Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції

Для якісного проведення реакції ампліфікації (забезпечення необхідної чутливості, специфічності й відтворюваності) рекомендується використання ампліфікаторів (термостатів програмних) з наступними основними парметрами:

- швидкість нагрівання не менш, ніж 2,0 град. Цельсію за секунду, в діапазоні 40-97 град. Цельсію - швидкість охолоджування не менш, ніж 2,0 град. Цельсію за секунду, в діапазоні 50-97 град. Цельсію; об'єм пробірок - 0,5 - 0,6 куб. см.

Таким параметрам на цей час відповідають ампліфікатори виробництва країн СНД - тільки МС-2 "Терцик" (Росія), інших країн - типу "Mastercecler 5330 plus" (Eppendorf, Німеччина), "Progen" (Techne, Великобританія) або аналог.

Форма випуску й пакування.

Комплектність набору для ампліфікації ДНКднк M.tuberculosis, M.bovis наведена в табл.4.4.

3 этап - детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу

Порядок проведення робіт.

1. Приготування буферного розчину для електорофорезу (БЕ).

Розчинити вміст пакета з написом "Буфер для електрофорезу" в 200 куб. см дистильованої води й довести об'єм розчину до 1 л. Після приготування зберігати розчин при температурі плюс 4,0 град. Цельсію.

2. Приготування гелю агарози.

В конічну термостійку колбу, ємністю 250 куб. см внести вміст одного пакета з агарозою, додати 200 куб. см БЕ та помістити колбу на електричну плитку. Довести вміст колби до кипіння і через 10 - 20 хвилин, після того як агароза повністю розчиниться, колбу з розплавленою агарозою зняти з плитки. Розчин агарози, що отримали, повинен бути прозорим і не повинен містити окремих нерозплавлених часток.

3. Підготовка електрофоретичної камери до заливання гелю агарози.

Встановити кришку з ванночкою на камеру, а платформу для заливання гелю помістити у ванночку. Встановити гребінчик (можна встановити 2 і навіть 4 гребінчики залежно від кількості проб, що аналізуються) на платформу.

4. В колбу з розчином агарози внести 5,0 мкл етідіума броміду, старанно й обережно перемішати вміст колби рівномірними обертовими рухами. Після цього розплавлену агарозу охолодити до 50 град. Цельсію при кімнатній температурі.

5. Охолоджену до 50 град. Цельсію агарозу вилити на платформу. Товщина шару агарози повинна бути не меншою за 4 мм.

6. Після застигання гелю агарози (приблизно через 25 - 30 хвилин) обережно витягнути гребінчик, не пошкодивши при цьому карманів, платформу з агарозним гелем перенести з ванночки в електрофоретичну камеру.

7. Залити 800 куб. см розчину БЕ в електрофоретичну камеру так, щоб він вкривав агарозний гель шаром 5 - 6 мм.

8. Додати в пробірку з "Контрольним зразком ДНК" 50,0 мкл бідистильованої води. Перемішати вміст до повного розчинення осаду. Додати в розчин 10,0 мкл фарби-лідера. Внести рекомендовану кількість фарби-лідера в проби, що аналізуються, та перемішати.

Внести в одну лунку з гелем під шар БЕ 5,0 мкл приготованого "Контрольного зразка ДНК" і в інші по 5,0 - 20,0 мкл проб, що аналізуються, з попередньо внесеною фарбою-лідером так, щоб вміст заповненого пробою карману не перетікав у інший.

9. Проведення електрофорезу.

Встановити кришку на камеру, підключити електрофоретичну камеру до джерела живлення, встановити на джерелі живлення напругу в 200 V (не більш 15 V/см). Через 25 - 35 хвилин електрофоретичну камеру відключити від джерела живлення, від'єднати дроти та тільки після цього зняти кришку з електрофоретичної камери. Дістати платформу з гелем з електрофоретичної камери, дати рідині стекти й обережно промити гель дистильованою водою.

Примітка. При роботі з гелем агарози при додаванні етідіуму бромідіу і подальшому дослідженні, слід обов'язково надягати гумові рукавички!

