Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції

Позначення: + ростуть, - не ростуть, -/+ деякі культури ростуть; + реакція позитивна, - реакція негативна; + вірулентні, + - слабо вірулентні, - не вірулентні.

(у чисельнику - більшість штамів, у знаменнику - меншість);

* - у штамів, чутливих до ізоніазиду.

Позначення:

Для росту на середовищі: + ріст усіх культур, - ріст відсутній, +/- більшість культур дають ріст, -/+ більшість культур не дає росту.

Для утворення пігменту: + культури утворюють пігмент, - культури не утворюють пігмент, -/+ окремі культури утворюють пігмент.

Для біохімічних реакцій: + реакція позитивна, - реакція негативна, +/- більшість культур дають позитивну реакцію, -/+ більшість культур дають негативну реакцію.

4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки BBL MGIT

Принцип. Пробірка BBL MGIT для виявлення росту мікобактерій містить модифікований бульйон 7Н9 Міддлбрука, доповнений OADC-збагаченням BBL MGIT, який підтримує ріст мікобактерій та забезпечує їх виявлення, і сумішшю антибіотиків BBL MGIT PANTA. Трубка BBL MGIT містить флуоресцентну сполуку, запаяну в силікон на дні круглодонної пробірки розміром 16,0 х 100,0 мм. Ця сполука реагує на присутність кисню, розчиненого в бульйоні. Вихідна концентрація кисню не дає яскравого світіння. У випадку присутності в дослідній пробі мікобактерій та їх розмноження, відбувається активне поглинання О2 й виділення СО2, що дає можливість спостерігати яскраву флюоресценцію за допомогою 365-нм УФ-трансосвітлювача або довгохвильового УФ-світла (лампа Вуда).

Реактиви.

Індикаторна пробірка BBL MGIT для виявлення росту M.tuberculosis містить 110,0 мкл флуоресцентного індикатора і 4,0 мл бульйону 7Н9 Міддлбрука. Індикатор містить пентагідрат хлористого трис-4,7-дифеніл-1,10-фенантролінрутенію в силіконовій основі. Пробірки промиті 10,0 % СО2 і закриті поліетиленовими ковпачками.

Вміст в 1,0 л дистильованої води:

модифікований бульйон 7Н9 Міддлбрука - 5,9 г ;

казеїновий пептон - 1,25 г ;

гліцерин - 3,1 мл.

BBL MGIT OADC призначено для збагачення бульйону Міддлбрука з метою швидкого росту мікобактерій і містить 15,0 мл OADC-збагачення.

Вміст в 1,0 л дистильованої води:

- О - олеїнова кислота - 0,6 г;

- А - альбумін бичачий - 50,0 г;

- D - декстроза - 20,0 г;

- С - каталаза - 0,03 г.

Ампула BBL MGIT PANTA містить ліофілізовану суміш антимікробних агентів для пригнічення росту супутньої мікрофлори.

Вміст в 1 ампулі ліофілізованої PANTA:

поліміксин В - 6000 од.; амфотеріцин В - 600,0 мкг; налидиксова кислота - 2400,0 мкг; триметоприм - 600,0 мкг; азиоцилін - 600,0 мкг.

Перед вживанням додати в ліофілізовану ампулу з сумішшю антибіотиків MGIT PANTA 3,0 мл стерильної дистильованої води. Також необхідно перевірити кожну пробірку MGIT з метою виявлення забруднення або пошкодження. Викинути будь-які пробірки, якщо вони є непридатними або дають флюоресценцію до використання.

Зберігання реактивів. Індикаторні пробірки BBL MGIT для виявлення росту мікобактерій зберігати при 2 - 25 град. Цельсію, не заморожувати. Бульйон повинен бути прозорим і безбарвним. Не використовувати бульйон, якщо він каламутний. Пробірки MGIT, які зберігаються так, як вказано на етикетці, можна засівати аж до дати закінчення терміну придатності та інкубувати на протязі восьми тижнів.

OADC BBL MGIT необхідно зберігати в темряві при 2 - 8 град. Цельсію; уникати заморожування або перегрівання. Не відкривати до вживання.

Ампули з ліофілізованою сумішшю антибіотиків зберігати при 2 - 8 град. Цельсію. Після розведення суміш PANTA можна використовувати на протязі 72 годин (при 2 - 8 град. Цельсію), або на протязі 6 місяців (при - 20 або більш низький температурі). Після розморожування суміш PANTA слід використовувати негайно; невикористану частину викинути.

