Про затвердження методичних вказівок "Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів"

Тестування контрольних штамів проводять відповідно до описаних вище методів паралельно з дослідженням клінічних ізолятів. Результати визначення чутливості (МІК або діаметрів зон пригнічення росту) контрольних (референтних) штамів мікроорганізмів співставляють з відповідними показниками їх паспортної характеристики. Якщо вони відповідають паспортним характеристикам цих штамів, то умови постановки експерименту відповідали стандартним. Результати визначення чутливості клінічних ізолятів, отримані в цих умовах, слід визнати достовірними. Результати контролю реєструють в Журналі реєстрації досліджень і результатів визначення чутливості мікроорганізмів до хіміотерапевтичних препаратів (ф. 254/0, затверджена наказом МОЗ України від 04.01.01. N 1.

Допустимі діапазони значень МІК і діаметрів зон пригнічення росту для основних контрольних штамів наведені в табл. 19-22.

4.3. Контрольні штами, їх використання і зберігання. Як контрольні використовують штами, які відрізняються гнетичною стабільністю і добре вивченими фенотипічними характеристиками, включаючи рівень чутливості до АБП. Міжнародно визнаними є штами із Американській колекції типових культур мікроорганізмів АТСС (American Type Cultures Collection). Вибір референтних штамів для проведення контрольних досліджень визначається видом досліджуваного мікроорганізму:

Enterobacteriaceae - E.coli ATCC 25922,E.coli ATCC 35218;

Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. і інші НФБ - P.aeruginosa ATCC 27853;

Staphylococcus spp. - S.aureus ATCC 29213 - для методів серійних розведень і АТСС 25923 - для диско-дифузійного;

Enterococcus spp. - E.faecalis ATCC 29212 - для методу серійних розведень і скринінгу на високий рівень резистентності до аміноглікозидів;

Streptococcus spp. - S.pneumoniae ATCC 49619

Haemophilus spp. - H.influenzae ATCC 49247, H.influenzae ATCC 49766;

Neisseria gonorrhoeae - N.gonorrhoeae ATCC 49226

В умовах лабораторії штами повинні зберігатися так, щоб можливість мутацій і контамінації культури була мінімальною. Контрольні штами, призначені для тривалого зберігання, зберігаються в музеї (колекції) лабораторії, а для щоденної рутинної роботи використовують регулярно субкультивовані культури.

Для тривалого зберігання штамів існують два основні способи. Перший полягає в приготуванні суспензії мікроорганізмів в стабілізуючому розчині (16% гліцериновому бульйоні з кров'ю або без) і зберігання у замороженому стані при температурі -20 град. С і нижче в морозильній камері або в рідкому азоті. Інший метод тривалого зберігання контрольних штамів - у ліофілізованому вигляді.

Для нетривалого зберігання "робочих контрольних штамів" їх вирощують в пробірці зі скошеним агаром (триптиказо-соєвим або іншим аналогічним для "невибагливих мікроорганізмів", шоколадним, кров'яним або сироватковим для "вибагливих бактерій") і зберігають в холодильнику при температурі 2-8 град. С, субкультивуючи щотижня.

Якщо "робочі контрольні штами" виявилися контаміновані або результати визначення чутливості контрольного штаму не вкладаються в необхідні межі, і методика визначення чутливості не порушувалась, "робочий штам" повинен бути замінений на свіжий з музею (колекції). Перед використанням для контролю якості визначення чутливості його двічі субкультивують на відповідних ПС.

5.1. Принципи вибору АБП для тестування різних видів мікроорганізмів інтерпретації результатів. Для вибору АБП і включення його в дослідження необхідно знати про природну чутливість певних видів мікроорганізмів або їх груп, про розповсюдження серед них набутої резистентності, про клінічну ефективність АБП. Доцільно обирати АБП, які володіють відносно виділених мікроорганізмів природною активністю, клінічно підтвердженою ефективністю при відповідних інфекціях, препарати, що використовуються у клінічній практиці певної лікувальної установи в залежності від контингенту пацієнтів, особливостей етіологічної структури інфекцій і поширеності набутої антибіотикорезистентності.

АБП, чутливість до яких рекомендується визначати у різних видів мікроорганізмів, прийнято поділяти на дві групи: підлягаючі вивченню в першу чергу (I група) і додаткові (II група). Оцінка чутливості до препаратів I групи дозволяє отримати мінімально необхідну інформацію для обґрунтовування раціональної терапії інфекції, викликаної досліджуваним мікроорганізмом.

Для виявлення маркерів того або іншого механізму стійкості визначають детермінанти резистентності за допомогою оцінки чутливості до АБП. Наприклад, використання оксациліну як маркера стійкості Staphylococcus spp. до всіх бета-лактамних антибіотиків, пов'язаної з наявністю mecA гена.

При складанні наборів АБП для вивчення чутливості враховують закономірності перехресної резистентності бактерій до різних представників однієї групи АБП. В межах деяких груп АБП можна виділити підгрупи препаратів, відносно яких бактерії проявляють повну перехресну резистентність. В цих випадках достатньо оцінити чутливість тільки до одного АБП даної підгрупи.

Набір АБП для визначення чутливості різних видів мікроорганізмів в конкретних закладах може бути скоректований фахівцями цього закладу.

Інтерпретація результатів оцінки чутливості полягає в прогнозуванні результату антибактеріальної терапії на основі даних дослідження збудника інфекції in vitro у відповідності до належності досліджуваного мікроорганізму до однієї з трьох категорій:

- чутливий - штам пригнічується при концентраціях АБП, що створюються в органах і тканинах людини при рекомендованих лікувальних дозах. Лікування інфекції, викликаної мікроорганізмом, що належить до цієї категорії, як правило ефективне при застосуванні АБП в рекомендованих дозах;

- помірно стійкий - МІК АБП для штамів цієї категорії вище, ніж для чутливих, але знаходиться в межах, досяжних при рекомендованих режимах дозування. Лікування інфекції, викликаної мікроорганізмом, що належить до цієї категорії, може бути ефективним при застосуванні АБП у підвищених дозах, або при локалізації осередку інфекції в тих органах або тканинах, де через фізіологічні особливості створюються підвищені концентрації препарату;

- стійкий - штам не пригнічується при концентраціях АБП, що створюються в органах і тканинах при рекомендованих режимах дозування. Ці штами мають певні механізми резистентності. Лікування інфекції, викликаної мікроорганізмом, що належить до цієї категорії, буде неефективним.