10. Облік результатів.

Після проведення електрофорезу гель агарози виймають з приладу для електрофорезу, продивляються або (і) фотографують на фотоплівку типу "Мікрат 300" або "Ізопан" в ультрафіолетовому світлі з довжиною хвилі 254 або 310 нм з використанням флуоскопа. Продукт ампліфікації на фотоплівці видно у вигляді темної смужки. Допускається використання інших методів аналізу електрофореграм (використання цифрових або телекамер, сканування гелю).

Особливістю тест-системи, що пропонується, є наявність у "ПЛР-пробірках" ДНК внутрішнього стандарту (ВС). ВС дозволяє контролювати проходження реакції у кожній пробірці, яка утримує ДНК досліджуваного зразка, що виключає отримання помилково-негативних результатів аналізу.

Чутливість визначення - 50 геном/екв.

Розмір амплікона мішені - 229 н.п.

Розмір амплікона ВС - 335 н.п.

Можливі варіанти електрофорезу продуктів ампліфікації наведені на рис. 4.1.

Рис. 4.1 - Можливі варіанти електрофорезу продуктів ампліфікації

На рисунку 4.1 в колонці 1 смужки ампліконів відсутні. Це означає, що реакція не пройшла і аналіз необхідно повторити.

В колонці 2 видно тільки смужку ВС. Це означає, що результат негативний (у досліджуваному зразку ДНК M. tuberculosis, М. bovis відсутня або її кількість менша, ніж 50 геном/екв у 5,0 мкл розчину виділюваної ДНК).

В колонці 3 видно тільки смужку амплікона мішені - результат позитивний. ВС пригнічений великою кількістю мішеней.

В колонці 4 видно смужки ампліконів ВС та мішені. Це означає, що реакція позитивна (в 5,0 мкл розчину виділеної ДНК знаходиться 50-1000 геном/екв мікобактерій). Співвідношення інтенсивності смужок може бути різним.

В колонці 5 видно слабке світіння смужок амплікона мішені та ВС. Це свідчить, що, можливо, в реакції присутній інгібітор. Необхідно повторити аналіз.

В колонці 6 - позитивний контроль реакції (К+) пройшов нормально і вказує на те, що в пробі присутня невелика кількість мішені.

В колонці 7 - контроль пробірок Майстер-Мікс (ММ). Позитивний контроль реакції пройшов нормально.

В колонці 8 присутня тільки смужка ВС, це означає, що негативний контроль реакції (КЦ) пройшов нормально *.

* Примітка. Якщо негативний контроль проходить за варіантами 6 або 7, то необхідно з'ясувати джерело контамінації та повторити аналіз.

Форма випуску й пакування.

Компоненти набору, кількість пробірок, їх вміст і маркерування наведені в табл.4.5.

Матеріали, обладнання:

- термостат (ампліфікатор) програмний типу МС-2 "Терцик" (Росія), Mastercecler 5330 plus (Eppendorf, Німеччина; Techne, Великобританія) або аналог;

- термостат для мікропробірок, що підтримує температуру (65 + - 2) град. Цельсію типу Dri-block-BLD-701-010X (фірма Techne, Великобританія) або аналог;

- мікроцентрифуга, що розвиває прискорення 14 000 об/хв., типу А 14 (JOUAN S.A., Франція, кат. N 11174542) або аналог;

- вихровий змішувач типу Вортекс CV-1500 (Росія) або аналог;

- електрофоретична камера типу SE-1, SE-2 (Росія) або аналог;

- джерело постійного струму типу ЭЛЬФ 4, ЭЛЬФ 8 (Росія) або аналог;

- трансілюмінатор ультрафіолетовий типу Т-16-365 (Росія) або аналог;

- холодильник побутовий;

- піпетки напівавтоматичні одноканальні зі змінними наконечниками з перемінним або фіксованим об'ємом, що дозволяють відбирати об'єми рідини 5, 15, 20, 80 мкл, атестовані за значенням середньої дози й східністю результатів піпетування (похибка не більше + - 3,0 %);