Індикаторним експрес-методом на наявність M.tuberculosis можна досліджувати всі види клінічних проб (легеневих, або позалегеневих), крім сечі та крові. Обробку проб слід проводити N-ацетил-L-цистеїном з гідроокисом натрію (NALC - NaOH).

Хід дослідження.

1. Безпосередньо перед дослідженням приклеїти на пробірку MGIT етикетку з номером проби, відкрутити ковпачок пробірки MGIT й в асептичних умовах додати 0,5 мл MGIT OADC і 0,1 мл розведеної суміші антибіотиків MGIT PANTA.

2. Додати 0,5 мл концентрованої суспензії попередньо обробленої проби. Об'єм проби більше 0,5 мл може збільшити обсіменіння неспецифічною мікрофлорою. Після внесення матеріалу пробірки щільно закрити ковпачками і добре перемішати. Інкубувати в термостаті при 37 град. Цельсію.

3. Показання пробірок враховувати щодня, починаючи з другого дня інкубації. Для інтерпретації результатів застосовують пробірки з негативним (К-) і позитивним (К +) контролем.

Як негативний контроль (К -) використовується закрита незасіяна пробірка MGIT. В К- повинна спостерігатися дуже незначна флюоресценція або зовсім її не повинно бути.

Підготовка пробірки для К+:

Вилити бульйон Міддлбрука з незасіяної пробірки MGIT, наклеїти на пробірку етикетку з написом "Позитивна-контрольна", приготувати 0,4 % розчин сульфіту натрію (0,4 г на 100,0 мл стерильної дистильованої води), 5,0 мл цього розчину внести в пробірку MGIT, щільно закрити ковпачком й залишити на 1 годину при кімнатній температурі. Контрольні пробірки К + можна використовувати протягом 4 тижнів, зберігаючи при кімнатній температурі. В К + повинна спостерігатися яскрава флюоресценція (жовтогарячого кольору).

Облік показань пробірок.

1. Витягти пробірки з термостату, помістити їх під УФ-світло поряд з контрольними пробірками К + і К -. Рекомендується розміщувати під УФ-світлом один штатив з пробірками (4 по 10 пробірок) одночасно.

2. Флюоресценція виявляється як яскраво-жовтогарячий відтінок на дні пробірки і дає жовтогаряче відображення на меніску. Потім витягти цю пробірку MGIT з штативу і зрівняти з контрольними пробірками К+ і К-. Якщо флюоресценція в дослідній пробірці MGIT більше схожа на флюоресценцію в контрольній пробірці К+, то ця пробірка з позитивним результатом. Якщо ж флюоресценція більше схожа на флюоресценцію в контрольній пробірці К-, то ця пробірка з негативним результатом. Ріст можна також виявити по наявності неоднорідної каламутності, дрібних зерен або лусочок в культуральному середовищі.

3. Вміст пробірок з позитивними результатами слід пофарбувати за Цілем-Нільсеном. Наявність в мазку кислотостійких паличок рубінового кольору вказує на передбачувану присутність життєздатних мікобактерій в пробірці.

4. Облік показань пробірок з негативним результатом слід продовжувати щодня на протязі восьми тижнів, оскільки флюоресценція в пробірках MGIT може з'явитися протягом певного часу.

Пробірки з позитивним результатом можуть містити один або декілька видів мікобактерій. Мікобактерії, що швидко ростуть, можуть викликати флюоресценцію раніше мікобактерій, що ростуть повільно. Цей факт необхідно враховувати при ідентифікації мікобактерій.

Морфологію і пігментацію колоній можна визначати лише на щільних середовищах. Матеріал з пробірки MGIT з позитивним мазком кислотостійких паличок можна пересівати як на щільні, так і рідкі, живильні середовища з метою проведення в подальшому ідентифікації і визначення медикаментозної стійкості.

4.2 Визначення медикаментозної стійкості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи BBL MGIT AST SIRE

Система BBL MGIT AST SIRE являє собою швидкодіючий ручний якісний метод визначення чутливості M.tuberculosis до стрептоміцину, ізоніазиду, рифампіцину та етамбутолу.

