Про заходи щодо покращання бактеріологічної діагностики дифтерії в Україні

Бактеріологічну діагностику дифтерії в Україні здійснює понад 1000 лабораторій закладів і установ охорони здоров'я. Матеріально-технічний стан лабораторної бази в окремих областях незадовільний. В Волинській, Закарпатській, Полтавській, Рівненській, Чернігівській областях та АР Крим майже половина лабораторій санепідстанцій і лікувально-профілактичних закладів, а в цілому в країні 8,4% лабораторій СЕС і 27% лабораторій ЛПЗ не мають необхідних умов для роботи зі збудниками III-IV груп патогенності.

Лабораторії недостатньо забезпечені мікроскопами, стерилізаторами, імунобіологічними препаратами, незважаючи на те, що основні препарати для діагностики дифтерії виробляються в Україні.

Бактеріологічні дослідження з метою діагностики і профілактики дифтерійної інфекції в країні складають питому вагу в загальному обсязі досліджень. В 1998 році їх виконано понад 3 млн.

Дані оперативної звітності, що надходять до МОЗ, свідчать про незадовільну організацію в лікувально-профілактичних закладах діагностичних бактеріологічних обстежень підлеглих контингентів хворих, які повинні проводитися в день звернення за медичною допомогою. В цілому в країні в 1998 році 14% хворих на дифтерію обстежено з порушенням терміну (на 2 день і пізніше). Незадовільна організація діагностичних бактеріологічних обстежень в Полтавській, Луганській, Івано-Франківській, Херсонській, Донецькій, Дніпропетровській, Чернігівській, Запорізькій, Одеській областях та м. Києві.

В роки найвищого підйому захворюваності показник бактеріологічного підтвердження клінічного діагнозу дифтерії перевищував 80%. З 1995 року почалось поступове зниження цього показника і в 1998 році зареєстровано найнижчий його рівень за всі роки епідемії - 66%, в тому числі у дітей - 83%, у дорослих - 62%. Вкрай незадовільний показник бактеріологічного підтвердження у м. Києві - 36%, Івано-Франківській області - 45%, АР Крим - 52%, Тернопільській, Волинській, Вінницькій областях - 57-61%.

Відмічається тенденція зростання питомої ваги захворювань з клінічним діагнозом - дифтерія, при яких виділяються нетоксигенні штами коринебактерій дифтерії. Якщо в 1994 р. питома вага таких випадків складала 4,6%, то в 1998 р. - 15%. Поодинокі випадки дифтерії з виділенням нетоксигенних штамів зареєстровані в 10 областях. В м. Києві такі випадки, навпаки переважають (47%). Серед 62 випадків дифтерії з виділенням нетоксигенного штаму в м. Києві в 53,2% був встановлений діагноз "реконвалесцент дифтерії", при цьому в 94% цей діагноз було встановлено особам, які звернулися за медичною допомогою в перші 4 дні від початку захворювання, в тому числі 61% в перші 2 дні.

Зниження показника бактеріологічного підтвердження клінічного діагнозу дифтерії в останні роки можливо пов'язане, з одного боку, з погрішностями діагностики як клінічної, так і бактеріологічної, з іншого - не можна виключити також зміни в популяції збудника (що підтверджується результатами молекулярно-генетичних досліджень).

З метою покращання бактеріологічної діагностики дифтерії, вирішення організаційних, методичних питань, підвищення ефективності протиепідемічних і профілактичних заходів, координації діяльності лабораторій закладів та установ охорони здоров'я з зазначених питань

Затвердити:

1. Інструкцію з бактеріологічної діагностики дифтерійної інфекції (додається).

2. Положення про Центральну референс-лабораторію МОЗ України з діагностики дифтерії (додається).

3. Покласти функції Центральної референс-лабораторії Міністерства охорони здоров'я України з діагностики дифтерії на бактеріологічну лабораторію Українського центру держсанепіднагляду.

3.1. Доповнити Список національних центрів та референс-лабораторій України, що забезпечують вивчення і зберігання штамів різних мікроорганізмів (додаток 1 до наказу МОЗ України від 14.12.92 N 183 "Про режим роботи з патогенними мікроорганізмами") пунктом 6.2. "Центральна референс-лабораторія МОЗ України з діагностики дифтерії".

4. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Київської та Севастопольської міських держадміністрацій, Головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, повітряному, залізничному транспорті:

4.1. Створити в лабораторіях, що проводять бактеріологічні дослідження на дифтерію (далі лабораторії) необхідні умови для додержання протиепідемічного режиму.

4.2. Забезпечити лабораторії необхідним обладнанням (стереоскопічні і біологічні мікроскопи, парові і сухоповітряні стерилізатори), імунобіологічними препаратами гарантованої якості, передбачити оснащення, в першу чергу, великих діагностичних лабораторій сучасними, високочутливими приладами для експрес-діагностики.

4.3. Забезпечити бактеріологічне обстеження хворих на дифтерію або з підозрою на це захворювання, а також з гострою ЛОР патологією протягом першої доби з моменту звернення за медичною допомогою і своєчасну доставку матеріалу до лабораторій.

5. Головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, повітряному, залізничному транспорті:

5.1. Провести в III-IV кварталах 1999 року семінари з питань сучасних методів лабораторної діагностики дифтерії для завідуючих епідеміологічними відділами, бактеріологічними лабораторіями, лікарів-бактеріологів, лаборантів та помічників епідеміологів. В подальшому такі семінари проводити щорічно.