5.2. Визначення чутливості представників родини Enterobacteriaceae. Представники родини Enterobacteriaceae є одними з провідних етіологічних агентів інфекцій, для яких характерна велика різноманітність можливих механізмів резистентності до АБП.

При дослідженні мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae слід використовувати окремі набори АБП для визначення чутливості збудників:

- некишкових інфекцій (крім інфекцій сечовивідних шляхів) - таб. 13;

- кишкових інфекцій (Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia spp.) - таб. 14;

- позалікарняних інфекцій сечовивідних шляхів (ІСШ) - таб. 15.

Необхідність такого розподілу пов'язана з особливостями фармакокінетики окремих АБП в шлунково-кишковому тракті і сечовивідних шляхах, а також відмінностями в їх клінічній ефективності.

Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості для штамів Enterobacteriaceae (граничні значення МІК АБП і відповідні діаметри зон пригнічення росту) наведені в таб. 2.

Оцінка антибіотикочутливості Enterobacteriaceae - збудників некишкових інфекцій. В основі лікування некишкових інфекцій, викликаних представниками родини Enterobacteriaceae, є бета-лактамні антибіотики. Практично повністю втратили значення при лікуванні не кишкових інфекцій викликаних мікроорганізмами родини Enterobacteriaceae такі препарати як незахищені аміно-, карбокси- і уреїдопеніциліни, а також цефалоспорини I покоління, а тому оцінка чутливості до них не має практичного значення. Альтернативою бета-лактамам є аміноглікозиди і фторхінолони.

Оцінювати чутливість збудників некишкових інфекцій до тетрацикліну, хлорамфеніколу і ко-тримоксазолу недоцільно, оскільки ці препарати є бактеріостатиками і істотно поступаються за ефективністю антибіотикам інших груп, крім того, до них значно поширена резистентність.

Характеристика препаратів першого ряду. Ампіцилін. Є типовим представником підгрупи амінопеніцилінів. Одержані результати можна повністю екстраполювати на амоксицилін (оцінювати чутливість до амоксициліну недоцільно, оскільки критерії чутливості до цього антибіотика для Enterobacteriaceae не обґрунтовані). Включення ампіциліну в набір для тестування Enterobacteriaceae важливо для оцінки фенотипу досліджуваного мікроорганізму і внутрішнього контролю якості.

Інгібіторозахищені амінопеніциліни Амоксицилін/клавуланат і Ампіцилін/сульбактам схожі за своїми антибактеріальними властивостями. Разом з тим, необхідно мати на увазі, що клавуланат є ефективнішим інгібітором бета-лактамаз.

Цефотаксим або цефтриаксон. Обидва цефалоспорини ідентичні за своїми антибактеріальнихми властивостями. Результати визначення чутливості до вказаних антибіотиків необхідно оцінювати, враховуючи можливу продукцію мікроорганізмами бета-лактамаз розширеного спектру (далі - БЛРС). При підтвердженні продукції БЛРС всі цефалоспорини, незалежно від конкретних результатів тестування, слід розглядати як клінічно недостатньо ефективні.

Цефтазідім не рекомендується для лікування інфекцій, викликаних Enterobacteriaceae, але він як високочутливий препарат до дії більшості БЛРС, може служити маркером продукції цих ферментів досліджуваним мікроорганізмом.

Гентаміцин. Результати, одержані при оцінці чутливості до гентаміцину, не можна екстраполювати на інші аміноглікозиди.

Фторхінолони не мають істотних відмінностей в рівні антибактеріальної активності відносно Enterobacteriaceae. Між цими препаратами (ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, нові "антипневмококові фторхінолони") спостерігають практично повну перехресну резистентність.

Характеристика додаткових препаратів. Включення в набір для дослідження додаткових антибіотиків визначається особливістю лікувально-профілактичного закладу. У важких випадках доцільно включати у дослідження наступні антибіотики.

Карбапенеми. Стійкість до цих антибіотиків серед Enterobacteriaceae зустрічається дуже рідко і, як правило, носить перехресний характер між окремими представниками групи, тому в дослідження достатньо включити лише один препарат.

Цефепім має значно більшу стійкістю до хромосомних бета-лактамаз класу С порівняно з цефалоспоринами III покоління, може також зберігати активність відносно частини продуцентів БЛРС.

Цефоперазон/сульбактам, тикарцилін/клавуланат. Препарати можуть зберігати активність in vitro відносно частини продуцентів БЛРС, але підтвердження про наявність або відсутність клінічної ефективності вказаних АБП при інфекціях, викликаних продуцентами БЛРС, відсутні.

Цефокситін - не має реального значення в лікуванні інфекцій, викликаних Enterobacteriaceae, проте може бути використаний для диференціації продуцентів БЛРС і AmpC: продуценти БЛРС - чутливі, продуценти AmpC - стійкі.

Амікацин. До амікацину зберігає чутливість значна частина штамів, стійких до гентаміцину. Оцінювати чутливість Enterobacteriaceae до інших аміноглікозидів недоцільно.

Для оцінки чутливості збудників інфекцій легкого і середнього ступенів тяжкості в дослідження слід включати цефалоспорини II покоління і оральні цефалоспорини II-III поколінь.

При визначенні чутливості мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae особливо важливим є виявлення штамів, що продукують бета-лактамази розширеного спектру. Для детекції БЛРС необхідне послідовне проведення скринінгу (виявлення підозрілих штамів) і підтверджуючих тестів відносно підозрілих штамів. Для ефективного скринінгу в рутинне мікробіологічне дослідження необхідно включати декілька цефалоспоринових антибіотиків, мінімальний набір повинен включати три цефалоспорини III покоління - цефотаксим, цефтриаксон і цефтазідім.

