Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції

Для визначення "істинної" і "помилкової" подвійної стійкості M.tuberculosis був запропонований метод перехресних пересівів, а також пересівів стійкої культури на середовища, що містять суміш препаратів, до яких була визначена подвійна стійкість.

Наприклад, виявлена стійкість до 5,0 мкг/мл стрептоміцину і до 1,0 мкг/мл ізоніазиду. При методі перехресних пересівів культуру, яка виросла на щільному середовищі, що містить 5,0 мкг/мл стрептоміцину, пересівають на середовище, що містить 1,0 мкг/мл ізоніазиду. Культуру, що виросла на середовищі з ізоніазидом, пересівають на середовище, що містить стрептоміцин. При визначенні медикаментозної стійкості мікобактерій до суміші препаратів стійку культуру засівають у пробірку із середовищем, що містить суміш препаратів в тих концентраціях, до яких була виявлена стійкість.

При "істинній" подвійній стійкості культура росте при пересіві на середовища, що містять окремо обидва препарати і на середовищі з сумішшю.

При "помилковій подвійній стійкості культура не росте на середовищі, що містить суміш препаратів, і не росте при перехресних пересівах.

5.4 Визначення чутливості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров'яного живильного середовища

Роблять змив культури, яку отримали на яєчному живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена, за методикою, описаною вище.

З надосадної рідини, концентрація мікробних тіл у якій приблизно відповідає стандарту каламутності 5 одиниць, на вузьке скельце у кюветі наноситься 2 краплі на 1/3 скельця. Далі роблять те саме, що і при культивуванні мікобактерій. Мазки занурюють у пробірки з живильним середовищем, у якому розведені різні концентрації антибактеріальних препаратів, а також у 2-3 пробірки з середовищем без препаратів (контролі).

Зроблені в такий спосіб посіви культури в кров'яне середовище, що містить антибактеріальні препарати, і контролі інкубуються при 37 град. Цельсію 8-12 діб. Підготовка мазків до обліку робиться за загальноприйнятою методикою - (метод Прайса). Через 8 днів виймають 1 з контролів, фарбують за Цілем-Нільсеном, мікроскопують. Якщо під малим збільшенням мікроскопа видно рясний ріст мікроколоній - "кіс", можна робити облік результатів. Якщо ріст в контролі недостатній - пробірки залишають в термостаті ще на 2 дні, після чого фарбують інший контроль.

Облік результатів:

а) якщо мікроколонії виявляються тільки в контрольних мазках, а в інших мазках спостерігаються лише поодинокі клітини, то вони є чутливими до данної концентрації препарату.

б) якщо в мазках, що культивувалися в середовищі з антибактеріальним препаратом, виявляються такі ж мікроколонії, як і в контрольних мазках, то такі мікобактерії є стійкими до данного препарату.

в) якщо в мазку, що культивувався в середовищі з яким-небудь препаратом, виявляються мікроколонії поряд з поодинокими клітинами, це значить, що дана популяція мікобактерій містить як чутливі, так і стійкі мікобактерії.

При відсутності росту чи наявності лише поодиноких мікроколоній у контрольних мазках облік не проводять, і дослід варто повторити. Результати досліду також не враховуються при відсутності МБТ у контрольних мазках, незважаючи на можливий ріст або інгібування МБТ у мазках, які культивувалися в середовищах з препаратами.

5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих

Експериментальні дослідження і клінічні спостереження показали, що є чітка залежність лікувальної дії антимікобактеріальних препаратів від їх концентрації в крові. У свою чергу, рівень бактеріостатично активного препарату в крові і вогнищах уражень залежить від фізико-хімічних властивостей ліків, умов їх всмоктування, розподілу, біотрансформації і швидкості елімінації, тобто від фармакодинаміки і фармакокінетики препарату. Велике значення має також доза препарату, метод введення і комбінації його з іншими медикаментозними засобами. Тому визначення фармакокінетики препарату в крові хворого може допомогти клініцистам у прогностичній оцінці ефективності терапії, уточненні її тактики та способу введення препарату, його оптимальних дозувань і найбільш ефективних комбінацій препаратів. Раціональним є паралельне визначення концентрації препарату в крові хворого і визначення чутливості виділених M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів. Співставлення результатів цих визначень може підказати клініцистам більш правильну тактику подальшого лікування хворого.