5.2. Забезпечити відповідно до Положення про порядок обліку, зберігання, обороту, відпуску та пересилки культур бактерій, вірусів, рикетсій, грибів, найпростіших, мікоплазм, бактерійних токсинів, отрут біологічного походження, затвердженого МОЗ СРСР 18.05.79, збір, підтвердження та відправку штамів коринебактерій до Українського центру держсанепіднагляду для підтвердження і подальшого вивчення.

5.3. Посилити контроль за якістю бактеріологічної діагностики дифтерії в лабораторіях закладів та установ охорони здоров'я. Не рідше ніж 2 рази на рік перевіряти якість досліджень шляхом контрольних завдань, за результатами контролю проводити заходи щодо її покращання.

5.4. Інформацію про виконання цього наказу щороку до 1 лютого надсилати до Українського центру держсанепіднагляду.

6. Директору Київського науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних хвороб (Сельникова О.П.), головному лікарю Українського центру держсанепіднагляду (Некрасова Л.С.) продовжити роботу з вивчення збудників дифтерії на молекулярно-генетичному рівні і створенню національної колекції штамів.

Контроль за виконанням наказу покласти на начальників: Головного санітарно-епідеміологічного управління (Бережнов С.П.), Головного управління організації медичної допомоги дорослому населенню (Піщиков В.А.), управління організації медичної допомоги дітям і матерям (Гойда Н.Г.).

Проведення протиепідемічних заходів, специфічного лікування дифтерії вимагають здійснення своєчасної та якісної бактеріологічної діагностики. Виявлення збудника при захворюваннях з легким перебігом, які важко діагностувати клінічно, отримання матеріалів, що характеризують інтенсивність циркуляції збудника дифтерії серед населення в різних епідемічних умовах - необхідне коло проблем, що вирішуються в системі епідемічного нагляду бактеріологами.

Постановка діагнозу, який визначає необхідність введення хворому протидифтерійної сироватки, здійснюється клініцистами, бактеріологічне обстеження - додатковий метод, що дозволяє клініцисту поставити діагноз дифтерії, але не відкидати його лише на основі негативної бактеріології. У зв'язку з цим, бактеріологам необхідно використовувати всі методи, що прискорюють бактеріологічне дослідження і дають можливість видачі попередньої відповіді на першому етапі бактеріологічного дослідження.

Поживні середовища, що визначають ріст коринебактерій вже через 24 години, мікроскоп бінокулярний стереоскопічний (МБС) для вивчення колоній, постановка проби на токсигенність на першу добу росту колоній на чашках з первинним посівом - ось неповний перелік умов, що сприяють видачі попереднього результату вже на 1-2 добу дослідження і заключної відповіді про виділення збудника дифтерії (токсигенних коринебактерій дифтерії) на 3 добу дослідження.

В наступні дні (4-5 добу) можуть бути додані відомості про біохімічні властивості збудника дифтерії або видана відповідь про виділення нетоксигенних коринебактерій дифтерії або інших коринебактерій. При вивченні циркуляції збудника немає необхідності видавати попередню відповідь і бактеріологічне дослідження займає 3-5 діб. Негативна відповідь може бути видана на 2-гу або 4-ту добу від початку дослідження.

За сучасною класифікацією бактерій, рід Corynebacterium об'єднує декілька видів, які викликають захворювання у людей.

Міжнародними номенклатурами визначено вид Corynebacterium diphtheriae, куди входять токсигенні (збудник дифтерії) та нетоксигенні коринебактерії дифтерії (що не викликають захворювань з клінічними проявами дифтерії). За даними зарубіжних дослідників нетоксигенні C.diphtheriae асоціюються з септицемією, ендокардитом, септичним артритом, остеомієлітом та церебральним абсцесом.

C.ulcerans та C.pseudotuberculosis - природні патогени великої та малої рогатої худоби, коней. Можливість зараження людини C.ulcerans вкрай низька. Проте відомі випадки, коли при клінічній картині захворювання, схожій з такою при дифтерії, були виділені C.ulcerans токсигенні. Такі хворі частіше мешкали у сільській місцевості і мали контакт із хворими тваринами. Нетоксигенні C.ulcerans асоціюються з некротичними гранульомами і захворюваннями легень. За літературними даними інфекція, викликана C.pseudotuberculosis зустрічається серед населення дуже рідко, має прояви у вигляді казеозного лімфаденіту, який придбано як професійне захворювання. C.pseudotuberculosis часто є причиною захворювань овець, рідше кіз та коней.

C.xerosis та C.pseudodiphtheriticum (псевдодифтерійна паличка Гофмана) часто живуть в організмі людини. C.xerosis можуть бути чинниками кон'юнктивітів, які довго і в'яло протікають. Багато дифтероїдів - широко розповсюджені сапрофіти, тому орієнтовним критерієм оцінки якості роботи бактеріологів може служити вміння виділяти деякі дифтероїди зі слизових оболонок людини.

Мікроорганізми роду Corynebacterium - прямі або ледь зігнуті палички, не утворюють спор, нерухливі і мають різний ступінь плеоморфізму (різноманітність форм), грампозитивні, гетеротрофи, факультативні анаероби, каталазопозитивні.

Для морфології C.diphtheriae характерно: велика різноманітність у довжині клітин - від коротких кокоподібних до тонких булавоподібних, плеоморфізм - клітини можуть мати форму булави, сперматозоїда, ракетки, овоїда тощо, невпорядковане розташування, яке часто нагадує римські цифри X, Y, наявність гранул, може бути виражена внутрішньоклітинна смугастість, що є, очевидно, скупченням зерен волютину. Описана спорідненість волютину до метиленового синього і при обробці клітин цим барвником гранули або смужки - скупчення гранул - забарвлюються в синій колір, а протоплазма в деяких випадках може набути рожевуватого відтінку. Не доцільно фарбувати за Грамом або іншими складними методами для виявлення волютину, оскільки непроявлені властивості можуть невірно трактуватися бактеріологами.