Принцип. Індикаторна пробірка BBL MGIT для визначення медикаментозної стійкості M.tuberculosis представляє собою таку ж пробірку, як і у випадку для виявлення росту мікобактерій. Система BBL MGIT AST SIRE призначена для якісного аналізу протягом 3 - 14 днів. Цей аналіз грунтується на рості штаму M.tuberculosis в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, при порівнянні з пробіркою без препаратів. Спостереження за пробірками MGIT здійснюють щодня, починаючи з третьої доби після інокуляції. Відсутність флюоресценції в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, через дві доби після появи флюоресценції в контрольній пробірці, свідчить про чутливість M.tuberculosis до даного антимікобактеріального препарату. Флюоресценція в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, через дві доби або протягом двох діб після появи флюоресценції в контрольній пробірці, свідчить про стійкість мікобактерій до дії даного препарату.

Реактиви.

Комплект BBL MGIT AST SIRE містить по дві ліофілізовані ампули стрептоміцину, ізоніазиду, рифампіцину та етамбутолу.

Вміст в 1 ампулі ліофілізованого стрептоміцину - 160,0 мкг, ізоніазиду - 20,0 мкг, рифампіцину - 200,0 мкг, етамбутолу - 700 мкг.

Хід дослідження. В кожну ліофілізовану ампулу BBL MGIT з препаратом додати по 4,0 мл стерильної дистильованої води для отримання основних розведень препаратів: 40,0 мкг/мл для стрептоміцину, 5,0 мкг/мл для ізоніазиду, 50,0 мкг/мл для рифампіцину, 175 мкг/мл для етамбутолу.

Для визначення чутливості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням BBL MGIT необхідно попередньо виділити чисту культуру бактерій на щільному живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена або Фінна-2.

Далі слід приготувати суспензію M.tuberculosis.

1. Додати 4,0 мл BBL бульйону 7Н9 Міддлбрука в стерильну пробірку розміром 16,5 х 128 мм з ковпачком, яка містить 8 Ц 10 скляних кульок.

2. Зняти стерильною лопаткою з щільного живильного середовища якомога більше колоній, намагаючись не зачіпити середовище. Суспендувати колонії в бульйоні 7Н9 Міддлбрука. Каламутність суспензії повинна перевищувати стандарт Макфарленда 1.0.

3. Збовтувати суспензію в змішувачі протягом 2 - 3 хвилин, для того щоб розбити більш крупні грудочки.

4. Залишити суспензію відстоюватися на 20 хвилин.

5. Надосадну рідину перенести в іншу стерильну пробірку розміром 16,5 х 128 мм з ковпачком (уникати переносу будь-якої частини осаду) і залишити відстоюватися ще на 15 хвилин.

6. Перенести надосадну рідину (вона повинна бути однорідною, без грудочок) в третю пробірку.

7. Довести суспензію до стандарту Макфарленда 0.5.

8. Розвести 1,0 мл суспензії в 4,0 мл стерильного ізотонічного розчину (розведення 1:5). Інокулят готовий.

Для контрольної пробірки з негативним результатом використовується закрита не інокульована пробірка MGIT.

Позитивний контроль - пробірка MGIT, з якої видалено бульйон Міддлбрука і стерильно внесено 5,0 мл 0,4 % розчину сульфату натрію. Пробірку щільно закривають ковпачком і залишають при кімнатній температурі на 1 годину.

Контрольні пробірки не інкубують в термостаті. Їх можна використовувати багаторазово, але не більше 4 тижнів, в умовах зберігання при кімнатній температурі.

Методика інокуляції для визначення чутливості M.tuberculosis.

1. Промаркувати пробірки MGIT STR, MGIT INH, MGIT RIF, MGIT EMB, GC Цконтроль росту, а також на пробірках відмітити номери проб.

2. В асептичних умовах додати в кожну пробірку 0,5 мл MGIT OADC.

3. В асептичних умовах перенести мікропіпеткою по 100,0 мкл основних розведень антимікобактеріальних препаратів (STR, INH, RIF, EMB) в промаркіровані пробірки MGIT. В пробірку MGIT GC не додавати ніяких антибіотиків.

4. Інокулювати піпеткою 0,5 мл суспензії у співвідношенні 1:5 (див. "Приготування проби") в кожну з п'яти пробірок MGIT.

5. Інкубувати пробірки MGIT при 37 град. Цельсію.

Облік показань пробірок MGIT.

1. Витягти пробірки MGIT з термостата на третій день після інокуляції і врахувати показання за допомогою 365-нм УФ-трансосвітлювача або довгохвильового УФ-світла.

Примітка. Необхідно враховувати показання пробірок AST щодня, починаючи з третього дня, до тої пори, поки не з'явиться можливість інтерпретувати результати.