- мікрохвильова піч;

- плитка електрична;

- мікропробірки ампліфікаційні ємністю 0,5 куб. см (Кат. N 00301210023, фірма Eppen-dorf, Німеччина) або аналог;

- колба конічна ємністю 250 куб. см за ДСТ 25336;

- колба конічна ємністю 1000 куб. см за ДСТ 25336;

- колба конічна ємністю 500 куб. см за ДСТ 25336;

- папір фільтрувальний лабораторний за ДСТ 12026;

- рукавички гумові хірургічні за ДСТ 3-88;

- спирт етиловий ректифікований за ДСТ 5962;

- штатив магнітний; штатив для мікропіпеток.

Необхідно пам'ятати, що існують набори для виявлення МБТ і інших фірм, тому можливо використання наборів реагентів для виявлення МБТ за допомогою ПЛР і інших фірм, зареєстрованих в Україні відповідним чином.

5.1 Критерії стійкості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів

Визначення спектра і ступеня стійкості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів має суттєве значення для тактики хіміотерапії хворих, для контролю за ефективністю лікування і визначення прогнозу захворювання. Зміна чутливості мікобактерій відзначається до усіх антимікобактеріальних препаратів, проте відрізняється за ступенем, частотою і швидкістю появи стійких варіантів. Чутливими до антимікобактеріальних препаратів вважаються ті мікобактерії туберкульозу, на які препарат у концентрації, що досягається у вогнищі інфекції, спричиняє бактеріостатичну або бактеріцидну дію, незалежно від поза- або внутрішньоклітинного їх розташування.

Відповідно до цього, критерії чутливості мікобактерій туберкульозу залежать від концентрації медикаментозного препарату у вогнищі ураження, величини максимальної терапевтичної дози препарату, його фармакокінетики. Чутливість мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів корелюється з мінімальною концентрацією препарату, що затримує (інгібує) ріст мікобактерій при стандартних умовах постановки досліду. Розподіл мікобактерій туберкульозу на чутливі і стійкі відбувається на підставі критеріїв, що встановлені клініко-лабораторними дослідженнями (табл.5.1).

Визначення медикаментозної чутливості виділених культур M.tuberculosis у вперше виявлених хворих необхідно обов'язково проводити до стрептоміцину, ізоніазиду, етамбутолу, рифампіцину. В випадку наявності стійкості до цих препаратів рекомендується проведення тесту медикаметозної чутливості до етіонаміду (або протіонаміду), канаміцину та фторхінолонам. У хворих з хронічним перебігом туберкульозу необхідно проводити визначення медикаментозної чутливості M.tuberculosis до всіх препаратів з урахуванням результатів попередніх досліджень.

Визначення медикаментозної чутливості мікобактерій туберкульозу може проводитися бактеріологічними методами в щільному або в рідкому живильному середовищі. Існують модифікації обох методів.

Модифікації методу визначення медикаментозної чутливості в рідкому середовищі представлені методом глибинного посіву мікобактерій (за Школьниковою) і методом мікрокультивування на скельцях (за Прайсом). Методи визначення чутливості мікобактерій у рідких середовищах більш трудомісткі, вимагають додаткового приготування мазків, їх фарбування і мікроскопіювання. Проте, результати визначення одержують у більш короткі терміни (від 8 до 12 діб). Метод мікрокультивування на скельцях і метод глибинного посіву застосовуються, як правило, для прямого визначення чутливості мікобактерій безпосередньо з патологічного матеріалу. При цьому в патологічному матеріалі повинно міститися не менше 1-5 мікобактерій у полі зору.

Для непрямого визначення чутливості з вирощеної культури потрібно приготувати завись в ізотонічному розчині хлористого натрію, відцентрифугувати протягом 2-3 хвилин і з надосадної рідини стерильною пастерівською піпеткою нанести 2 краплі на відстані 1,0 см одна від одної на 1/3 вузького скельця. Далі роблять так само, як і при прямому визначенні чутливості.