Для C.ulcerans і C.pseudodiphtheriticum характерна схильність до паралелізму у розташуванні окремих клітин. 24-48-годинні культури цих видів мають найчастіше кокоподібну чи овоїдну форму.

Звичайно колонії коринебактерій на твердих поживних середовищах (наприклад, на кров'яному агарі) забарвлені в білий або жовтуватий колір, непрозорі, мають круглу форму, діаметр 1-2 мм. Найчастіше вони бувають м'якої маслянистої консистенції, деякі види роду коринебактерій можуть утворювати крихкі шорсткуваті R-колонії. Багато видів цього роду утворюють яскраві пігменти. Представники його не відзначаються високою ферментативною активністю. Оптимум росту - 37 град. C стійкі до низьких температур, чутливі до високих. Всі дезінфікуючі речовини у звичайних концентраціях (3-5%) вбивають коринебактерії дифтерії через 20-30 хвилин. Токсигенні C.diphtheriae більш чутливі до антибіотиків, ніж нетоксигенні. Можливе формування антибіотикорезистентних штамів. Результати тестування на чутливість in vitro показали, що коринебактерії чутливі до еритроміцину, пеніциліну, ампіциліну, цефуроксиму, хлорамфеніколу, ципрофлоксацину, гентаміцину та тетрацикліну; деякі штами стійкі до дії триметоприму та рифампіну. За даними зарубіжних авторів нетоксигенні C.diphtheriae чутливі до бета-лактамів (крім цефіксиму та цефподоксиму), цефлоксацину та ванкоміцину і тільки у декількох штамів була виявлена стійкість до моноцикліну, еритроміцину та рифампіну.

За структурою колоній і деякими біохімічними властивостями C.diphtheriae розподіляються на так звані колоніальні або культурально-біохімічні варіанти - gravis, mitis, belfanti та internedius.

Через 48 години росту на кров'яно-телуритовому агарі:

- варіанти mitis та belfanti утворюють сірі або чорні, круглі, гладкі, випуклі, з рівним краєм колонії, діаметром 1,5-2 мм, для них характерна варіабельність розміру колоній;

- варіант gravis звичайно утворює сірі або чорні матові сухі колонії, які можна пересувати петлею по поверхні агару, не порушуючи їх цілісності, крихкі, плоскі, гладкі, діаметром 1,5-2 мм;

- варіант intermedius утворює дрібні сірі прозорі колонії плоскі, гладкі, діаметром 0,5-1 мм.

Колонії C.ulcerans схожі на колонії C.diphtheriae варіанту gravis - чорні, матові, мають радіальну посіченість, у C.pseudodiphtheriticum з'являється характерний світлий обвідок. Але не можна спиратись лише на морфологічні властивості колоній або мікробної клітини. Описані випадки бактеріологічної гіподіагностики в 55% і 14,5% гіпердіагностики при ідентифікації лише за морфологічними властивостями.

При ідентифікації C.diphtheriae необхідно використовувати комплекс тестів, в першу чергу, визначення токсигенності - основної ознаки збудника захворювання, яке проводиться на першу добу росту підозрілих колоній на чашках первинного посіву матеріалу. Обов'язковим є імунохімічний тест на токсигенність (in vitro) - реакція дифузної преципітації в агарі, яка базується на взаємодії дифтерійного екзотоксину і специфічних антитіл дифтерійного антитоксину. За сучасними даними понад 20% штамів нетоксигенних в реакції преципітації, мають ген токсигенності, тобто потенційну змогу продукувати токсин, тому нетоксигенні штами, що виділені від хворих та в осередках дифтерії, необхідно вивчати за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Представники роду Corynebacterium не відзначаються високою ферментативною активністю, але визначення деяких біохімічних властивостей полегшує їх ідентифікацію (див. табл.).

Ферментативну активність мікроорганізмів вивчають за трьома тестами - визначення ферментів цистинази, уреази та нітратредуктази. Середовища Гісса (кольоровий ряд) використовуються в скороченому варіанті: глюкоза, сахароза, крохмаль. Як додатковий, можна використовувати тест на піразинамідазу.

Таким чином, ідентифікація C.diphtheriae базується на визначенні токсигенних та деяких біохімічних властивостей, з урахуванням морфології клітин (при необхідності) і колоній.

Бактеріологічні лабораторії СЕС Автономної Республіки Крим, обласних, Київської та Севастопольської міських, Центральних басейнової та на залізничному транспорті виконують такі функції:

2.1. Надання консультативної та практичної допомоги підвідомчим лабораторіям СЕС та ЛПЗ.

2.2. Підготовка спеціалістів з лабораторної діагностики дифтерії.

2.3. Вивчення обсягів досліджень на дифтерію підлеглих контингентів, оцінка їх достатності спільно з епідеміологами, аналіз показників якості діагностики, інформування Українського центру держсанепіднагляду МОЗ України двічі на рік до 20 січня та до 20 липня.

2.4. Визначення потреби в поживних середовищах та діагностичних препаратах, організація постачання підвідомчих лабораторій.

2.5. Контроль якості бактеріологічної діагностики дифтерії та впровадження заходів щодо покращання цієї роботи на території, що обслуговується:

- перевірка на місці;

- аналіз показників роботи лабораторій;

- контроль за якістю ідентифікації культур коринебактерій;

- видача контрольних задач;

- проведення паралельних досліджень.