2. Порівняти пробірку MGIT GC з контрольними пробірками К- і К+. Контрольна пробірка К+ повинна давати сильну флюоресценцію (яскравого жовтогарячого кольору на дні пробірки, а також відображення жовтогарячого кольору на меніску). Контрольна пробірка К- повинна давати дуже незначну флюоресценцію.

3. Якщо флюоресценція в пробірці MGIT GC більше схожа на флюоресценцію в К+, ніж в К-, то має місце ріст мікобактерій. Як тільки в пробірці MGIT GC з'явиться позитивний результат, її використовують для інтерпретації результатів, отриманих в пробірках, які містять антимікобактеріальні препарати.

Інтерпретацію результатів в пробірках, що містять препарати, проводять в той же день, коли був отриманий позитивний результат в пробірці MGIT GC, та протягом ще двох додаткових днів.

4. Якщо пробірка MGIT GC не дає флюоресценції і більше схожа на К-, повторно інкубувати пробірки і продовжувати враховувати щодня на протязі 12 днів після інокуляції всіх пробірок. Якщо результат в пробірці MGIT GC двоїстий (важко визначити, присутня або ні флюоресценція жовтогарячого кольору), тоді слід вважати результат негативним і повторно інкубувати пробірку.

5. Якщо пробірка MGIT GC не дає позитивного результату на 12 день досліджень, це дослідження вважається недійсним.

Інтерпретація результатів досліджень.

Інтерпретувати результат, отриманий в пробірці MGIT, як чутливість, якщо пробірка, яка містить лікарський препарат, не дає флюоресценції протягом двох днів після появи флюоресценції в пробірці MGIT GC.

Інтерпретувати результат, отриманий в пробірці MGIT, як стійкість, якщо флюоресценція в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, виникає на другу добу або протягом двох днів після появи флюоресценції в пробірці MGIT GC.

Результати досліджень не піддаються інтерпретації, якщо в пробірці з контролем росту (MGIT GC) флюоресценція не виникає протягом 12 днів після інокуляції.

4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища ВКГ (стимулятор росту і середовище ВКГ) (В.В.Власенко)

В останні роки у зв'язку з широким використанням антимікобактеріальних препаратів у 19,0 - 20,0 % випадків спостерігається диспропорція між виявленням мікобактерій при бактеріоскопічному дослідженні та їх ростом при посіві патологічного матеріалу на живильні середовища. Це явище зустрічається тому, що МБТ, які спостерігаються під мікроскопом, не ростуть на загальноприйнятих живильних середовищах. Така дисоціація зумовлена впливом на МБТ антимікобактеріальних препаратів.

Для отримання більш достовірних результатів можливо використання живильного середовища ВКГ з паралельним використанням традиційних класичних середовищ (Льовенштайна-Єнсена та ін.). Ріст перших колоній на середовищі ВКГ через 2-3 доби. М.tuberculosis олігобацилярних форм та клітин зі зниженою життєздатністю і ферментативною активністю також проявляють ріст на вищезгаданому живильному середовищі через 2 - 3 доби.

Обов'язковим є постановка досліду по контролю якості живильного середовища ВКГ перед початком використання нової серії живильного середовища.

4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища ВКГ

Тритижневі культури M.tuberculosis H37Rv, вирощені на середовищі Льовенштайна-Єнсена, знімають бактеріологічною лопаткою і змішують зі стимулятором росту з розрахунку 1-2 млн. мікробних тіл в 1,0 мл суспензії. Суспензію витримують у термостаті при 37 град. Цельсію 48 годин, після чого пересівають на чашки Петрі зі свіжоприготованим живильним середовищем ВКГ. У чашку Петрі вносять 1,5 мл суспензії і рівномірно розподіляють по всій поверхні середовища, чашки Петрі не перевертають і герметично закривають клейкою стрічкою (скотчем). Посіви переглядають щодня і інкубують до 10 діб. З появою росту культури, відзначають початок росту, готують мазок, який фарбують водно-спиртовим розчином метиленового синього.

З кожної серії живильного середовища і стимулятора відбирають по 3 пробірки зі стимулятором і по 3 чашки з живильним середовищем для контролю стерильності.

На живильному середовищі після добової експозиції в стимуляторі росту штам M.tuberculosis H37Rv дає візуальний ріст, починаючи з 3 доби, рясний газонний ріст культури фіксується на 4-5 добу.