Методи скринінгу БЛРС і підтверджуючі тести викладені нижче.

У разі виявлення або підозри на продукцію БЛРС необхідно інформувати клініцистів про високу вірогідність клінічної неефективності терапії пеніцилінами і цефалоспоринами I-IV поколінь, незалежно від конкретних результатів визначення чутливості.

При монотерапії цефалоспоринами III покоління генералізованих інфекцій, викликаних мікроорганізмами груп Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Morganella, Providencia можливий розвиток резистентності в процесі лікування.

Інтерпретація результатів оцінки резистентності до хінолонів не викликає труднощів. Штами, стійкі до нефторованих хінолонів, можуть зберігати чутливість до фторованих. А тому можна вважати, що між ципрофлоксацином, офлоксацином, пефлоксацином, ломефлоксацином і сучасними антипневмококовими фторхінолонами (левофлоксацин, спарфлоксацин і моксифлоксацин) є повна перехресна резистентність.

Тестування Enterobacteriaceae - збудників кишкових інфекцій. Основними збудниками кишкових інфекцій є представники родів Shigella, Salmonella, Escherichia і Yersinia, що належать до родини Enterobacteriaceae, а також родин Spirillaceae (рід Campylobacter) і Vibrionaceae. При кишкових інфекціях визначення чутливості слід проводити тільки для штамів родини Enterobacteriaceae.

Перелік АБП, які підлягають дослідженню, обмежений і включає препарати з підтвердженою клінічною ефективністю. При генералізованих інфекціях, викликаних мікроорганізмами роду Salmonella (виділення збудника із стерильних локусів), в дослідження необхідно включати цефалоспорини III покоління (цефотаксим або цефтриаксон).

Додатково можна включити хлорамфенікол і тетрациклін, проте їх роль в лікуванні інфекцій шлунково-кишкового тракту на сьогодні є вкрай сумнівною. Разом з тим, результати визначення чутливості до цих препаратів можуть мати певне значення для епідеміологічного моніторингу.

Тестування Enterobacteriaceae - збудників позалікарняних інфекцій сечовивідних шляхів (ІСШ). Формування окремого набору антибактеріальних препаратів для оцінки чутливості збудників позалікарняних ІСШ доцільно при наявності значного потоку таких досліджень. Для тестування штамів Enterobacteriaceae, виділених при нозокоміальних ІСШ використовують той же перелік АБП, що і для визначення чутливості збудників інфекцій різної локалізації.

Виявлення БЛРС у штамів Enterobacteriaceae фенотиповими методами. Продукція БЛРС може бути практично у всіх видів родини Enterobacteriaceae. Враховуючи поширеність ферментів цієї групи, доцільно проводити скринінг усіх виділених в лабораторії штамів Enterobacteriaceae з подальшим використанням спеціальних підтверджуючих досліджень штамів, які за даними попереднього тестування проявляють знижену чутливість хоча б до одного з цефалоспоринів III покоління (МІК > 2 мг/л, або еквівалентне зменшення діаметра зони пригнічення росту - таб. 3). Для проведення скринінгу не потрібно проводити спеціальні дослідження, досить включити у перелік АБП декілька цефалоспоринових антибіотиків, навіть якщо використання їх як терапевтичних препаратів не планується. В основі скринінгу лежить аналіз даних, отриманих у рутинній практиці.

Найчутливішими до гідролізу БЛРС є цефподоксим і цефтазідім, а тому саме ці препарати доцільно включати в набір для визначення чутливості Enterobacteriaceae. При неможливості тестування цефподоксима, мінімальний набір цефалоспоринів III покоління, що використовуються для визначення чутливості грамнегативних мікроорганізмів, повинен включати цефотаксим, цефтриаксон і цефтазідім.

Чим більше цефалоспоринів використано для тестування, тим більш достовірними будуть результати виявлення БЛРС.

При виявленні штаму, підозрілого на продукцію БЛРС, рекомендується провести підтверджуючий тест. Всі фенотипічні тести для підтвердження продукції БЛРС є варіантами стандартних методів визначення чутливості до АБП і основані на інгібіції БЛРС клавуланатом. При постановці цих тестів проводиться порівняння чутливості досліджуваних мікроорганізмів до різних цефалоспоринів III покоління і до комбінації цих антибіотиків з клавулановою кислотою.

У диско-дифузійному методі використовують стандартні диски із звичайним вмістом цефотаксиму і цефтазідіму (30 мкг) або диск з цефподоксимом (10 мкг), а також диски, що містять комбінації: цефотаксим + клавуланат, цефтазідім + клавуланат (30/10 мкг) або цефподоксим + клавуланат (10/10 мкг). В дослідження доцільно включати одночасно і диски з цефотаксимом, і диски з цефтазідімом, і їх комбінаціями з клавуланатом. Методика постановки тесту стандартна. Відмінність в діаметрах зон пригнічення росту для дисків з цефподоксимом/клавулановою кислотою і цефподоксимом на 6 мм і більше, для дисків з цефотаксимом/клавулановою кислотою і цефотаксимом, цефтазідімом/клавулановою кислотою і цефтазідімом - на 5 мм і більше свідчить про продукцію штамом БЛРС. Результат є позитивним, якщо вказані відмінності отримані хоча б для однієї пари дисків. Для контролю якості дослідження використовують 2 штами (негативний і позитивний контролі):

- негативний контроль: при тестуванні контрольного штаму E.coli, не продукуючого бета-лактамаз, відмінності в діаметрах зон між дисками з інгібітором і без нього не повинні перевищувати 2,0 мм;

- позитивний контроль: при тестуванні контрольного штаму K.pneumoniae, продукуючого БЛРС, відмінності в діаметрах зон між дисками з цефподоксимом/клавулановою кислотою і цефподоксимом > 6 мм, з цефотаксимом/клавулановою кислотою і цефотаксимом > 3 мм, з цефтазідімом/клавулановою кислотою і цефтазідімом > 5 мм.