2.6. Контроль усіх серій нормальної кінської сироватки на відсутність протидифтерійних антитоксичних антитіл, усіх серій комерційних поживних середовищ та інгредієнтів, а також вибірковий контроль якості поживних середовищ, що готуються у лабораторіях.

2.7. Відправка виділених штамів коринебактерій до бактеріологічної лабораторії Українського центру держсанепіднагляду МОЗ України для подальшого їх вивчення.

3.1. Навчити медичний персонал правилам взяття, посіву та доставки матеріалу до лабораторії.

3.2. Систематично контролювати правильність взяття і доставки матеріалу.

3.3. При прийомі матеріалу переконатися у тому, що він відібраний із зіву та носа (2 пробірки), при призначенні бактеріоскопії - окрема пробірка. Перевірити відповідність маркування на пробірці із записом в направленні.

3.4. У реєстраційному журналі треба вказати дату, час і правильність надходження матеріалу (порушення вказувати конкретно). Матеріал приймається і досліджується незалежно від встановленого порушення. Про порушення та необхідність повторного взяття матеріалу інформується відповідальна особа закладу, звідки надійшов матеріал. Якщо на протязі 3 годин матеріал повторно не надійшов до лабораторії, ситуація розцінюється як надзвичайна, про що сповіщається керівництву ЛПЗ (СЕС).

3.5. При виникненні в процесі дослідження підозри на C.diphtheriae, негайно інформуються відповідні спеціалісти СЕС і ЛПЗ. У реєстраційному журналі фіксується коли (дата, час) і кому (прізвище, посада) подано повідомлення. Оперативна інформація по телефону повинна супроводжуватися письмовою випискою на офіційному бланку.

3.6. Кожне приготування поживних середовищ повинно реєструватися у "Журналі приготування і контролю якості поживних середовищ" і контролюватися.

3.7. Кожен лікар повинен систематично аналізувати якість діагностики та вживати необхідні заходи щодо її поліпшення.

3.8. Порядок знищення отриманих патогенних культур визначається закладом вищого рівня управління.

3.9. Усі сумнівні, атипові штами (мазки первинної бактеріоскопії, якщо було призначено) терміново мають бути направлені до закладу вищого рівня управління (базову лабораторію) для подальшого вивчення або слід повідомити про необхідність одержання консультації.

3.10. Персонал лабораторії повинен суворо дотримуватись правил протиепідемічного режиму роботи.

Для взяття матеріалу використовують сухі або попередньо змочені 5% розчином гліцерину тампони.

В усіх випадках беруть слиз і плівки з ротоглотки та носа, в тому числі при дифтерії незвичайних локалізацій (око, вухо, рана, шкіра, піхва).

З ротоглотки матеріал беруть натще або не раніше, ніж через 2 години після прийому їжі, обертальними рухами з мигдаликів, дужок піднебіння, язичка і задньої стінки глотки, за допомогою шпателя, не торкаючись тампоном язика, слизової оболонки щік та зубів, при наявності нальотів, матеріал беруть з границі вражених і здорових тканин, злегка надавлюючи на них тампоном.

З носа матеріал беруть окремим тампоном, його вводять в один, а потім в інший носовий хід, не торкаючись крил носа зовні. (Попередньо ніс очищають від слизу сухим тампоном).

При прямій ларингоскопії матеріал (слиз, плівки) збирають безпосередньо з гортані. При оперативному втручанні відбирають слиз з інтубаційної трубки, а також плівки, подрібнені при операції.

Для первинної бактеріоскопії матеріал беруть окремим тампоном або до лабораторії направляють частину видаленої плівки, ретельно розтертої між скельцями.

Вражені ділянки шкіри попередньо витирають "промокальними" рухами стерильною марлевою серветкою або тампоном, змоченим стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію, обережно піднімають або відгортають струпи і кірки й після цього сухим тампоном відбирають матеріал.

При проведенні курсу лікування антибактеріальними препаратами матеріал слід брати не раніше, ніж через 3 дні після закінчення лікування, щоб виключити їх бактеріостатичну дію на збудника дифтерії.

При постмортальних дослідженнях матеріал відбирають з мигдаликів, гортані та порожнини носа.

Пробірки чітко маркують, скріпляють разом від кожної особи і позначають номер у відповідності з направленням (ф. 204-у), що додається, з обов'язковим зазначенням дати і часу відбору матеріалу, прізвища лікаря і номера телефону, за яким можна сповістити про попередній результат дослідження.

Тампони повинні бути доставлені до лабораторії не пізніше 3-х годин після взяття матеріалу. Якщо схема забору і доставки матеріалу передбачає посів на місці, то посіви доставляють в лабораторію негайно або термостатують при 37 град. C і доставляють в лабораторію не пізніше, ніж через 20-23 години, в осінньо-зимовий період в сумках із грілками.

Примітка. На тампонах і середовищах повинна бути вказана дата стерилізації (виготовлення).

Посів матеріалу. При діагностичних дослідженнях матеріал засівають на поверхню кров'яного агару (КА) та кров'яно-телуритового агару (КТА), розлитих у чашки Петрі. Необхідність використання кров'яного агару обумовлена тим, що на ньому буде виявлено й іншу мікрофлору. Крім того, деякі штами C.diphtheriae чутливі до телуриту калію, тому їх ріст може пригнічуватись на телуритовому агарі.

Для посіву матеріалу від осіб, що обстежуються за епідпоказаннями або з профілактичною метою, використовують тільки кров'яно-телуритові середовища, оскільки такий матеріал може вміщувати невелику кількість клітин C.diphtheriae, ріст яких на неселективних середовищах буде пригнічуватись іншими мікроорганізмами. Допускається використання транспортних середовищ.