Визначення концентрації в крові застосованих у клініці антимікобактеріальних препаратів раціонально визначати мікробіологічним методом, тому що останній дозволяє визначати не тільки антимікобактеріальну дію самого препарату, але й всю сукупність метаболітів, що мають бактеріостатичну активність, що, у більшості випадків, неможливо визначити хімічними методами.

При мікробіологічному методі як тест-мікроб використовують лабораторний штам M.tuberculosis.

5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі

Принцип. Приготування серійних розведень зразка крові хворих, що одержали тест-дозу антимікобактеріальних препаратів, у рідкому живильному середовищі з наступним внесенням у кожне розведення дозованої кількості тест-мікробів. Після періоду інкубації відзначають наявність або відсутність росту мікобактерій в кожному з розведень. Метод дозволяє визначити максимальне розведення крові, що затримує ріст тест-мікробів із відомою чутливістю до даного препарату. Концентрація препарату в крові обчислюється множенням показника розведення крові на мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) препарату по відношенню до тест-штаму в контрольному досліді.

Компоненти:

1. Синтетичне середовище Проскауера - Бека:

- L-аспарагін - 5,0 г (або глікокол - 8,0 г);

- калій фосфорнокислий однозаміщений - 5,0 г;

- калій сірчанокислий - 0,5 г;

- гліцерин - 20,0 мл;

- лимоннокисла магнезія * - 1,5 г;

- дистильована вода - до 1000,0 мл.

* Примітка: лимоннокисла магнезія додається до середовища після встановлення рН 7,0 - 7,1(для цього середовище підлужується 40,0 % розчином їдкого натрію).

Середовище автоклавують 20 хвилин під тиском 0,5 атм. або піддають дрібній стерилізації.

2. Сироватка нормальна коняча. Вноситься в середовище Проскауера-Бека безпосередньо перед дослідом в кількості 1:10 (10,0 %).

3. Тонка плівка тест-штаму M.tuberculosis, пересіяна на середовище за 8 - 12 днів перед дослідом (молода культура).

Підготовка до визначення. Досліди проводять у бактеріологічних пробірках, в які розливають по 3,0 мл середовище Проскауера - Бека, що містить 10,0 % нормальної конячої сироватки. На кожний дослід використовують ряд пробірок числом від 6 до 10 (в залежності від активності препарату, концентрацію якого визначають).

Якщо дослідження проводиться в період лікування хворого, то якнайменше за 1 добу відміняють всі антибактеріальні препарати. В день дослідження хворому вранці, натщесерце, дають тест-дозу препарату (як правило, разову терапевтичну дозу). Через 2 години після перорального прийому ізоніазиду, рифампіцину, етамбутолу, канаміцину, фторхінолонів, або через 3 години після прийому етіонаміду, із ліктьової вени беруть рівно 3,0 мл крові і виливають її в асептичних умовах в стерильну пробірку, що містить 1,0 мл 5,0 % стерильного розчину цитрату натрію (як антикоагулянта).

В лабораторії в пробірку з цитратною кров'ю додають рівно 2,0 мл стерильної дистильованої води, ретельно перемішують. Отримують розведення крові 1:2. Далі мірною кінцевою піпеткою ємністю 5,0 мл відсмоктують 3,0 мл і переносять у пробірку з 3,0 мл середовища, отримують розведення 1:4 і т.д. - серійні розведення крові. У останню пробірку кров не вносять - контроль. Для кращого перемішування крові з середовищем перед тим, як перенести кров в наступну пробірку, треба тричі перемішати її піпеткою.

Далі на поверхню кожної пробірки, починаючи з контрольної, бактеріологічною лопаткою поміщають невеличкий шматочок заздалегідь (за 8-12 днів) вирощеної плівки тест-штаму M.tuberculosis (найчастіше користуються лабораторним штамом H37Rv або Academia). Пробірки поміщають в термостат при 37 градусів Цельсію на 7 - 10 днів, поки в контрольній пробірці плівка розростеться, займаючи всю поверхню живильного середовища.