При збільшенні експозиції в стимуляторі на 1 добу підсилюється інтенсивність росту штаму M.tuberculosis H37Rv - незначний ріст визначається візуально починаючи з 2-ої доби інкубації, газонний ріст культури - на 3-ю добу спостереження.

Штам M.tuberculosis H37Rv на щільному живильному середовищі ВКГ має характерні культуральні властивості: колонії соковиті, трохи матові з жовтуватим відтінком, по консистенції вісково-маслянисті, легко відокремлюються від агару.

При мікроскопії в першу добу МБТ проростають у вигляді кулеподібних і овоїдних клітин, що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми. На 5-у добу виявляється велика кількість паличкоподібних форм, що поступово переходять в колбоподібні клітини.

За Цілем-Нільсеном мікробні клітини не забарвлюються. Однак, добре забарвлюються простими методами - розведеним фуксином і водно-спиртовим розчином метиленового синього.

Живильне середовище ВКГ зареєстровано в Україні за N 221/00-300200 000.

Перед тим, як направляти діагностичний матеріал на посів, хворому потрібно не менше, ніж на 1 добу відмінити антимікобактеріальні препарати.

Передпосівну обробку патологічного матеріалу з метою деконтамінації і покращення гомогенізації проводять згідно загальноприйнятих методик.

Після підготовки діагностичного матеріалу його центрифугують, отриманий осад для посіву на середовище ВКГ обробляють стимулятором росту, який входить до комплексу ВКГ (окремий 10,0 мл флакончик з рідиною) в співвідношенні 1:1, а взяту в асептичних умовах кров розводять стимулятором росту порівну. Отриману суспензію (дослідний матеріал + стимулятор росту) інкубують при температурі (37,0 + - 1,0) протягом 24 - 48 годин. Живильне середовище ВКГ готується безпосередньо перед застосуванням. Для цього беруть 9,0 г сухого середовища ВКГ, розмішують його в 100,0 мл дистильованої води, кип'ятять 2 - 3 хвилини до повного розплавлення агару, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у відповідний посуд, стерилізують (121,0 + - 1,0) протягом 15 хвилин у автоклаві. Після стерилізації розливають в асептичних умовах у стерильні чашки Петрі шаром 6,0 - 8,0 мм. Готове живильне середовище жовтого кольору і повинно відповідати рН 7,2 + - 0,2. Для цього дистильовану воду для його приготування треба брати з рН 7,2 + - 0,2. Після застигання середовища негайно проводять посів у дозі 1,5 мл за допомогою шприца одноразового використання на чашку Петрі. Засіяний матеріал, не перевертаючи чашки, поміщають у термостат при температурі (37,0 + - 1,0) для виявлення росту.

Для підвищення ефективності культуральної діагностики та доцільності контролю контамінації патологічного матеріалу, який підготовлений з стимулятором росту, посів проводять за загальноприйнятою методикою на додаткові живильні середовища - 5,0 % кров'яний агар, жовточно-сольовий агар.

Оцінка результатів. Проводиться візуально щодня протягом 10 діб. Ріст колоній на середовищі ВКГ проявляється у вигляді злегка жовтуватих непрозорих колоній або газонного росту, як правило, на другу-третю, а інколи на четверту добу. Наявність росту колоній на інших живильних середовищах вказує на недостатню обробку патологічного матеріалу для бактеріологічного посіву.

Отримані культури на живильному середовищі ВКГ використовуються для приготування мазків за загальноприйнятою методикою та фарбування простими методами. У першу добу мікобактерії проростають у вигляді кулеподібних і овоїдних клітин, що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми, які поступово переходять у колбоподібні клітини.

Для верифікації олігобацилярної культури мікобактерій необхідно зробити її змив. На живильне середовище наносять 2,0 - 3,0 мл стерильної дистильованої води (не фізіологічного розчину!) та за допомогою пастерівської піпетки відсмоктують отриману суспензію, переносять у стерильну центрифужну пробірку, додають 12 - 15 крапель 10,0 % розчину їдкого лугу, добре струшують до повної гомогенізації і центрифугують при 1500 обертах 10 хвилин. Отриманий осад використовують для посіву на середовища Льовенштайна-Єнсена і Фінна-2 (але без малахітового зеленого). Одержати ріст мікобактерій (бактеріальні форми) стає можливим на середовищі Фінна-2 на 10-16 добу, на середовищі Льовенштайна-Єнсена пізніше - на 18-25 добу. Приготовлені мазки культур у початковий період росту на цих живильних середовищах дозволяють знайти велику кількість дрібних і великих кулеподібних форм, іноді гіллястих. Однак, щоденна мікроскопія показує поступове збільшення паличкоподібних форм, які розташовуються зрідка паралельно, іноді під кутом чи скупченнями різної форми, але частіше зустрічаються нитковидні утворення, що складаються з паличок, вигнутих по довжині, іноді дугоподібних, потовщених на одному чи обох кінцях. Клітини в цей період не забарвлюються за Цілем-Нільсеном. У процесі подальшого росту ниткоподібні утворення деструктуризуються і розпадаються з утворенням паличкоподібних форм, характерних для мікобактерій, тонких, паличкоподібних клітин з характерною властивістю кислотостійкості.