Посів від однієї особи роблять на одну чашку, використовуючи при цьому одну половину поверхні середовища для посіву із ротоглотки з мигдаликів, а другу - для посіву з носа. При посіві матеріалу зі шкіри чи інших місць додають ще одну чашку. Чашки попередньо зігрівають.

Не допускається посів матеріалу від кількох осіб на одну чашку.

При посіві нативного матеріалу його втирають тампоном в окрему ділянку КА площею 2 х 1 см, потім аналогічно на КТА, при цьому тампон весь час повертають так, щоб перенести матеріал зі всієї поверхні тампону. Потім тим же тампоном штрихами засівають решту поверхні середовища (половину чашки). Такий метод дозволяє засіяти весь матеріал з тампона, отримати ізольовані колонії (чисту культуру) безпосередньо з чашки для подальшої ідентифікації. Засіяні чашки або пробірки з транспортним середовищем ставлять в термостат.

1. Колонії, що виросли на чашках, проглядають через 24 години після посіву матеріалу (якщо матеріал засівали у другій половині дня, то перегляд здійснюють також у другій половині дня) за допомогою МБС (окуляр 6, збільшення об'єктиву 2). Якщо ріст колоній відсутній на КА та КТА середовищах, матеріал для діагностичних досліджень треба відібрати повторно.

2. Чашки з підозрілими на коринебактерії дифтерії колоніями відбирають для подальшої ідентифікації культури за всіма тестами. Мікроскопію препаратів-мазків підозрілих колоній можна не проводити. Підозрілі колонії на кров'яно-телуритових середовищах через 24 години сірого кольору, випуклі, з рівними краями, в'язкі, через 48 годин - сірі або чорні з металевим блиском, рівними або ледь порізаними краями, в'язкі чи крихкі при дотику петлею.

3. З сумнівних колоній готують препарати-мазки. Коринебактерії дифтерії, які виросли на середовищах з інгібіторами росту (телурит калію), можуть бути вкорочені, потовщені, проте зберігають властиві їм поліморфізм та характерне розміщення. Якщо при мікроскопії виявляють палички, характерні для роду коринебактерій, то ці колонії відбирають для подальшої ідентифікації за всіма тестами. При роботі з колоніями слід користуватись бактеріологічною петлею діаметром 1-2 мм.

Виявлення при мікроскопії чистих культур коків, дріжджів, спорових паличок і т. п. дозволяє припинити дослідження на дифтерію. Діагностичні дослідження продовжують згідно наказу МОЗ від 22.04.85 р. N 535.

4. У випадку росту підозрілих однотипних колоній необхідно відразу ж приступати до їх вивчення за рядом тестів ідентифікації (токсигенні властивості, визначення цистинази) і виділити чисту культуру на скошений сироватковий або кров'яний агар. Токсигенні властивості вивчають не менше як у 2 ізольованих колоній шляхом посіву однієї половини кожної колонії на середовище для визначення токсигенності і непропаленою петлею на середовище Пізу, а другої половини колонії - у пробірку із сироватковим агаром для розмноження та збереження цієї культури. Враховуючи те, що в досліджуваному матеріалі можуть знаходитися одночасно токсигенні та нетоксигенні різновиди C.diphtheriae, необхідно при множинному рості підозрілих колоній вивчати токсигенні властивості якомога більшої кількості колоній (не менше як 20 колоній, змішуючи 5-6 колоній в одну бляшку).

5. Якщо виростає лише 1 колонія, її засівають на середовище для визначення токсигенності і, не прожарюючи петлю, - у стовпчик середовища для визначення цистинази. Для дальшої ідентифікації матеріал можна брати з бляшки через 48 годин росту або через 24 години при виявленні токсигенних властивостей культури.

6. Чашки з первинним посівом досліджуваного матеріалу знову ставлять в термостат на 24 години і проглядають їх повторно.

7. Висів з транспортного середовища здійснюють на тверді поживні середовища, зігріті при кімнатній температурі або в термостаті (15-20 хвилин), тампоном, віджатим об стінки пробірки, або петлею, забираючи матеріал з осаду.

1. Через 24 години при появі специфічних ліній преципітації на середовищі для визначення токсигенності, позитивній пробі на цистиназу досліджувану культуру ідентифікують як C.diphtheriae токсигенну і видають документовану відповідь.

Якщо специфічні лінії преципітації відсутні на середовищі для визначення токсигенності, чашки інкубують ще 24 години.

Якщо проба на цистиназу негативна, культуру ідентифікують як інший вид коринебактерій, а не C.diphtheriae.

2. Культуру з сироваткового агару (після визначення її чистоти), засівають на середовища для ідентифікації та визначення біохімічного варіанту (сахароза, глюкоза, крохмаль, ферментів уреази та нітратредуктази).

3. Чашки з первинним посівом досліджуваного матеріалу проглядають повторно через 36-48 годин інкубації в термостаті за допомогою МБС. При відсутності колоній, підозрілих на C.diphtheriae, видають заключну відповідь, що C.diphtheriae не виявлені. При наявності підозрілих колоній проводять ідентифікацію культури (див. пп. 2-5 другого дня дослідження).

1. При появі специфічних ліній преципітації на середовищі для визначення токсигенності (через 24 години проби на токсигенність 48 годинного росту первинного посіву), позитивній пробі на цистиназу видають документовану відповідь (див п. 1 третього дня дослідження).

2. Культуру, що виросла на сироватковому агарі (виділену з чашки у випадку 48-годинного росту), після визначення її чистоти засівають на середовища для визначення біохімічних властивостей (див. п. 2 третього дня).