При використанні методу серійних розведень в бульйоні роблять подвійні серійні розведення препаратів в наступних діапазонах концентрацій:

цефтазідіму - від 0,25 до 128,0 мг/куб.дм,

цефтазідіму/клавуланату - від 0,25/4,0 до 128,0/4,0 мг/куб.дм;

цефотаксиму від 0,25 до 64,0 мг/куб.дм;

цефотаксиму/клавуланату - від 0,25/4,0 до 64,0/4,0 мг/куб.дм.

В дослідження доцільно включати обидва цефалоспорини і їх комбінації з клавулановою кислотою. Методика виконання дослідження - стандартна. Зниження МІК цефтазідіму або цефотаксиму не менше, ніж у 8 разів (на 3 послідовні двократні розведення) у присутності інгібітора, порівняно із значеннями МІК відповідних цефалоспоринів без інгібіторів, свідчить про продукцію штамом БЛРС. Для контролю якості дослідження використовують 2 штами:

- негативний контроль: при тестуванні контрольного штаму E.coli, не продукуючого бета-лактамаз, співвідношення МІК відповідних цефалоспоринів III покоління до МІК їх комбінації з клавуланатом має бути < 8;

- позитивний контроль: для штаму K.pneumoniae, продукуючого БЛРС, співвідношення значень МІК цефалоспоринів і МІК їх комбінацій з клавуланатом має бути > 8.

У якості підтверджуючого тесту може бути використаний і метод "подвійних дисків", в якому використовуються комерційні диски з цефалоспоринами III покоління і з амоксициліном/клавуланатом. Цей метод дозволяє виявити продукцію БЛРС за наявністю розширеної зони пригнічення росту навколо диска з будь-яким цефалоспорином III покоління напроти диска, що містить клавуланову кислоту (синергізм в ділянці перетину зон дифузії двох дисків, розташованих на невеликій відстані один від одного). Методика приготування мікробної суспензії, інокуляції і інкубації чашок не має відмінностей від стандартного ДДМ. Особливістю методу є те, що через 5-10 хв. після інокуляції на поверхню агару накладають диски з АБП: в центр - диск з клавулановою кислотою, зазвичай з комбінацією амоксицилін/клавуланат (20/10 мкг), з боків від нього на відстані 20 і 30 мм між центрами дисків - диски з цефтазідімом (30 мкг) і цефотаксимом (30 мкг). Використання двох дисків кожного АБП розташованих на різній відстані від диска з клавулановою кислотою, дозволяє підвищити ефективність виявлення БЛРС. Якщо досліджуваний мікроорганізм продукує БЛРС, зона пригнічення росту навколо диска з цефалоспорином III покоління буде "витягнутою" у бік диска з амоксициліном/клавуланатом ( мал. 1. Причиною цього є додаткове пригнічення росту мікроорганізму в тій зоні, куди дифундують і клавуланат, і цефалоспорин III покоління. Тест суто якісний і вимагає певних навиків при інтерпретації. Паралельно з аналізом досліджуваних культур тестують контрольні штами.

Мал. 1. Виявлення продукції БЛРС за допомогою методу "подвійних дисків".

5.3. Визначення чутливості P.aeruginosa, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. і інших неферментуючих бактерій (далі - НФБ). ДДМ стандартизований лише для P.aeruginosa і Acinetobacter spp. При дослідженні Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas spp. (крім P.aeruginosa) і інших НФБ перевагу слід віддавати методам серійних розведень. Примірний перелік АБП, що рекомендуються для визначення чутливості даної групи бактерій наведений в таб. 12. Оцінка антибіотикочутливості рідкісних видів НФБ вимагає індивідуального підходу.

Препарати першого ряду. Цефтазідім - один з основних АБП, що використовуються для лікування інфекцій, які викликає дана група мікроорганізмів.

Цефепім у ряді випадків зберігає активність відносно мікроорганізмів, стійких до цефтазідіму.

Гентаміцин, амікацин. Аміноглікозиди для монотерапії даної групи інфекцій не застосовуються, але є необхідним компонентом комбінованих схем терапії. Необхідність включення їх до переліку препаратів першого ряду пояснюється високою частотою стійкості до останнього антибіотика.

Ципрофлоксацин є препаратом вибору серед фторхінолонів при лікуванні даної групи інфекцій.

Меропенем та іміпенем характеризуються найбільшим рівнем активності відносно даної групи мікроорганізмів. Між ними відсутня перехресна резистентність, а тому їх доцільно включити до переліку.

Додаткові препарати. Азтреонам, цефоперазон за основними властивостями близькі до цефтазідіму.

Цефоперазон/сульбактам, тикарцилін/клавуланат - інгібітори не здатні пригнічувати активність більшості бета-лактамаз поширених серед P.aeruginosa, а тому комбіновані препарати не мають істотних переваг у порівнянні з вихідними антибіотиками. При інфекціях, викликаних Stenotrophomona maltophilia, клінічне значення має ко-тримоксазол і тикарцилін/клавуланат, оскільки мікроорганізм має природну стійкість до всіх бета-лактамів, крім тикарциліну/клавуланату.

Цефоперазон/сульбактам (а також Ампіцилін/сульбактам) можуть мати значення у лікуванні інфекцій, викликаних Acinetobacter spp., оскільки сульбактам має власну активність відносно вказаного мікроорганізму.

Через токсичність і високу частоту стійкості, застосування карбеніциліну, навіть для лікування інфекцій, викликаних P.aeruginosa, слід визнати недоцільним.

Граничні значення МІК антибіотиків (і відповідні діаметри зон пригнічення росту) відносно Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. та інших НФБ, що використовуються для інтерпретації результатів оцінки антибіотикочутливості, наведені в таб. 4.

5.4. Визначення чутливості Staphylococcus spp. Перш за все необхідно тестувати препарати, які мають основне клінічне значення: бета-лактами, макроліди, фторхінолони, аміноглікозиди і ванкоміцин. Рекомендований перелік АБП для визначення чутливості Staphylococcus spp наведений в таб. 18, критерії інтерпретації результатів визначення чутливості (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) - в таб. 5.