Модифікації методу визначення медикаментозної чутливості на щільному середовищі представлені методом абсолютних концентрацій і методом пропорцій. Ці методи менш трудомісткі, але визначення проводиться з вже виділених культур (непрямий метод). Ця обставина подовжує терміни одержання результатів. При методі пропорцій визначення чутливості відбувається шляхом засіву дозованої кількості мікобактерій, що дозволяє більш точно визначити ступінь їх чутливості.

Вибір методу залежить від можливостей лабораторії, що виконує дослідження. Для визначення чутливості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів використовується середовище Льовенштайна-Єнсена, яке прийнято за міжнародний стандарт ВООЗом.

5.1.1 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах

Принцип методу полягає у вирощуванні мікобактерій, виділених від хворого, на щільних живильних середовищах, що містять "критичні" концентрації препаратів (критерії резистентності).

Приготування зависі (суспензії) культури.

Готують гомогенну бактеріальну суспензію в 0,9 % розчині NaCl. Для цього культуру, що виросла на твердому живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена знімають тампоном, попередньо змоченим у стерильному 0,9 % розчині NaCl, при цьому тампон повинен стикатися з усією поверхнею середовища. Потім тампон занурюють в пробірку, що містить 2,0 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl, змивають культуру в рідину, попередньо розтираючи по внутрішнім стінкам пробірки. Пробірку залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі для осадження крупних часточок культури.

Суспензію культури стандартизують по бактеріальному стандарту каламутності 5 ОД. Для цього суспензію (без осаду) обережно, не торкаючись дна пробірки, відсмоктують піпеткою в іншу пробірку та розводять її ще в 10 разів в ізотонічному розчині NaCl.

Приготування щільного живильного середовища. У флакони з яєчним середовищем Льовенштайна-Єнсена до згортання додають розведення антимікобактеріальних препаратів. Розведення препаратів готують, створюючи в середовищі їх "критичні" концентрації, із таблеток або ампул для парентерального введення препарату, ці розведення можна зберігати в холодильнику протягом 2 - 3 тижнів.

Важливо відмітити, що для отримання точних та якісних результатів тесту медикаментозної чутливості в Україні буде здійснюватися поступовий перехід від таблетованих та рідких лікарських форм на більш якісні хімічно чисті субстанції лікарських препаратів провідних світових виробників (Sigma, Fatol-Arzneimittel та інш.).

5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів

Розрахунки робляться на 50,0 і 100,0 мл середовища, яке після внесення розведення відповідного препарату розливається приблизно по 5,0 мл. Таким чином отримують середовище з препаратом для визначення чутливості відповідно до 10 - 20 культур мікобактерій. Для розведень всіх препаратів користуються стерильною дистильованою водою.

Стрептоміцин

Для визначення медикаментозної чутливості до стрептоміцину використовують дигідрострептоміцинсульфат.

1-е розведення - 100,0 мг/мл: флакон, що містить 500,0 мг (0,5 г) стрептоміцину + 5,0 мл води; якщо флакон містить 1000,0 мкг/мл стрептоміцину (1,0 г), відповідно додають 10,0 мл води.

2-е розведення - 10,0 мг/мл (10 000 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 2500,0 мкг/мл: 3,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення - 250,0 мкг/мл: 1,0 мл 3-го розведення + 9,0 мл води.

Після додавання 1,0 мл 4-го розведення до 49,0 мл середовища отримаємо в ньому 5,0 мкг/мл стрептоміцину. До 98,0 мл середовища відповідно додають 2,0 мл розведення.

Ізоніазид

Беруть ампулу 5,0 мл 10,0 % розчину препарату. Вона містить в 1,0 мл 100,0 мг ізоніазиду.

1-е розведення - 10,0 мг/мл: 1,0 мл із ампули + 9,0 мл води.

2-е розведення - 1,0 мг/мл (1000 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 250,0 мкг/мл: 3,0 мл 2-го розведення + 9,0 мл води.

4-е розведення - 50,0 мкг/мл: 2,0 мл 3-го розведення + 8,0 мл води.