3. Повторно (через 48 годин) враховують результати проби на токсигенність, поставленої на 2-й день дослідження. Одночасно проводять облік сахаролітичних властивостей та ферментативної активності, поставлених на 3-й день дослідження.

При відсутності специфічних ліній преципітації через 48 годин від постановки проби на токсигенність, але при позитивній пробі на цистиназу, глюкозу, негативній пробі на уреазу і сахарозу культуру ідентифікують як C.diphtheriae нетоксигенну, вказуючи біохімічний варіант.

Якщо у цистиназопозитивних коринебактерій проба на уреазу позитивна, слід також думати про забруднення дифтерійної культури перш за все C.pseudodiphtheriticum. Для розмежування культур необхідно зробити розсів на тверді поживні середовища, повторно виділити культури коринебактерій і визначити їх біохімічні особливості.

При виділенні токсигенних C.diphtheriae додатково видають відповідь про біохімічні властивості (через 72 години або 96 годин з моменту первинного посіву досліджуваного матеріалу).

Пам'ятати! Усі посіви інкубуються в термостаті при 37 +- 1 град. C.

1. Наявність специфічних ліній преципітації при визначенні токсигенних властивостей, позитивна проба на цистиназу, відсутність гідролізу сечовини, характерні культуральні та інші біохімічні властивості дозволяють зробити висновок про те, що виділена культура належить до виду C.diphtheriae, токсигенна, варіанту gravis, mitis, belfanti або internedius.

2. Відсутність специфічних ліній преципітації при визначенні токсигенних властивостей, позитивна проба на цистиназу, відсутність гідролізу сечовини, характерні культуральні та інші біохімічні властивості дозволяють зробити висновок, що виділена культура належить до виду C.diphtheriae, нетоксигенна варіанту gravis, mitis, belfanti або internedius.

3. При наявності ліній преципітації, ідентичних (таких, що зливаються) до специфічних ліній преципітації контрольного штаму C.diphtheriae, позитивних проб на уреазу, цистиназу, ферментації глюкози і крохмалю, відсутності ферментації сахарози, редукції нітратів в нітрити культуру відносять до виду C.ulcerans, токсигенний варіант. При негативній крохмальній ознаці - культуру ідентифікують як C.pseudotuberculosis.

При відсутності ліній преципітації при визначенні токсигенних властивостей і наявності всіх інших ознак, характерних для C.ulcerans або C.pseudotuberculosis, виділену культуру відносять до виду C.ulcerans або C.pseudotuberculosis нетоксигенних, але бактеріологічну відповідь вважають негативною. Ці штами слід направляти в головну установу для подальшого вивчення.

4. При ідентифікації культури як C.pseudodiphtheriticus або інших дифтероїдів бактеріологічну відповідь вважають негативною.

В основі методу визначення токсигенності коринебактерій (in vitro) покладено взаємодію між токсином і антитоксином, яка відбувається в твердих поживних середовищах в місцях оптимального кількісного співвідношення токсину, продукованого коринебактеріями дифтерії, що дифундує в агар, і антитоксичних антитіл, які містяться в антитоксині. В тих ділянках агару, де токсин зустрічається з антитоксином, випадає преципітат у вигляді білих ліній, "стріл" чи "вусів" (Елек-тест).

Слід суворо стежити за щільністю середовища, pH, режимом стерилізації, прозорістю, точним дотриманням цілого ряду технічних умов постановки проби.

Токсигенність C.diphtheriae визначають, як правило, в чистій культурі (відбираються окремі колонії і суміш колоній або культури з сироваткового косяка). Культури, забруднені сторонньою мікрофлорою, також можна випробовувати на токсигенність. При відсутності у цих випадках преципітатів у агарі дослід повторюють з виділеними чистими культурами.

Для постановки проби на токсигенність необхідно мати: стерильні чашки Петрі з рівним дном; поживне середовище для визначення токсигенності; паперові смужки; діагностичний дифтерійний антитоксин, або диски з антитоксином; контрольний токсигенний штам; нормальні сироватки тварин.

Засів проби. Якщо для визначення токсигенності використовуються паперові диски з дифтерійним антитоксином, засів культури проводять "бляшками" діаметром 0,7-0,8 мм навколо диску (на відстані 0,5 см від диску), чергуючи "бляшки" досліджуваної культури і контрольного штаму. На одну чашку можна ставити не більше 4 дисків.

Якщо використовують паперові смужки, "бляшки" досліджуваної культури висівають на відстані 0,7-0,8 см одна від одної і 0,5 см - від краю смужки.

При дослідженні на токсигенність половини колонії і суміші 5-6 колоній посів здійснюють "бляшками" з обох сторін смужки. Половину колоній (окремої, ізольованої, або по половині від двох колоній) розміщують на одній стороні чашки, а на другій - суміші колоній. На одну чашку слід висівати не більше 10 "бляшок", з них 6 "бляшок" досліджуваної культури, 4 - контрольного штаму. Контролем служить токсигенний штам 24 - 48-годинного росту. Чашки з посівом ставлять в термостат.

Облік результатів. Результати враховують через 18-24 та 48 годин. Критерієм оцінки специфічності преципітатів є злиття ліній преципітації досліджуваного штаму з лініями контрольного (токсигенного) штаму. У випадках, коли у контрольного штаму з'являється декілька ліній преципітації, специфічними слід вважати найбільш чіткі преципітати, які з'являються першими. Спостерігаються наступні варіанти в утворенні преципітатів:

1. Досліджувані C.diphtheriae, у яких утворюються преципітати, вважаються токсигенними, якщо ці лінії преципітації зливаються з відповідними специфічними лініями токсигенного штаму або ідуть на сполучення з ними.