Запропоновану методику посіву вважають дуже інформативною, а в разі необхідності проводять біологічну пробу з використанням морських свинок.

Ідентифікація M.tuberculosis. Для швидкої ідентифікації мікобактерій з олігобацилярного матеріалу можна використовувати метод мікрокультивування мікобактерій на скельцях за Прайсом та метод ПЛР.

Облік результатів. Проводиться через 8 - 10 діб інкубації в термостаті при 37 град. Цельсію. Після закінчення цього терміну пробірки з мазками автоклавують, обережно відмивають водою від крові, підсушують, фіксують над полум'ям, забарвлюють за Ціль-Нільсоном і мікроскопують під малим збільшенням мікроскопа. При позитивному результаті в мазках одержують характерні мікроколонії, що представляють собою забарвлені в червоний колір переплетені джгути, так звані "коси", які складаються з великої кількості щільно притиснутих одна до одної клітин. Корд-фактор (тригалоза-6,6-диміколат), що забезпечує зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, забезпечує ріст у вигляді серпантиновидних "кіс" і має відношення до вірулентності збудника. Слід зазначити, що предметне скельце повинно бути лише новим, без подряпин, добре відмитим, обезжиреним в суміші Нікіфорова і простерилізованим.

Важливим при диференціації є виявлення відсутності термостабільної каталази, що вказує на належність їх до M.tuberculosis або M.bovis.

Докладний опис мікробіологічного дослідження на туберкульоз з використанням середовища ВКГ зі стимулятором росту приведено в методичній розробці УМікробіологічні методи обстеження хворих на

"туберкульоз" (Методичні рекомендації (В.В.Власенко і співавт. 2001. - 24 с.)).

4.4 Генодіагностика: визначення наявності ДНК M.tuberculosis і M.bovis у діагностичному матеріалі від хворих на туберкульоз за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

В ряду сучасних генетичних технологій метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) займає особливе місце. Метод ПЛР піднімає генодіагностику на принципово інший рівень - рівень визначення ДНК чи РНК, що дозволяє провести пряме виявлення інфекційного агента, або генетичної мутації. За допомогою ПЛР одна молекула ДНК певного інфекційного агента може бути виявлена в присутності мільйонів інших молекул ДНК. Особливо ефективним виявилося застосування методу в медицині, де в останній час використовується велика кількість різних комерційних наборів для ПЛР-діагностики. Особливо наочні переваги методу для діагностики позалегеневих форм туберкульозу та визначення резистентності M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів.

Принцип. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це метод ампліфікації in vitro, за допомогою якого протягом декількох годин можна виділити і розмножити визначену послідовність ДНК у кількості, що перевищує вихідну в мільйони разів. ПЛР - це процес, що протікає в одній пробірці та складається з повторних циклів ампліфікації (розмноження, копіювання) специфічної послідовності молекули ДНК із метою одержання достатньо великої кількості копій, що можуть бути виявлені звичайними методами детекції.

Одним із ключових компонентів реакції є "праймери" - синтетичні олігонуклеотиди, що складаються з 15-30 основ, комплементарних "сайтам" (ділянкам) відпалення (приєднання) на матричній ДНК, що ідентифікується. Процес підбору ефективних праймерів для ПЛР включає дизайн, синтез, перевірку якості синтезованих праймерів, а також аналітичну і клінічну чутливість і специфічність ПЛР. Праймери підбираються на консервативні ділянки ДНК інфекційного агента таким чином, щоб забезпечити ампліфікацію тільки обраного специфічного фрагмента.

Кожен цикл ПЛР складається з трьох стадій, що протікають при різних температурах: денатурації, відпалення та подовження. Під час 1-ої стадії - денатурації - відбувається плавлення ДНК при температурі 95 град. Цельсію, при цьому нитки ДНК роз'єднуються та стають доступними для праймерів. При відпаленні ("anneling") реакційна суміш охолоджується до температури, що є оптимальною для приєднання "праймерів" до нитки ДНК. Подовження починається від праймерів і каталізується ферментом ДНК-полімеразою при оптимумі температури 72 град. Цельсію.