Препаратами вибору для лікування стафілококових інфекцій, викликаних S.aureus і коагулазанегативними стафілококами, є бета-лактамні антибіотики. Стійкість стафілококів до цих препаратів пов'язана або з продукцією бета-лактамаз, або з наявністю додаткового пеніцилінзв'язуючого білка - ПЗБ2а. Виявлення і диференціація цих двох механізмів резистентності дозволяє прогнозувати активність усіх бета-лактамних антибіотиків без оцінки чутливості до кожного з цих препаратів. При цьому необхідно враховувати наступні закономірності:

- штами Staphylococcus spp., які не мають механізмів резистентності, чутливі до всіх бета-лактамним АБП;

- бета-лактамази (пеніцилінази) Staphylococus spp. здатні гідролізувати природні і напівсинтетичні пеніциліни, крім оксациліну і метициліну. Чутливість або резистентність до бензилпеніциліну є індикатором активності природних і напівсинтетичних аміно-, карбокси- і уреїдопеніцилінів.

- інші бета-лактами з потенційною антистафілококовою активністю (антистафілококові пеніциліни, цефалоспорини I, II і IV поколінь і карбапенеми) зберігають активність відносно бета-лактамазопродукуючих штамів;

- штами Staphylococcus spp, які мають ПЗБ2а (метицилінорезистентні), клінічно стійкі до всіх бета-лактамних АБП. Маркером наявності ПЗБ2а є стійкість до оксациліну і метициліну.

Метицилін практично повністю витіснив з клінічної практики оксацилін, відповідно з'явився термін "оксацилінорезистентність", що є повним синонімом терміну "метицилінорезистентність".

Визначення чутливості Staphylococcus spp. до бета-лактамних АБП повинне включати виконання двох тестів визначення чутливості:

- до бензилпеніциліну або виявлення продукції бета-лактамаз (пеніциліназ);

- до оксациліну або виявлення ПЗБ2а, або кодуючого його гену mecA.

Визначення чутливості до бензилпеніциліну або виявлення продукції бета-лактамаз (пеніциліназ). Для виявлення бета-лактамаз використовують диски з нітроцефіном. Нітроцефін - хромогенний цефалоспорин, який легко гідролізується під дією всіх бета-лактамаз з утворенням забарвленого продукту.

Для проведення дослідження використовують чашку, на якій оцінювали чутливість досліджуваного штаму Staphylococcus spp. до бензилпеніциліну та/або оксациліну ДДМ. З межі зони пригнічення росту навколо диска з оксациліном бактеріологічною петлею забирають незначну кількість культури і наносять на заздалегідь зволожений диск з нітроцефіном. Диск інкубують при кімнатній температурі до 1 год. Поява червоного забарвлення свідчить про продукцію бета-лактамаз досліджуваним штамом мікроорганізму. Такий штам вважають стійким до природних і напівсинтетичних пеніцилінів (за винятком оксациліну), незалежно від конкретних результатів тестування до названих АБП.

Визначення чутливості до оксациліну. При дослідженні стандартними методами необхідно враховувати деякі особливості:

- для приготування інокулюму використовують тільки прямий метод суспендування колоній;

- тривалість інкубації до обліку результатів визначення чутливості до оксациліну повинна становити не менше 24 год.

Особливості тестування ДДМ: використовують диски, що містять 1 мкг оксациліну; при обліку результатів звертають увагу навіть на одиничні дрібні колонії стафілококів, знайдені в межах зони пригнічення росту.

Особливість тестування методами серійних розведень: в ПС доцільно додавати NaCl.

Штами стафілококів, резистентні до оксациліну, вважають стійкими до усіх бета-лактамних АБП. Якщо результати дослідження суперечливі, вирішальними є результати визначення чутливості до оксациліну. Визначати чутливість стафілококів до бета-лактамних АБП, крім бензилпеніциліну та оксациліну, недоцільно.

При виявленні у стафілококів множинної резистентності при чутливості до оксациліну дослідження повторюють. Критерії оцінки резистентності до метициліну для S.aureus і коагулазанегативних стафілококів відрізняються.

При отриманні сумнівних результатів необхідно використовувати додаткові методи: скринінг на агарі (метод наведений нижче), пряме виявлення гена тесА або білка ПЗБ2а.

При виділенні пенициліно- і метициліно-чутливих штамів стафілококів, мікроорганізм вважається чутливим до всіх беталактамних АБП, а препаратами вибору будуть природні і амінопеніциліни.

При виявленні продукції бета-лактамаз і чутливості до оксациліну, мікроорганізм резистентний до природних пеніцилінів, аміно-, карбокси- і уреїдо- пеніцилінів, але чутливий до оксациліну, інгібіторозахищених пеніцилінів і цефалоспоринів I-II поколінь, які є препаратами вибору в даному випадку. Відносно даних штамів будуть також активні цефалоспорини IV покоління і карбапенеми, проте переваг, порівняно з препаратами вибору, вони не мають.

При виявленні метицилінорезистентності штам вважається стійким до всіх бета-лактамних антибіотиків, для лікування необхідно використовувати препарати інших груп, препаратами вибору в цьому випадку є глікопептиди.

Додаткові методи виявлення метцилінорезистентності. Найнадійнішим методом виявлення метицилінорезистентності у стафілококів є безпосереднє визначення наявності гена тесА молекулярно-генетичними методами (за допомогою ПЛР). Крім того, розроблений метод виявлення пеніцилінозв'язуючого білка - ПЗБ2а в реакції аглютинації.

Скринінг на агарі для виявлення метицилінорезистентності є високочутливим і специфічним методом, але він може бути використаний тільки для штамів S.aureus. Для проведення скринінгу готують чашки з агаром Мюллер-Хінтона (далі - МХА), що містять 4% NaCl і 6,0 мкг/куб.см оксациліну. NaCl вносять в ПС до автоклавування. Робочий розчин оксациліну додають в ПС після автоклавування і охолодження середовища до 45-50 град. С. Для приготування робочого розчину оксациліну використовують субстанцію АБП з відомою активністю.

