як 5 разів пробірки.
Стерилізують 15 хвилин при 121 +- 1 град. C.
Реактив Грісса
Розчин N 1 - 0,8% сульфанілова кислота в 5 N оцтовій кислоті.
Розчин N 2 - 0,6% диметилальфанафтамін в 5 N оцтовій кислоті. Перед проведенням реакції змішують рівні об'єми розчинів N 1 і N 2.
Пам'ятати! Реактив придатний для користування протягом 15 хв., безколірний, при появі рожевого забарвлення не використовувати.
Реактив Касаткіна
Розчин N 1 - 0,1 %-й розчин риванолу в дистильованій воді.
Розчин N 2 - 12 %-й розчин соляної кислоти (HCl).
Перед виконанням реакції змішують рівні об'єми розчинів N 1 та N 2. Реактивна суміш придатна для використання протягом 15 хвилин.
Приготування дисків для визначення нітрат-редуктази
Використовується 5% розчин нітрату натрію (NaNO ) на
3
дистильованій воді. Нітрат натрію і дистильована вода не повинні
вміщувати нітрити (перевірити реактивом Грісса). Стерильні смужки
фільтрувального паперу просочуються 5% розчином нітрату натрію у
стерильній чашці Петрі і підсушуються 24 години.
7.5. Середовища для вивчення сахаролітичних властивостей
До 100 куб. см гарячої дистильованої води послідовно додають 1 г пептону, 0,5 г NaCl, 0,1 куб. сміндикатора Андреде. Встановлюють pH - 7,4, кип'ятять 5 хвилин, фільтрують через паперовий або полотняний фільтр, доводять до попереднього об'єму гарячою дистильованою водою. До одержаної основи додають один з перелічених вуглеводів (сахароза, глюкоза) в кількості 1-0,5 г, крохмаль (розчинний) - 0,5 г.
Середовища розливають у пробірки по 2-3 куб. см, стерилізують при 112 +- 1 град. C 20 хвилин. Готові середовища з індикатором Андреде безбарвні або мають ледь рожевуватий відтінок.
Приготування дисків з крохмалем
Хроматографічний фільтрувальний папір нарізають смужками шириною 1 см, стерилізують 20 хвилин при 121 +- 1 град. C, висушують в сушильній шафі, просочують розчином крохмалю з індикатором в стерильній чашці Петрі, висушують в сушильній шафі при температурі 50-60 град. C і нарізають квадрати розміром 1 х 1 см. Зберігають у пеніцилінових флаконах або пробірках.
Розчин крохмалю з індикатором: до 8 куб. см 1% пептонної води з pH - 7,2 додають 1 г розчинного крохмалю та 2 куб. см 0,4% розчину фенолового червоного. Розчиняють на водяній бані при нагріванні до 90 град. при постійному помішуванні.
Індикатор Андреде
До 100 куб. см дистильованої води додають: 0,5 г кислого фуксину, 16,4 куб. см 4% розчину NaOH. Розчин на добу ставлять в термостат при 37 +- 1 град. C, періодично струшують, 2 доби витримують на світлі і після цього ховають в темне місце. Щойно приготований індикатор має солом'яно-жовтий колір або злегка рожевуватий відтінок, який зникає в процесі зберігання. Інтенсивно рожевий колір вказує на необхідність збільшення лугу при приготуванні до 18 куб. см.
Посуд повинен бути сухим, хімічно чистим, з темного скла, з притертою пробкою!
Приготування і стерилізація тампонів
Для приготування тампонів використовують дерев'яні або металеві палички (для транспортного середовища - з металу, що не окислюється), на один з кінців яких щільно накручують шар гігроскопічної вати (приблизно 120 мг). Тампони монтують в пробірки з корковими або ватними пробками так, щоб тампон не торкався дна пробірки. Стерилізувати в сушильній шафі при температурі 140-150 град. C протягом години або в автоклаві при температурі 112 +- 1 град. C протягом 30 хвилин.
Приготування тампонів, змочених 5% розчином гліцерину
При транспортуванні на великі відстані можна використовувати
тампони, попередньо змочені 5% розчином гліцерину (5% розчин
гліцерину готують на фізіологічному розчині, pH доводять до 7,6 за
допомогою 20% розчину Na HPO ). Тампони змочують із спільного
2 3
флакону з гліцерином, занурюючи тампон і відтиснувши зайву рідину
об стінки флакона. Стерилізують в автоклаві при температурі
112 град. протягом 30 хвилин.