Паралельно проводиться дослід по визначенню МІК препарату по відношенню до даного тест-штаму. Для цього роблять розведення препарату, щоб отримати серію випробовуваних концентрацій.

5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення МІК

Ізоніазид

1-е розведення - 10,0 мг/мл: наважку 100,0 мг препарату заливають 1,0 мл етилового спирту (для дезинфекції), або беруть 1,0 мл 10,0 % розчину, що також містить 100,0 мг ізоніазиду + 9,0 мл води.

2-е розведення - 1,0 мг/мл (1000,0 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 100,0 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення - 10,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.

5-е розведення (робоче) Ц 0,4 мкг/мл: 0,4 мл 4-го розведення (4,0 мкг) + 9,6 мл води.

Далі роблять серійні розведення препарату в середовищі Проскауера-Бека, що містить 10,0 % конячої сироватки, заздалегідь розлите в ряд пробірок по 3,0 мл. Тобто із 5-го (робочого) розведення беруть 3,0 мл і вносять в 3,0 мл середовища, отримуючи концентрацію 0,2 мкг/мл, і т.д. - до концентрації 0,003 мкг/мл (сьома пробірка). Восьма пробірка препарату не містить і служить контролем.

Рифампіцин (рифадин, мікобутин)

1-е розведення - 15,0 мг/мл: капсулу, що містить 150,0 мг препарату, висипають в стерильну пробірку + 1,0 мл етилового спирту + 9,0 мл води.

2-е розведення - 1,5 мг/мл (1500 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 150,0 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення (робоче) - 15,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.

Беруть 2,0 мл робочого розведення (4-го) додають 4,0 мл середовища Проскауера-Бека, отримуючи концентрацію 5,0 мкг/мл, далі - серійні розведення в середовищі до 0,03 мкг/мл. Остання пробірка без препарату (контроль).

Етамбутол

1-е розведення - 20,0 мг/мл: таблетку етамбутолу, що містить 400,0 мг препарату, ретельно розтирають в ступці + 1,0 мл етилового спирту + 19,0 мл води.

2-е розведення - 2,0 мг/мл (2000 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 200,0 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення (робоче) - 20,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.

Беруть 3,0 мл робочого (4-го) розведення і додають 3,0 мл середовища Проскауера-Бека, в якому створюється концентрація препарату 10,0 мкг/мл. Далі - ряд серійних розведень у середовищі до 0,07 мкг/мл. Остання пробірка без препарату (контроль).

Етіонамід (або протіонамід)

1-е розведення - 25,0 мг/мл: таблетку, що містить 250,0 мг препарату, ретельно розтирають в стерильній ступці + 1,0 мл етилового спирту + 9,0 мл води.

2-е розведення - 2,5 мг/мл (2500 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 250,0 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення - 25,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.

5-е розведення (робоче) Ц 5,0 мкг/мл: 1,0 мл 4-го розведення + 4,0 мл води.

Далі роблять серійні розведення в середовищі заздалегідь розлитому по 3,0 мл, шляхом внесення 3,0 мл робочого (5-го) розведення. Отримують ряд пробірок, з концентрацією від 2,5 мкг/мл до 0,04 мкг/мл (у 7-й пробірці). Восьма пробірка - без препарату (контроль).

Канаміцин

Беруть ампулу канаміцину , що містить 500,0 мг в 2,0 мл (тобто 250,0 мг/мл).

1-е розведення - 25,0 мг/мл: 1,0 мл із ампули + 9,0 мл води.

2-е розведення - 2,5 мг/мл (2500 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 250,0 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення (робоче) - 25,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.

Із 4-го (робочого) розведення, що має концентрацію 25,0 мкг/мл, беруть 1,0 мл, додають 4,0 мл середовища Проскауера-Бека, отримуючи концентрацію 5,0 мкг/мл, далі - серійні розведення в середовищі до 0,31 мкг/мл (5 пробірок). Шоста пробірка - без препарату (контроль).