2. Стерильний ватний тампон комерційного винотовлення занурюють в пробірку із стандартизованою суспензією (0,5 за МакФарландом), відтискають надлишок вологи об стінку пробірки. Культуру наносять тампоном або на обмежену поверхню (діаметром 10-15 мм), або на всю поверхню агару з оксациліном в чашці Петрі.

Штами S.aureus інкубують при температурі 35 град. С протягом 24 год., а коагулазонегативних стафілококів - протягом 48 год. Після інкубації чашки ретельно переглядають в проходячому світлі:

- поява видимого росту більше 1 колонії або вуалеподібного росту на місці нанесення культури означає стійкість даного штаму до оксациліну (метициліну);

- за відсутності росту на місці нанесення культури досліджуваний штам враховується як чутливий до метициліну (оксациліну);

- при сумнівних результатах, а також для штамів, виділених від хворих з клінічно неефективною терапією і хворих з серйозними інфекціями, необхідно провести розгорнене дослідження з визначенням МІК оксациліну і гена тесА.

При дослідженні обов'язково ставлять контроль росту досліджуваних культур на МХА з 4% NaCl без оксациліну (культуру наносять так само, як на агар з оксациліном). Паралельно з досліджуваними тестують також контрольні штами метициліночутливих і метицилінорезистентних стафілококів.

Макроліди і лінкозаміди - є альтернативними препаратами для лікування стафілококових інфекцій. Враховуючи закономірності перехресної резистентності між цими підгрупами препаратів у дослідження необхідно включати:

- один з представників 14- і 15-членних макролітів (еритроміцин, кларитроміцин, рокситроміцин, азітроміцин), для яких спостерігається повна перехресна резистентність між окремими представниками;

- кліндаміцин, враховуючи повну перехресну резистентність між 16-членними макролітами (спіраміцин, мідекаміцин) і лінкозамідами.

Фторовані хінолони. Нові антипневмококові представники цієї групи АБП (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин і ін.) мають підвищену активність відносно Staphylococcus spp. Між ними немає повної перехресної резистентності, антипневмококові препарати часто зберігають активність щодо штамів, стійких до інших фторхінолонів.

Аміноглікозиди. При детекції стійкості до гентаміцину, виділений штам слід вважати стійким до всіх аміноглікозидів. Тому гентаміцин обов'язково повинен включатися в набір для тестування. Але іноді можуть зустрічатися штами, стійкі до інших аміноглікозидів при чутливості до гентаміцину.

Ванкоміцин є одним з препаратів вибору (разом з оксазолідинонами) для лікування інфекцій, викликаних оксацилінорезистентними штамами.

Додаткові препарати. Лінезолід. Оксазолідинони є ефективними в лікуванні інфекцій, викликаних оксацилінрезистентними штамами (у т.ч. стійкими до глікопептидів), але відомо про формування стійкості до препаратів цієї групи.

Інші препарати: ко-тримоксазол, хлорамфенікол, фузідієва кислота, тетрациклін, рифампіцин. Перелічені препарати поступаються за активністю бета-лактамам, а тому їх значення у лікуванні стафілококових інфекцій, викликаних метицилінчутливими штамами, невелике. Їх клінічна ефективність при цих інфекціях вивчена недостатньо.

Рифампіцин, ко-тримоксазол і фузідієву кислоту не можна рекомендувати як засіб монотерапії із-за високої частоти селекції резистентності в процесі лікування.

При відсутності або низькій частоті метицилінорезистентності достатньо обмежитися оцінкою чутливості до оксациліну, макролідів і, можливо, ще до 1-2 препаратів, вживаним в конкретному стаціонарі для лікування стафілококових інфекцій. У разі ж високої частоти розповсюдження метицилінрезистентності в дослідження необхідно включати широке коло антибіотиків.

5.5. Визначення чутливості Enterococcus spp. Ентерококи характеризуються природною стійкістю до багатьох АБП, тому при виділенні їх з нестерильних локусів організму, особливо у складі асоціацій, визначати їх чутливість до АБП недоцільно. Досліджувати чутливість потрібно для штамів Enterococcus spp., виділених із стерильних у нормі рідин і тканин організму, а також з сечі. Підходи до визначення чутливості цих мікроорганізмів і набори АБП для тестування розрізняються в залежності від джерела виділення штамів (див. таб. 16).

Бензилпеніцилін і ампіцилін є препаратами вибору для лікування ентерококових інфекцій (до цих АБП у них є перехресна резистентність). Отримані результати можна екстраполювати на інгібіторозахищені амінопеніциліни і уреїдопеніциліни. Описані випадки резистентності ентерококів до пеніцилінів, пов'язані з продукцією бета-лактамаз, тому резистентні штами слід досліджувати на продукцію пеніцилінази в тесті з нітроцефіном.

Аміноглікозіди. Ентерококи мають природну стійкість до аміноглікозидів, але, ці препарати широко застосовуються в комбінованій терапії генералізованих ентерококових інфекцій у зв'язку з вираженим синергізмом між аміноглікозидами і ампіциліном або ванкоміцином.

Синергізм виявляється тільки в тому випадку, коли МІК аміноглікозидів не перевищує 500 мкг/куб.см для гентаміцину і 1000 мкг/куб.см для стрептоміцину, а тому необхідно проводити скринінг на наявність у ентерококів високого рівня резистентності до стрептоміцину і гентаміцину.

Ванкоміцин є препаратом вибору для лікування інфекцій, викликаних штамами, резистентними до бета-лактамів і аміноглікозидів.

Лінезолід може бути застосований для лікування інфекцій, викликаних штамами, стійкими і до ванкоміцину, і до бета-лактамів і аміноглікозидів.

Інші препарати. Для штамів ентерококів, виділених при ІСШ, доцільно досліджувати чутливість до пеніциліну або ампіциліну, фторхінолонів, тетрацикліну, нітрофуранів, фосфоміцину. Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості Enterococcus spp. (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) подані в табл. 6.