8. Контроль поживних середовищ
Кожна партія приготованого середовища для первинного посіву матеріалу, визначення токсигенності, біохімічних і сахаролітичних властивостей, особливо при використанні нових поживних основ (промислового чи лабораторного виробництва) або нових інгредієнтів, підлягає бактеріологічному контролю через можливу нестандартність. Перелік штамів для контролю поживних середовищ надано в додатку 2.
Усі штами, що використовують для перевірки поживних середовищ повинні мати паспорти і підтвердження лабораторії вищого рівня.
Важливим моментом є попередній контроль основи середовищ на вміст амінного азоту.
8.1. Контроль якості кров'яно-телуритових середовищ встановлюють шляхом визначення:
а) ростових властивостей середовища;
б) інгібуючої активності відносно супутньої флори;
в) часу формування колоній.
При цьому використовують контрольний токсигенний штам або місцеві свіжовиділені токсигенні культури коринебактерій дифтерії з типовими культурально-морфологічними властивостями. Оцінка інгібуючої активності здійснюється за допомогою штаму S.aureus.
Культури C.diphtheriae і S.aureus (18-20 годинного росту), вирощені на сироватковому агарі, змивають фізіологічним розчином, підводять під оптичний стандарт мутності 10 од. - умовно 1 млрд. бактеріальних клітин в 1 куб. см суспензії. З вихідної стандартної суспензії в стерильних пробірках готують 10-кратні розведення (див. таблицю), ретельно перемішуючи і міняючи стерильну піпетку після кожного "кроку".
З 6-го і 7-го розведень по 0,1 куб. см суспензії C.diphtheriae (відповідно 500 і 100 мікр. кл.) вносять в 2 добре підсушені чашки з середовищем, насухо розтирають шпателем (для кожної чашки новий шпатель). На 2 інші чашки з середовищем таким же способом висівають S.aureus. Облік результатів здійснюють через 24-48 годин. Середовище визнається придатним для використання, якщо колонії C.diphtheriae формуються на поверхні досліджуваного середовища через 24 години інкубації у вигляді ізольованих колоній. При посіві 100 мікробних клітин - не менше 3-5 колоній C.diphtheriae та відсутності росту S.aureus на всіх засіяних чашках. При відсутності росту C.diphtheriae у посіві 500 і 100 м. кл. дослід необхідно повторити. Якщо результат буде такий же, середовище для роботи не придатне.
Схема приготування розведень культур C.diphtheriae і S.aureus
------------------------------------------------------------------
| N | Кількість |Об'єм культури, що вноситься| Кількість |
|пробірки| (куб. см) | | мікробів |
| |фізіологічного| | |
| | розчину | | |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 1 | 1,0 | 1,0 куб. см вихідної | 500000000 |
| | | суспензії | |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 2 | 4,5 | 0,5 з 1-ї пробірки | 50000000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 3 | 4,5 | 0,5 з 2-ї пробірки | 5000000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 4 | 4,5 | 0,5 з 3-ї пробірки | 500000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 5 | 4,5 | 0,5 з 4-ї пробірки | 50000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 6 | 4,5 | 0,5 з 5-ї пробірки | 5000 |
|--------+--------------+----------------------------+-----------|
| 7 | 2,0 | 0,5 з 6-ї пробірки | 1000 |
------------------------------------------------------------------
Вихідне розведення - 1 млрд. мікробних тіл в 1 куб. см
9
фізіологічного розчину (1 х 10 ).
8.2. Контроль середовищ для визначення токсигенності C.diphtheriae
Контроль середовищ для визначення токсигенності здійснюється шляхом випробування контрольним дифтерійним штамом, дотримуючись всіх етапів методики визначення токсигенних властивостей. Критеріями оцінки якості середовища є наявність преципітатів і час їх утворення. Придатними для роботи вважають ті серії середовища, при використанні яких у токсигенного штаму інтенсивні преципітати утворюються через 18-24 години після посіву "бляшками". Середовища (чи нові інгредієнти) не можна використовувати у випадку відсутності преципітатів або при їх появі у пізніші терміни.
8.3. Контроль середовищ для визначення біохімічних властивостей здійснюють шляхом визначення ступеня виразності і часу формування даної ознаки. В середовище Пізу, бульйон з сечовиною (або реактиви A і B), в середовища Гісса засівають петлею контрольні штами.