Фторхінолони

(ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)

1-е розведення - 25,0 мг/мл: таблетку ретельно розтирають у ступці + 1,0 мл етилового спирту. Якщо таблетка містить 250,0 мг препарату, додають 9,0 мл стерильної дистильованої води, якщо таблетка містить 500,0 мг - додають 19,0 мл води.

2-е розведення - 2,5 мг/мл (2500 мкг/мл: 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 250,0 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення (робоче) - 25,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.

Беруть 1,0 мл робочого розведення (4-го) і додають 4,0 мл середовища Проскауера-Бека, отримують концентрацію в середовищі 5,0 мкг/мл. Далі - ряд серійних розведень у середовищі до 0,07 мкг/мл. Остання пробірка без препарату (контроль).

Хід дослідження такий самий, як і при визначенні концентрації препарату в крові хворого.

Оцінка результатів. Результати досліду враховуються по інтенсивності росту плівки тест-штаму. Якщо плівка займає всю поверхню пробірки, ріст оцінюється трьома хрестами (+ + +), якщо плівка займає приблизно половину поверхні середовища - двома хрестами (+ +), якщо ріст на 1/3 поверхні середовища - одним хрестом (+). Найменша концентрація препарату, що затримала ріст плівки, і буде мінімальною інгібуючою концентрацією (МІК) цього препарату.

При обчисленні концентрації препарату в крові величину МІК препарату множать на найбільше розведення крові хворого, яке затримало ріст плівки.

Наприклад, у хворого визначають концентрацію ізоніазиду в крові після прийому разової дози препарату. Ріст плівки тест-штаму був затриманий розведенням крові 1:128, у наступному розведенні (1:256) уже був ріст плівки (+ +). Якщо МІК ізоніазиду відносно того ж тест-штаму за однакових умов дослідження (та ж партія середовища і т.п.) 0,025 мкг/мл, то концентрація ізоніазиду в крові буде: 0,025 мкг/мл х 128, тобто 3,1 мкг/мл.

5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (БАК) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)

Суть дослідження полягає в тому, що після прийому хворим будь-якого антимікобактеріального препарату кров набуває туберкулостатичної активності і при розведенні в 2, 4, 8 і т.д. раз, затримує ріст M.tuberculosis.

Про ступінь БАК судять по максимальному розведенню крові, яке ще спроможне затримати ріст M.tuberculosis. БАК залежить від ряду факторів, головним чином, від дифузійних властивостей препарату, прийнятої дози та чутливості до нього тест-штаму мікобактерій.

Дослідження проводиться за тією ж методикою, якою користуються при визначенні концентрації протитуберкульозного препарату в крові хворого (тільки не визначають при цьому МІК препарату). Кров береться після прийому разової дози препарату на передбачуваному піку його концентрації в крові, тобто при внутрішньом'язовому або внутрішньовенному введенні - через 1 годину, якщо препарат вводиться крапельним способом (фторхінолони) Ц в кінці крапельниці, після перорального прийому - через 2 - 3 години.

Всі препарати хворий приймає після їжі, крім рифампіцину, який приймається перед їжею.

Користуються двома способами визначення БАК. При одному з них тест-штамом, який наноситься у вигляді плівки на розведення крові хворого в живильному середовищі Проскауера-Бека, являється лабораторний штам M.tuberculosis H37Rv, або будь-який інший штам M.tuberculosis, чутливий до всіх антимікобактеріальних препаратів. Цей спосіб має свої недоліки: при його застосуванні не враховується чутливість (чи стійкість) мікобактерій самого хворого. Тому ступінь БАК препарату може бути високою при відсутності терапевтичного ефекту від його застосування у випадку резистентності збудника до даного препарату.

Тому у випадках, коли хворий виділяє мікобактерії стійкі до якогось препарату, але все ж цим препаратом з якихось причин продовжують лікувати хворого, застосовують другий спосіб. При цьому наносять на розведення крові плівку, вирощену заздалегідь з штаму M.tuberculosis, який виділяють у даного хворого. Цей спосіб менш поширений через певні складнощі в його застосуванні: необхідно мати культуру M.tuberculosis хворого на щільному середовищі і отримати з неї плівку на рідкому середовищі, що вимагає значних затрат часу.