Після додавання 1,0 мл 4-го розведення до 49,0 мл середовища отримаємо 1,0 мкг/мл препарату. До 98,0 мл середовища відповідно додають 2,0 мл розведення.

Етіонамід (або протіонамід)

1-е розведення - 25,0 мг/мл: таблетку, що містить 250,0 мг етіонаміду (або протіонаміду), обережно розтирають в порцеляновій ступці до однорідного порошку +1,0 мл етилового спирту (для дезинфекції) + 9,0 мл води.

2-е розведення - 5,0 мг/мл: 2,0 мл із ступки + 8,0 мл води.

3-є розведення - 1,0 мг/мл (1000,0 мкг/мл): 2,0 мл 2-го розведення + 8,0 мл води.

Якщо внести 1,5 мл 3-го розведення в 48,5 мл середовища, отримаємо концентрацію препарату 30,0 мкг/мл. До 97,0 мл середовища відповідно додають 3,0 мл розведення.

Канаміцин

Беруть ампулу канаміцину, що містить 500,0 мг в 2,0 мл розчину, тобто 250,0 мг/мл.

1-е розведення - 25,0 мг/мл: 1,0 мл із ампули + 9,0 мл води.

2-е розведення - 5,0 мг/мл: 2,0 мл 1-го розведення + 8,0 мл води.

3-є розведення - 1,0 мг/мл (1000,0 мкг/мл): 2,0 мл 2-го розведення + 8,0 мл води.

Якщо внести 1,5 мл 3-го розведення в 48,5 мл середовища, отримаємо концентрацію препарату 30,0 мкг/мл. До 97,0 мл середовища відповідно додають 3,0 мл розведення.

Рифампіцин (рифадин, мікобутин)

1-е розведення - 15 мг/мл: 150,0 мг розчинного порошку рифампіцину, що міститься в ампулі для парентерального введення, розчиняють в 10,0 мл води.

Якщо ампульного рифампіцину немає, беруть капсулу, що містить 150,0 мг препарату, висипають в стерильну пробірку + 1,0 мл етилового спирту (для дезинфекції) + 9,0 мл води. Ретельно розмішують піпеткою, отриману завись щоразу перед кожним розведенням ретельно перемішують.

2-е розведення - 1,5 мг/мл (1500 мкг/мл): 1,0 мл 1-го розведення + 9,0 мл води.

3-є розведення - 1000,0 мкг/мл: 2,0 мл 2-го розведення + 1,0 мл води (краще брати вдвічі більший об'єм - 4,0 мл + 2,0 мл води).

Внести 1,0 мл 3-го розведення в 49,0 мл середовища, отримаємо 20,0 мкг/мл (або 2,0 мл в 98,0 мл середовища).

Етамбутол

1-е розведення - 20,0 мг/мл: таблетку, що містить 400,0 мг препарату, ретельно розтирають в ступці + 1,0 мл етилового спирту + 19,0 мл води.

2-е розведення - 2,0 мг/мл (2000,0 мкг/мл): 1,0 мл із ступки + 9,0 мл води.

3-є розведення - 250 мкг/мл: 1,0 мл 2-го розведення + 7,0 мл дистильованої води.

Внести 1,0 мл 3-го розведення в 49,0 мл середовища, отримаємо 10,0 мкг/мл (або 2,0 мл в 98,0 мл середовища).

Хід дослідження. Живильне середовище з різними концентраціями антимікобактеріальних препаратів розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл і згортають у скошеному вигляді при 85 градусів Цельсію протягом 30 хвилин в апараті для згортування сироватки крові. Середовище з антимікобактеріальними препаратами можна зберігати в холодильнику при температурі 2 - 4 градуса Цельсію не більше 1-го місяця. Але краще готувати свіже середовище щотижня.