Зберігання штамів в умовах лабораторії
Контрольний токсигенний штам, та інші тест-штами одержують в УЦДСЕН або обласних СЕС. Штами повинні зберігатися відповідно вимогам Положення про порядок обліку, зберігання, обороту, відпуску та пересилки культур бактерій, вірусів, рикетсій, грибів, найпростіших, мікоплазм, бактерійних токсинів, отрут біологічного походження, затвердженого МОЗ СРСР 18.05.79.
Зберігати штами, в тому числі контрольний, можна:
а) на 10% сироватковому агарі при 6 +- 2 град. C (пересів кожні 14 днів);
б) в 0,1% напіврідкому сироватковому агарі, приготованому на мартенівському або іншому бульйоні (pH - 7,6) в холодильнику (пересів 1 раз в 2-3 місяці). Напіврідкий агар розливають по 8 куб. см в пробірки, в кожну додають по 0,5 куб. см кінської або 1,0 куб. см сироватки ВРХ. Якщо зберігати під шаром стерильного вазелінового масла, то пересів можна проводити 1 раз в 3 місяці.
в) в мартенівському бульйоні (pH - 7,6), під стерильним вазеліновим маслом (пересів кожні 3 місяці).
Контрольний токсигенний штам необхідно періодично засівати на кров'яний агар.
Примітка. Використання виробничого штаму PW8 та його варіантів забороняється.
Методика кількісного визначення амінного азоту
Принцип методу базується на блокуванні аміногруп формальдегідом при pH - 7,0 і титруванні лугом еквівалентної кількості карбоксильних груп. Початок і кінець титрування визначають потенціометрично.
Реактиви: 1. Їдкий натр 0,1 N розчин.
2. Соляна кислота 0,1 N розчин.
3. Формалін (10% розчин формальдегіду).
Перед кожним визначенням pH формаліну доводять до 7,0.
Хід визначення. Для аналізу використовують певний об'єм "В" рідкого зразка. "В" рівне:
- 3 куб. см для рідких гідролізатів низького ступеню розщеплення (0,1-0,2% амінного азоту);
- 1 куб. см - середнього ступеню розщеплення (0,3-0,6% амінного азоту);
- 0,5 куб. см високого ступеню розщеплення (0,7-1,3% амінного азоту);
- 3 куб. см для рідких поживних середовищ (0,1-0,2% амінного азоту);
- 10 куб. см для рідких екстрактів (0,1-0,2% амінного азоту).
В стакан місткістю 50 куб. см наливають об'єм "В" аналізованого розчину і доводять загальний об'єм дистильованою водою до 20 куб. см. Електроди потенціометра занурюють у досліджуваний розчин, pH якого доводять до 7,0 з допомогою 0,1 N розчину NaOH або 0,1 N розчину HCl. Під час визначення електроди повинні залишатись зануреними у розчин. До нейтралізованого розчину додають 2 куб. см нейтрального формаліну, перемішують і, не виймаючи електродів, титрують вміст 0,1 N розчином їдкого натру до pH - 9,1. Для титрування належить використовувати мікробюретку на 5 куб. см.
Вміст амінного азоту в досліджуваному зразку в % (Х) розраховують за формулою:
А х К х 1,4 х 100
Х = -------------------, де
В х 1000
А - кількість 0,1 N розчину NaOH в куб. см, використаного для титрування досліджуваної проби;
К - поправка до титру 0,1 N розчину NaOH;
1,4 - кількість амінного азоту в мг, еквівалентна 1 куб. см 0,1 N розчину NaOH;
100 - коефіцієнт перерахунку в %;
В - кількість рідкого зразка в куб. см, взята для аналізу;
1000 - коефіцієнт перерахунку мг в г.
9. Рецепти фарб
1. Лужна метиленова синька Лефлера:
Дистильована вода - 99 куб. см,
1% розчин їдкого калію (КОН) - 1 куб. см.
Профільтрований спиртовий розчин метиленового синього.
(3 г метиленового синього на 30 куб. см спирту) - 30 куб. см.
Фарбувати протягом 1-2 хвилин.
2. Оцтовокислий толуїдиновий синій
Толуїдиновий синій - 0,25-0,5 г.