Хворі на туберкульоз завжди приймають комбіновану антибактеріальну терапію. Тому, особливо при дослідженні з використанням мікобактерій від самого хворого, доцільно визначати сумарну БАК, яка буде відображати істинну активність крові, що створюється після прийому кількох препаратів.

Оскільки препарати приймаються не одномоментно, а з різними інтервалами між їх прийомом, найбільш доцільно для визначення сумарної БАК брати кров 2 рази протягом дня. Перший раз - після 1-го прийому групи препаратів через 1 - 3 години. Наприклад:

1. Хворий отримав рифампіцин о 8 30 годин ранку і стрептоміцин внутрішньо-м'язово або ізоніазид внутрішньовеново об 11 00 годині. Кров при цьому треба взяти о 12-й годині.

2. Якщо рифампіцин був прийнятий о 8 30 годин ранку, а етіонамид (або інший таблетований препарат, крім піразинаміду) об 11 00 годині, то кров беруть о 13 00 - 14 00 годині.

3. Якщо хворий отримує комбінований препарат, то кров беруть через 2 - 3 години після його прийому.

Вдруге кров беруть через 2 - 3 години після прийому другої групи препаратів. Наприклад: хворий отримав ізоніазид о 15 00 годині, етамбутол о 19 00 годині; кров беруть о 21 00 годині.

У тих випадках, коли вся денна доза препаратів приймається через короткі проміжки часу, майже одночасно, перший раз кров беруть через 2 - 3 години, а другий раз - через 10 - 12 годин після прийому препаратів.

При сумарній БАК враховується синергійний вплив препаратів на збудника.

Визначення БАК відносно лабораторного штаму M.tuberculosis (або іншого чутливого до ліків штаму) доцільно застосовувати у вперше виявлених хворих, у яких передбачається чутливість збудника до антибактеріальних препаратів. Кров хворих, які раніше не лікувались, як правило, буває високоактивною, так само як і у хворих, які вже приймали антимікобактеріальну терапію, але їх M.tuberculosis все ще чутливі до препаратів. В останній групі можуть з'являтися хворі з чутливими M.tuberculosis, але з низькими показниками БАК, що в деяких випадках може пояснювати так звану клінічну медикаментозну стійкість.

Визначення БАК відносно штаму M.tuberculosis самого хворого демонструє ступінь чутливості його мікобактерій до індивідуальної БАК препаратів, яка створюється в його крові при певному режимі специфічної терапії. Данні БАК допомагають в корекції індивідуального режиму лікування.

В тих випадках, коли вже відомо, що M.tuberculosis хворого стійкі до якихось препаратів, при визначенні сумарної БАК з використанням лабораторного тест-штаму треба виключати ці препарати із тієї комбінації препаратів, що їх дають хворому безпосередньо перед дослідженням БАК.

У відповіді з лабораторії про дослідження БАК має значитись час прийому препарату і його доза (для кожного препарату окремо), час взяття крові, який і є часом показника її активності, за який приймається максимальне розведення крові, яке ще затримало ріст плівки M.tuberculosis. Наприклад, після прийому ізоніазиду хворим ріст плівки був затриманий в розведеннях крові від 1:2 до 1:128, в наступному розведенні (1:256) уже реєструється ріст плівки. Відповідь: Хворий о 8 30 прийняв 0,3 ізоніазиду. БАК об 11 00 - 1:128.

БАК вважається високою, якщо ріст M.tuberculosis затримує розведення крові 1:64 і вище, задовільною при затримці росту в розведенні крові 1:16 - 1:32, низькою при затримці росту в розведенні 1:4 - 1:8. Затримка росту тільки в розведенні крові 1:2 не розцінюється як специфічна, оскільки сама кров має певну антибактеріальну активність. В талиці 5.1 приведено середній діапазон показників БАК до кожного з антимікобактеріальних препаратів після прийому оптимальних доз при дослідженні у хворих з чутливими M.tuberculosis.

Визначення БАК може служити допоміжним методом контролю за ефективністю застосування того чи іншого препарату, а також допомогає встановити індивідуальну активність нового препарату, який передбачається призначити хворому.