2. Досліджувані C.diphtheriae вважаються нетоксигенними:

а) якщо лінії преципітації у досліджуваної культури відсутні при наявності специфічних ліній преципітації у контрольного штаму;

б) якщо лінії преципітації розміщені так, що їх кінці не можуть злитися з кінцями специфічних ліній у контрольного штаму, а ідуть навперехрест з ними (неідентичні);

в) лінії преципітації досліджуваного штаму зливаються з неспецифічними лініями контрольного штаму;

г) лінії преципітації досліджуваного штаму перехрещуються із специфічними лініями і зливаються з неспецифічними лініями контрольного штаму.

Іноді з'являються множинні неспецифічні лінії преципітації.

- Слабке утворення токсину штамом, що досліджується.

- Недостатня кількість інокуляту (потрібен масивний засів).

- Значна віддаленість "бляшки" від смужок (диску).

- Недостатня концентрація антитоксину на смужці (диску).

- Низька якість середовища: відхилення pH, висока концентрація агару в середовищі (ускладнюється дифузія), надмірний вміст заліза в агарі.

- Незадовільна якість нормальної кінської сироватки, що додається до середовища (рекомендується сироватка великої рогатої худоби), надмірне висушування поверхні агару;

недостатня прозорість агару.

- Незадовільна якість чашок Петрі (дефекти скла, подряпини, наліт і т.д.).

На середину поверхні застиглого середовища прожареним пінцетом кладуть стерильні диски або паперову смужку, просочену дифтерійним антитоксином. Чашки підсушують в термостаті протягом 15-20 хвилин, перевернувши догори дном і чашку, і кришку.

Смужки фільтрувального паперу нарізають розміром 1,5 х 8,0 см, загортають по 2-4 штуки в пакетик, стерилізують в автоклаві при 121 +- 1 град. C - 30 хвилин.

Змочують смужки в стерильній чашці Петрі. Для цього їх переносять з пакетика стерильним пінцетом і змочують 0,25 куб. см очищеного специфічною сорбцією дифтерійного антитоксину, який містить 500 МО в 1 куб. см. Щоб не було надлишків антитоксину на папірці, при перенесенні на агар обпаленим пінцетом, його злегка струшують.

ПЛР базується на вибірковій ампліфікації (збільшенні числа копій) специфічної ділянки ДНК коринебактерії, яка містить фрагмент А гену дифтерійного токсину, за допомогою ферменту - термостабільної ДНК-полімерази. Цей фермент приймає участь у синтезі протилежно орієнтованих взаємно комплементарних ланцюгів ДНК, починаючи з олігонуклеотидних праймерів. Праймери - штучно синтезовані короткі (5-20 нуклеотидів) одноланцюгові фрагменти ДНК, що комплементарні 3'-5' кінцям нуклеотидної послідовності tox-гену, яка ампліфікується. Праймери обмежують фрагмент ДНК, котрий буде мільйони разів скопійований в ході реакції.

Дослідження методом ПЛР включає три етапи:

1. Підготовка досліджуваного матеріалу:

- виділення ДНК (досліджуваний матеріал або культуру вносять в 1 куб. см дистильованої води, кип'ятять протягом 20 хвилин при 100 град. C, центрифугують; надосадова рідина містить ДНК);

- приготування реакційної суміші, до якої входять: буфер з іонами Mg, суміш чотирьох дезоксинуклеотидтрифосфатів, Taq-полімераза, суміш двох праймерів, внутрішній контроль, дистильована вода та виділена ДНК.

2. Власне полімеразна ланцюгова реакція. Для її виконання необхідний термостат з програмним забезпеченням (так званий термоциклер або ампліфікатор). Реакція складається із декількох циклів, що повторюються, в кожному з яких можна виділити три стадії:

- денатурація ДНК (реакційна суміш нагрівається до температури 95 град. C, розриваються водневі зв'язки і полінуклеотидні ланцюги, що складають структуру ДНК, роз'єднуються);

- зв'язування праймерів (праймери специфічно гібридизуються з відповідними послідовностями нуклеотидів tox-гену, обмежуючи специфічну ділянку ДНК, що відповідає за токсигенні властивості коринебактерії);

- ензиматична добудова ДНК (використовуючи праймери та вільні дезоксинуклеотидтрифосфати, термостабільна ДНК-полімераза добудовує ланцюг ДНК). Процес синтезу відбувається при 70-72 град. C протягом 20-40 сек.

3. Детекція продуктів ампліфікації в електрофоретичному аналізі. Для цього етапу необхідні джерело постійного струму, камера для електрофорезу, ультрафіолетовий трансілюмінатор, хімічні реактиви та спеціальні фарбники.

Новостворені ДНК-фрагменти, в більшості мають однакову молекулярну масу, тому в електрофоретичному полі вони будуть пересуватися в агарозному гелі з однаковою швидкістю і спостерігатимуться в ультрафіолетовому промінні у вигляді однієї смужки.

Агарозний гель готують із агарози та буфера, який використовується в електрофоретичній камері, охолоджують до 50-60 град. C, заливають в приготовані для цього форми і за допомогою спеціальних гребінців роблять в гелі "кишені" для нанесення зразка. Після застигання геля в "кишені" вносять підфарбований ампліфікат і проводять електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації протягом 45-60 хвилин. Гель обробляють бромистим етідієм і розглядають в УФ промінні.

Результати оцінюють у порівнянні з позитивним контролем. Якщо зразок, що досліджується, вміщує tox-ген, при фарбуванні бромистим етідієм він утворює специфічну електрофоретичну смужку, яка знаходиться на рівні смужки позитивного контролю. Негативні зразки не повинні утворювати будь-яких смужок. Для документування результатів ПЛР гель фотографують в ультрафіолетовому світлі на фотоплівку "Мікрат-300", яку проявляють звичайним способом, або застосовують апарати типу "Pollaroid".