Скринінг для виявлення у ентерококів високого рівня резистентності до аміноглікозидів. Скринінг можна проводити на агарі або в бульйоні. Поживне середовище (агар або бульйон на серцево-мозковому екстракті) готують відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування і охолодження до 45-50 град. С у середовище асептично додають розчини антибіотиків до наступних кінцевих концентрацій: гентаміцин для скринінгу в агарі і бульйоні -500 мг/куб.дм; стрептоміцин для скринінгу в агарі - 2000 мг/куб.дм, для скринінгу в бульйоні - 1000 мг/куб.дм.

- при скринінгу на агарі - ріст більше 1 колонії;

- при скринінгу в бульйоні - будь-який видимий ріст.

Для контролю якості використовують штами чутливих і резистентних ентерококів.

Скринінг для виявлення ванкоміцинорезистентності у ентерококів.

Скринінг здійснюється на агарі. Агар на серцево-мозковому екстракті. готують відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування і охолодження до 45-50 град. С у середовище асептично додають розчин ванкоміцину до кінцевої концентрації 6,0 мг/куб.см.

Для приготування мікробної суспензії використовують ізольовані колонії з 24-годинної культури, вирощеної на неселективних ПС, суспендують до концентрації 0,5 за МакФарландом і наносять 10,0 мкл суспензії на поверхню агару. Інкубують при температурі 35 град. С протягом 24 год. Досліджуваний штам вважають резистентним при рості більше 1 колонії на агарі з ванкоміцином. Для контролю якості використовують штами чутливих і резистентних ентерококів.

5.6. Визначення чутливості мікроорганізмів зі складними поживними потребами іноді вимагає паралельного використання методу серійних розведень і ДДМ, особливої ретельності у виконанні методик. Спроби навіть незначної модифікації стандартних методів (заміна дорогих реагентів на більш дешеві) можуть привести до отримання помилкових, недостовірних результатів, здатних ввести в оману і мікробіологів, і клініцистів.

При визначенні необхідності тестування чутливості мікроорганізмів цієї групи до АБП слід оцінити співвідношення вартості і ефективності (клінічної значущості) таких досліджень, а також співставити вартість повноцінного матеріально-технічного оснащення з доступними ресурсами.

Визначення чутливості Streptococcus spp. Для визначення чутливості стрептококів використовують наступні ПС:

- для методів серійних розведень в бульйоні - бульйон Мюллер-Хінтона (далі МХБ) з додаванням 2,0-5,0% лізованої крові коня (кров лізують заморожуванням - відтаванням з подальшим центрифугуванням для звільнення від тіней еритроцитів);

- для методів серійних розведень в агарі і ДДМ - МХА з додаванням 5% дефібринованої баранячої крові.

Вказані добавки асептично вносять в поживну основу після автоклавування і охолодження до 48-50 град. С.

Визначення чутливості Streptococcus pneumoniae. Бета-лактамні антибіотики (зокрема бензилпеніцилін) є препаратами вибору для терапії пневмококових інфекцій, але їх клінічна ефективність залежить від джерела виділення (дихальні шляхи, ліквор). Механізм резистентності S.pneumoniae до пеніциліну та інших бета-лактамних антибіотиків обумовлений зміною пеніцилінзв'язуючих білків (ПЗБ) клітинної стінки. В результаті мутацій зменшується спорідненість ПЗБ до бета-лактамних антибіотиків.

Методологія визначення чутливості S.pneumoniae має важливі особливості: неможна визначати чутливість до бета-лактамних антибіотиків (пеніциліну, амінопеніцилінів, цефалоспоринів, карбапенемів) диско-дифузійним методом; неможна визначати чутливість S.pneumoniae до АБП методом розведень в агарі. Тому визначення чутливості пневмококів до пеніциліну і інших бета-лактамних антибіотиків передбачає виконання двох досліджень:

- скринінгу з диском, що містить 1,0 мкг оксациліну, з метою виявлення можливої пеніцилінорезистентності;

- визначення МІК пеніциліну та інших бета-лактамних антибіотиків методом розведень в бульйоні або за допомогою Е-тесту у штамів, віднесених за результатами скринінгу до помірно-резистентних і резистентних штамів пневмококів.

Скринінг на наявність пеніцилінорезистентності у штамів S.pneumoniae. Методика проведення дослідження не відрізняється від звичайної процедури визначення чутливості пневмококів до АБП ДДМ. При виявленні діаметра зони пригнічення росту штаму пневмокока навкруги диска з 1 мкг оксациліну > 20 мм S.pneumoniae розцінюється як чутливий до всіх бета-лактамних антибіотиків. При виявленні діаметра зони пригнічення росту < 20 мм, необхідно визначати усіх бета-лактамних антибіотиків (пеніциліну, амінопеніцилінів, цефалоспоринів II-IV поколінь, карбапенемів) методами серійних розведень в бульйоні або за допомогою Е- тестів.

Макроліди і лінкозаміди мають велике значення у лікуванні пневмококових інфекцій. Оцінка чутливості S.pneumoniae до цих антибіотиків можлива диско-дифузійним методом і методом серійних розведень. Зустрічаються різні варіанти перехресної резистентності мікроорганізмів до АБП цієї групи, проте для характеристики чутливості S.pneumoniae до даної групи препаратів досить оцінити чутливість до еритроміцину і кліндаміцину, що дозволяє диференціювати два основних фенотипи стійкості:

М - стійкість до 14- і 15-членних макролідів (при збереженні чутливості до 16-членних макролідів, лінкозамідів і стрептограмінів), обумовлена активним виведенням АБП.

Традиційні фторхінолони (пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин і ломефлоксацин) не адекватні для лікування пневмококових інфекцій, а тому оцінювати чутливість до цих препаратів недоцільно. Важливе місце у лікуванні цих інфекцій посіли антипневмококові фторхінолони (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин і гатіфлоксацин). Частота стійкості пневмококів до перелічених препаратів мінімальна, проте необхідно включити в дослідження всю групу фторхінолонів, оскільки до них немає повної перехресної резистентності.