Полімеразна ланцюгова реакція протікає автоматично в програмованому термостаті- термоциклері (ампліфікаторі). Трьохступінчатий цикл, у результаті якого виходять точні копії ділянки матричної ДНК, що ідентифікується, повторюється 30-50 разів відповідно до заданої програми термоциклера. З кожним новим циклом число молекул матричної ДНК подвоюється, тобто кількість копій наростає в геометричній прогресії.

Хід дослідження. Виявлення збудників туберкульозу в клінічних ізолятах методом ПЛР може бути виконано за допомогою "Набору реактивів для виявлення дезоксирибонуклеїнової кислоти M.tuberculosis, М.bovis ("MYC - TEST"), що складається з трьох комплектів: N 1 - для виділення ДНК із клінічного матеріалу, N 2 - для ампліфікації ДНК M.tuberculosis, М.bovis, N 3 - для поділу ДНК методом електрофорезу в гелі агарози.

Набір MYC - TEST забезпечує ампліфікацію фрагмента інсерційного елемента IS 6110 хромосоми M.tuberculosis, М.bovis і дозволяє знайти 50 клітин мікобактерій.

Процедури підготовки проб та аналізу матеріалу прості у виконанні, не вимагають дорогого обладнання, що робить можливим застосування методу ПЛР для ідентифікації комплексу M.tuberculosis, М.bovis на базі обласних протитуберкульозних диспансерів у найближчі часи.

Використання методу підрощуваня при дослідженні харкотиння на рідкому живильному середовищі у системі MGIT з наступним добором проб і визначенням у них ДНК M.tuberculosis/bovis методом ПЛР, істотно підвищує чутливість діагностичного методу та надає йому додаткові переваги в порівнянні з традиційними культуральними методами.

Процедура аналізу клінічного матеріалу складається з 3-х етапів.

1 етап - відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики ДНК методом ПЛР

Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.

Клінічний матеріал - зразки культур, харкотиння, кров, сечу відбирають лише одноразовими інструментами та в одноразові пластикові пробірки або контейнери з кришкою, кров збирають у пробірку з консервантом (1/10 об'єму 3,0 % ЕДТА або 4,0 % цитрату натрію).

Відібрані зразки пакують у окремі пакети, щоб уникнути контамінації і доставляють у лабораторію у ізотермічному контейнері з охолоджувачем або льодом при температурі нижчій 0 град. Цельсію, протягом доби.

Відібрані зразки зберігають при температурі +4,0 град. Цельсію не більше доби, а при -20,0 град. Цельсію не більше 1 місяця. Допускається одноразове заморожування та розморожування матеріалу. Кров не заморожують і зберігають при температурі +4,0 град. Цельсію не більше 1 доби до проведення дослідження.

Попередня обробка матеріалу.

Культура мікроорганізмів. 100,0 мкл суспензії зразка культури мікроорганізмів внести в пробірку ємністю 1,5 куб. см і використовувати для виділення ДНК.

Харкотиння. До 500,0 мкл харкотиння додають 500,0 мкл спутолізина і залишають при кімнатній температурі на 30 хвилин. Центрифугують при 10 000 об/хв 5 хвилин. Надосадну рідину видаляють.

Сеча. 1 куб. см сечі помістити в пробірку, центрифугувати при 10 000 об/хв. протягом 5 хвилин. Надосадову рідину обережно видалити, залишаючи над осадом 100,0 мкл рідини. Якщо осаду практично не видно, тоді в цю ж пробірку додати ще 1 куб. см сечі та повторити процедуру центрифугування. Розчинити осад у рідині, що залишилася в пробірці та використовувати цю завись для виділення ДНК.

Кров. Для виділення ДНК використовують 100,0 мкл суцільної консервованої крові. Як консервант (антикоагулянт) використовують 3,0 % ЕДТА або 4,0 % цитрат натрію в кількості 10,0 % до об'єму крові.

Примітка. При використанні деяких наборів можуть бути передбачені спеціальні рекомендації по підготовці матеріалу для дослідження. У цьому випадку потрібно керуватися інструкцією, що додається до даного набору.

Виділення ДНК із клінічного матеріалу може проводитись за допомогою набору реактивів N 1 із набору MYC - TEST.