ПЛР має деякі переваги перед традиційним методом визначення токсигенності C.diphtheriae:

- можливість повної автоматизації;

- швидкість отримання результатів (на протязі 4-6 годин);

- висока чутливість (дозволяє визначити навіть одного збудника в матеріалі, що досліджується);

- 100% специфічність методу (наявність у зразку, що досліджується, сторонньої мікрофлори не впливає на результат реакції, тобто ПЛР не потребує дослідження "чистої культури");

- можливість дослідження практично будь-якого матеріалу.

В той же час ПЛР потребує спеціальної техніки і реагентів, які дорого коштують, відповідних приміщень, а тому може бути виконана тільки в спеціалізованих лабораторіях. В Україні така лабораторія функціонує на базі Українського центру держсанепіднагляду.

Всі нетоксигенні C.diphtheriae, що виділені від хворих та контактних у вогнищах дифтерії необхідно надсилати до Українського центру держсанепіднагляду для подальшого вивчення в ПЛР.

C.diphtheriae, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis мають фермент - цистиназу, у C.pseudodiphtheriticum та інших дифтероїдів він відсутній.

В середовище, розлите у вузькі пробірки стовпчиком, засівають культуру уколом. При рості цистиназопозитивні коринебактерії, завдяки цистиназі, розщеплюють цистин, що міститься у середовищі, а сірководень, який при цьому утворюється, вступає у реакцію з оцтовокислим свинцем, що входить до складу середовища, останній переходить в сірчанокислий свинець - сполуку темно-коричневого кольору. Гіпосульфіт натрію, що входить до складу модифікованого середовища, прискорює утворення сірчанокислого свинцю та ідентифікацію цистинази. C.diphtheriae викликають не лише почорніння середовища по ходу укола, але й утворюють навколо нього "хмарку" темно-коричневого кольору на відстані 1 см від поверхні.

Результати враховуються через 24 години. Для отримання попередньої відповіді (через 3 години) необхідно внести в середовище багато культури (5-6 колоній). Рекомендується одночасно ставити контроль середовища.

Тест дозволяє диференціювати патогенні коринебактерії (негативний результат) від інших коринебактерій (позитивний результат). Фермент піразинамідаза каталізує гідроліз піразинаміда до піразинової кислоти та амонію.

Для постановки тесту в стерильну пробірку вносять 0,25 куб. см стерильної дистильованої води. Готують в ній густу (як "молоко") суспензію досліджуваної культури. Таким же чином готують суспензії позитивного та негативного контрольних штамів.

Стерильним пінцетом вносять в кожну пробірку по одній діагностичній таблетці Rosco N 598-21. Інкубують при 37 град. C протягом 4 годин.

Для обліку результатів у кожну пробірку додають по 1 краплі 5% водного розчину сульфату амонійного заліза (щойно приготованого або такого, що зберігався при - 20 град. C).

Патогенні коринебактерії (C.C.diphtheriae, pseudotuberculosis, ulcerans) не змінюють кольору суспензії у пробірці (негативний результат), вона залишиться безбарвною або жовтуватого кольору. Інші коринебактерії змінюють колір суспензії (позитивний результат) на червоний або оранжевий.

Псевдодифтерійні бактерії, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis і деякі інші мікроорганізми роду Corynebacterium мають фермент уреазу, здатний розщеплювати сечовину з утворенням аміаку і вуглекислоти. C.diphtheriae цим ферментом не володіють.

Пробу на уреазу можна ставити в двох варіантах: шляхом посіву на бульйон з сечовиною та за методом Заксе:

а) в бульйон з сечовиною засівають чисту культуру коринебактерій і ставлять в термостат. Облік результатів проводять через 18-24 години;

б) метод Заксе. Змішують (ex tempore) реактив A (1 частину) і реактив B (19 частин). Суміш розливають у вузькі пробірки по 0,1 куб. см і вносять кілька петель досліджуваної культури. Не можна брати конденсаційну воду, оскільки вона має лужну реакцію і може змінити pH середовища, а отже і колір індикатора. Пробірки ставлять в термостат на 30 хвилин.

Уреаза розщеплює сечовину, змінює pH середовища, що призводить до його почервоніння. Якщо фермент уреаза відсутній, зміна забарвлення середовища не відбувається. Рекомендується одночасно ставити контроль середовища.

Сахаролітичну активність коринебактерій дифтерії визначають на середовищах з вуглеводами: сахарозою, глюкозою і розчинним крохмалем.

Повну петлю культури вносять в кожну пробірку з середовищем. Облік результатів проводять через 24 години, а при негативній крохмальній ознаці - враховують тест через 48 годин перебування посівів в термостаті.

При зброджуванні вуглеводів, тобто при кислотоутворенні, спостерігається відновлення знебарвленого фуксину і середовище набуває малинового кольору.

Здатність коринебактерій дифтерії відновлювати солі азотної кислоти (нітрати) в солі азотистої кислоти (нітрити) є додатковою ознакою, що дозволяє ідентифікувати C.belfanti і C.ulcerans, у яких ця ознака негативна. Пробірки з середовищем засівають культурою, що вивчається, і інкубують в термостаті 24 години. Для контролю інкубують пробірку з середовищем, не засіяним культурою. Якщо нітрат відновлено в нітрит, то, при додаванні 3 крапель реактиву Грісса або Касаткіна до засіяного середовища, з'являється червоне забарвлення. Середовище в контрольній пробірці кольору не змінює.