АБП інших груп. З антибіотиків інших груп для лікування пневмококових інфекцій застосовують ко-тримоксазол, хлорамфенікол і тетрациклін. Проте роль перелічених препаратів останніми роками різко знижується в зв'язку наростанням стійкості, меншою клінічною ефективністю порівняно з бета-лактамами, макролідами і антипневмококовими фторхінолонами, а також значним числом небажаних ефектів.

Для лікування важких пневмококових інфекцій, викликаних штамами з високим рівнем стійкості до АБП інших груп, рекомендується ванкоміцин.

Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості S.pneumoniae (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) наведені в таб. 7.

Визначення чутливості Streptococcus spp. групи "viridans". Проводити визначення чутливості штамів стрептококів групи "viridans", виділених з нестерильних локусів, недоцільно. У штамів, виділених із стерильних в нормі локусів організму, необхідно, в першу чергу, досліджувати чутливість до пеніциліну. Достовірні результати визначення чутливості стрептококів групи "viridans" до пеніциліну можна отримати тільки за допомогою методу серійних розведень. Штами, чутливі до цього антибіотика, слід розцінювати як чутливі до всіх бета-лактамних антибіотиків. Частка штамів, стійких до пеніциліну, можуть зберігати чутливість до деяких цефалоспоринів III покоління (цефотаксиму і цефтриаксону).

Визначення чутливості бета-гемолітичних стрептококів. Препаратами вибору для лікування інфекцій, викликаних бета-гемолітичними стрептококами (перш за все стрептококами групи А -S.pyogenes- і групи В -S.agalactiae), є бета-лактами, достовірних випадків стійкості до АБП цієї групи і до ванкоміцину не описано, а тому оцінювати чутливість до вказаних препаратів недоцільно.

Якщо штам виділено із нестерильний локусів, оцінювати чутливість слід тільки для S.pyogenes і S.agalactiae. Для бета-гемолітичних стрептококів, виділених із стерильних локусів необхідно визначати чутливість до всіх перелічених препаратів одночасно. Рекомендований перелік АБП для визначення чутливості S.pneumoniae, стрептококів групи "viridans" і бета-гемолітичних стрептококів, виділених з різних локусів організму, поданий в таб. 11. Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості Streptococcus spp. (крім S.pneumoniae) (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) приведені в таб. 8.

Визначення чутливості Haemophilus influenzae. Для визначення чутливості Haemophilus spp. використовують спеціальні ПС, (типу НТМ), які містять необхідні для гемофілів фактори росту. Таке середовище можна приготувати в лабораторії на основі середовища Мюллер-Хінтона:

- середовище готують на основі бульйону або агару Мюллер-Хінтона. Після розчинення основи в неї додають дріжджовий екстракт (до кінцевої концентрації 5 мг/мл) і розчин гематину (до кінцевої концентрації 15 мг/куб.дм). Для приготування основного розчину гематину 50 мг порошку поміщають в 100,0 куб.см 0,01н NaOH (0,01 моль/куб.дм) і нагрівають при ретельному перемішуванні до повного розчинення. В підготовлене для автоклавуванняя середовище на 1 куб.дм вносять 30,0 куб.см основного розчину гематину;

- після автоклавування і охолодження основи до 48-50 град. С в неї асептично вносять розчин нікотинамідаденіндинуклеотиду (НАД) до кінцевої концентрації 15 мг/куб.дм. Розчин НАД стерилізують фільтрацією через мембранні фільтри з розміром пір 0,45 мкм;

- при визначенні чутливості до сульфаніламідів і триметоприму в охолоджене до 48-50 град. С середовище асептично вносять також розчин тимідинфосфорилази до кінцевої концентрації 0,2 од/куб.см.

Haemophilus spp. характеризуються природною чутливістю до більшості поширених антибіотиків, у тому числі і до бета-лактамів, за виключенням цефалоспоринів I покоління. Найбільше значення має набута резистентність до ампіциліну, обумовлена продукцією плазмідних бета-лактамаз TEM-1 і ROB-1. Крім ампіциліну ці ферменти частково гідролізують цефалоспорини I покоління, але не активні відносно препаратів II-III поколінь.

Описані випадки стійкості штамів H.influenzae до ампіциліну пов'язані зі зміною мішені дії бета-лактамних антибіотиків (пеніцилінзв'язуючих білків) або зниженням проникності зовнішньої клітинної мембрани. Ці штами отримали назву бета-лактамазонегативних ампіцилінорезистентних (далі - БЛНАР) і вважаються нечутливими до інгібіторозахищених пеніцилінів і цефалоспоринів таких, як цефаклор, цефуроксим, цефіксим і цефтибутен. До теперішнього часу не отримано клінічних штамів H.influenzae, стійких до цефалоспоринів III-IV поколінь і карбапенемів.

Для виявлення ампіцилінорезистентності у H.influenzae в практиці достатньо визначення чутливості до ампіциліну ДДМ і тесту на продукцію бета-лактамаз з нітроцефіном. Результати цих тестів дозволять поділити штами на ампіциліночутливі, бета-лактамазопродукуючі ампіциілінорезистентні (чутливі до інгібіторозахищених пеніцилінів і цефалоспоринів II-IV поколінь) і БЛНАР, які слід розцінювати як резистентні до інгібіторозахищених пеніцилінів і деяких цефалоспоринів. Тестування з диском, що містить інгібіторозахищені пеніциліни, наприклад амоксицилін/клавуланат, не дозволяє відрізнити БЛНАР від ампіциліночутливих штамів H.influenzae.

Стійкість до фторхінолонів серед H.influenzae зустрічається рідко, проте зростання кількості з підвищеними значеннями для них МІК фторхінолонів вимагає тестування вказаних АБП. Примірний перелік АБП, що рекомендуються для визначення чутливості H.influenzae, ізольованих з різних локусів організму, представлений в таб. 17.

Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості H.influenzae (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) приведені в таб. 9.