Порядок проведення робіт.

1. До осаду підготовленого матеріалу додати 400,0 мкл "Буфера ЛБФ і прогріти в термостаті при температурі 100 град. Цельсію на протязі 15 хвилин (кришки пробірок повинні бути щільно закритими) та охолодити при кімнатній температурі.

2. Додати в пробірки по 10,0 мкл старанно перемішаного до однорідної зависі магнітного сорбенту та перемішати.

3. Витримати 10 хвилин при кімнатній температурі, періодично (2-3 рази), струшуючи пробірку.

4. Помістити сорбент у магнітний штатив для осадження сорбенту на стінці пробірки. При відсутності магнітного штатива - осадити сорбент центрифугуванням 15 - 20 секунд при 1500 - 2000 об/хв. Надосадну рідину видалити піпеткою зі змінним наконечником.

5. До осаду в пробірці додати 300,0 мкл "Буфера ПБ 1", струсити на центрифузі-вортексі протягом 5 - 10 секунд до гомогенного стану зависі та помістити пробірку в магнітний штатив для осадження магнітного сорбенту. Надосадну рідину видалити піпеткою зі змінним наконечником.

6. До осаду в пробірці додати 500,0 мкл "Буфера ПБ 2" струсити на вортексі протягом 5 - 10 секунд до гомогенного стану та помістити пробірку в магнітний штатив для осадження магнітного сорбенту. Надосадну рідину видалити піпеткою зі змінним наконечником.

7. Повторити операцію 6. Звернути увагу на повне видалення надосадної рідини та уникати відсмоктування часток магнітного сорбенту.

8. Помістити пробірки в термостат при температурі 65 град. Цельсію на 10 хвилин, залишаючи пробірки відкритими для випаровування залишкової кількості промивної рідини.

9. Додати до осаду 30,0 мкл "Буфера ТЕ", пробірки закрити, струсити на вортексі протягом 10 секунд та інкубувати в термостаті при темпратурі 65 град. Цельсію протягом 5 хвилин.

10. Пробірки струсити на вортексі протягом 10 секунд і помістити в магнітний штатив для осадження сорбенту. Відібрати для аналізу надосадну рідину, що містить виділену ДНК. Зберігати виділену ДНК при температурі -20 град. Цельсію або -70 град. Цельсію.

Умови проведення робіт.

Не допускається повторного використання пробірок і наконечників. При проведенні робіт слід використовувати одноразові рукавички, маски й халати.

Форма випуску та пакування.

Компоненти набору, кількість пробірок, їх вміст і маркерування наведені в табл.4.2.

2 етап - власне полімеразна ланцюгова реакція. Здійснюється за допомогою комплекту N 2, який використовується для аплікації ДНК M.tuberilosis, M.bovis у пробах, що аналізуються, і отримані після виділення ДНК

Порядок проведення робіт.

1. Підпишіть і розставте в штатив необхідну кількість (що відповідає числу проб, котрі аналізуються) пробірок майстер-мікс і пробірок позитивного (К +) та негативного (К -) контролів.

2. Додайте в кожну пробірку по 20,0 мкл плр - буфера. Закрийте пробірки та залишіть їх у штативі при кімнатній температурі на 10 - 15 хвилин.

3. Струсіть кожну пробірку на вортексі або центрифузі-вортексі протягом 10 - 20 секунд до повного розчинення кольорового осаду.

4. Внесіть у пробірки для проб по 5,0 мкл відповідного матеріалу, що аналізується. В контролі (пробірки К + і К - і додайте по 5,0 мкл дейонізованої води.

5. Закрийте пробірки та перемішайте їх вміст на вортексі або центрифузі-вортексі протягом 5 сек.

Примітка. При наявності крапель рідини на стінках пробірки, помістіть пробірки в центрифугу-вортекс і центрифугуйте їх при 1500 - 2000 об/хв. Протягом 5 хвилин.

6. Додайте в кожну пробірку по 30,0 - 40,0 мкл мінерального масла (1 краплю).

7. Закрийте пробірки, розмістіть їх у термоциклер (ампліфікатор) і запустіть програму ампліфікації (табл.4.3).

Умови проведення робіт.

Роботи з набором повинні проводитись у спеціалізованій лабораторії з дотриманням загальних і спеціальних вимог роботи на обладнанні, що використовується. Не допускається повторного використання пробірок і наконечників. При проведенні робіт слід використовувати одноразові рукавички, маски й халати.