Льодяна оцтова кислота - 2 куб. см.
96 град. етиловий спирт - 5 куб. см.
Дистильована вода - 10 куб. см.
Фарбувати протягом 3-5 хвилин.
3. Метил-віолет або кристал-віолет:
Метил-віолет або кристал-віолет - 0,25 г.
5% розчин оцтової кислоти - 100 куб. см.
Профільтрувати. Фарбувати протягом 5-10 хвилин.
4. Катіонний синій - О (бентіазоловий барвник)
5. Метиленовий блакитний технічний (тіазиновий барвник)
Для 4 і 5 барвників рецепт приготування однаковий:
Дистильована вода - 100 куб. см.
Профільтрований спиртовий розчин 4-го і 5-го барвника (1 г барвника на 10 куб. см спирту, витриманий в термостаті при 37 +- 1 град. C протягом доби).
Фарбувати протягом 1-3 хвилин.
Авторами інструкції є: Т.Г.Глушкевич, Н.М.Жеребко, В.В.Томчук, Л.М.Стратієнко (Український Центр державного санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України). О.А.Гладка, (Львівській НДІ епідеміології та гігієни). О.В.Деміховська (Київській НДІ епідеміології і інфекційних хвороб), Ю.М.Фельдман, Л.В.Маханьова (Житомирська обласна дитяча лікарня).
При підготовці інструкції використані матеріали "Инструкции по бактериологической и серологической индикации возбудителя дифтерии и его токсина" - додаток 5 до наказу МОЗ СРСР від 02.04.86 N 450 "О мерах по предупреждению заболеваемости дифтерией"; "Методических рекомендаций по применению модифицированной среды Пизу и индикаторных бумажных дисков для идентификации, биохимического типирования и определения токсигенности дифтерийных микробов" МОЗ СРСР N 28-6/31; "Руководства по лабораторной диагностике дифтерии" ВООЗ, Копенгаген, 1994. Clinical Microbiology of Coryneform Bacteria. Clinical Microbiology Reviews. Jan. 1997. p. 125-159.
Додаток 1
ТЕРМІНИ ТА УМОВИ
зберігання діагностичних препаратів, поживних середовищ, їх компонентів, фарб та індикаторів
------------------------------------------------------------------
| N | Найменування поживного середовища | Термін та умови |
| | або компоненту | зберігання |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 1 | Мартенівський пептон | Кімнатна температура|
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 2 | М'ясна вода подвійної концентрації | При температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 3 | Основи для кров'яного і кров'яно- | 2 місяці, |
| | телуритового агарів | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 4 | Кров'яно-телуритова суміш | 2 місяці, |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 5 | Кров'яний агар | 3 доби |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 6 | Кров'яно-телуритові середовища | 3 доби, |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 7 | Основи для транспортних середовищ | 1 місяць |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C, |
| | | 10 діб при |
| | |кімнатній температурі|
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 8 | Готове транспортне середовище | 10 діб |
| | | при 6 +- 2 град. C, |
| | | 3 доби при кімнатній|
| | | температурі |
|---+--------------------------------------+---------------------|
| 9 | Сироватковий агар | 2 тижні, |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|10 | Середовища для визначення | 1 доба |
| | токсигенності (чашки) | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|11 | Основа середовища Пізу | 1 місяць |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|12 | Середовище Пізу | Свіжого приготування|
|---+--------------------------------------+---------------------|
|13 | Телурит калію 2 % | 4 роки в ампулах |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|14 | Середовища з вуглеводами | перевірка 1 раз |
| | | на місяць |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|15 | Реактив Грісса (р-ни N 1 і N 2) | 2 місяці |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|16 | Реактив Касаткіна (р-ни N 1 і N 2) | 2 місяці |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|17 | Реактив Грісса (суміш р-нів) | 15 хвилин |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|18 | Реактив Касаткіна (суміш р-нів) | 15 хвилин |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|19 | Реактив A для визначення уреази за | при температурі |
| | методом Заксе | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|20 | Дифтерійний антитоксин (розчин) | до 7 діб |
| | | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|21 | Агар для визначення токсигенних | 2 тижні, |
| | властивостей з середовищем 199 | при температурі |
| | | 6 +- 2 град. C |
|---+--------------------------------------+---------------------|
|22 | Фарби (готові) | 1 місяць |
| | | у темному місці |
| | | у флаконах із |