Пробірки з приготованими середовищами, що містять медикаментозні препарати, і одну контрольну пробірку із середовищем, що не містить препаратів, засівають приготованою зависсю культури, по 0,2 мл у кожну пробірку (див. вище). Пробірки поміщають у нахиленому стані в термостат при 37 градусів Цельсію, на другий день закривають гумовими корками замість ватно-марлевих або парафінують, щоб запобігти висиханню середовища і ставлять вертикально. Посіви переглядають щотижня. Через 2 - 3 тижні після посіву реєструють отримані результати. При бідному рості в контролі пробірки ставлять ще на тиждень у термостат, після чого дають остаточну відповідь.

Оцінка результатів. Культура вважається чутливою, якщо в пробірці із середовищем, що містить препарат, виросло менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Тільки при наявності більше 20 колоній культура розцінюється як стійка до тієї концентрації препарату, що міститься в середовищі.

При будь-якому методі визначення чутливості мікобактерій до антимікобактеріальних препаратів необхідно кожну серію приготованого живильного середовища з препаратами перевірити, засіваючи завідомо чутливою культурою мікобактерій туберкульозу. Для контролю можна користуватися чутливим лабораторним штамом M.tuberculosis H37Rv або будь-якою старанно перевіреною чутливою культурою M.tuberculosis. Контрольна культура засівається так само, як і та, що випробовується.

Якщо середовища з препаратами приготовані правильно, контрольна культура не повинна рости при критичних концентраціях препарату, при яких не ростуть чутливі до медикаментозних препаратів штами. Поява росту контрольного штаму в пробірці з препаратом вказує на допущення помилок при приготуванні середовища з цим препаратом або на неправильне приготування бактеріальної суспензії.

5.1.2 Визначення стійкості МБТ до антимікобактеріальних препаратів методом пропорцій (метод Канетті)

Данний метод широко застосовується в усьому світі, є коректним, інформативним і точним.

Принцип методу полягає у виявленні пропорції між чутливими та стійкими особинами в популяції штаму МБТ, виділеному від хворого. Якщо кількість стійких особин до якогось антибактеріального препарату в популяції буде менше 1,0 %, такий штам вважається чутливим до даного препарату. Якщо стійкість особин в популяції більше 1,0 % - штам вважається стійким до даного препарату.

I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів

Для приготування розведень використовуються хімічно чисті (х/ч) субстанції препаратів. Субстанції розводять стерильною дистильованою водою, наважка яких перераховується згідно вказанному на етикетці коефіцієнту потенції для кожної хімічно чистої речовини.

Ізоназид (INH) (субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL)

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл і 1,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі - 0,2 мкг/мл вдповда невисокому ступеню стійкості.

Рифампцин (RMP) (субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL)

Рифампцин-натрій, коефіцінєт поправки = 1,04 х/ч речовини

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 20,0 мкг/мл і 40,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі 40,0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості.

Стрептоміцин (SM) (субстанція фірми SIGMA)

Дигідрострептоміцинсульфат, коефіцієнт поправки = 1.25 х/ч речовини

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 4,0 мкг/мл і 8,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі - 4,0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості.

Етамбутол (EMB) (субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL)

Етамбутол-2HCl, коефіцієнт поправки = 1,36 х/ч речовини

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 1,0 мкг/мл; 2,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі 2,0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості.

Протіонамід (PTH) (аналог етонаміду)

(субстанція фірми FATOL-ARZNEIMITTEL)

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації 20,0 мкг/мл і 40,0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі - 20,0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості.

Амід нікотиново кислоти (NSA) (аналог празинамду)

(субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL)

За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 1,0 г/л; 2,0 г/л і 4,0 г/л. "Критична" концентрація в середовищі 1,0 г/л відповідає невисокому ступеню стійкості.

II Приготування суспензії культури МБТ

Готують гомогенну бактеріальну суспензію в 0,9 % розчині NaCl. Для цього культуру, що виросла на твердому живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена знімається тампоном, попередньо змоченим у стерильному 0,9 % розчині NaCl, при цьому тампон повинен стикатися з усією поверхнею середовища. Потім тампон занурюють в пробірку, що містить 2,0 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl, культуру змивають в рідину, попередньо розтираючи по внутрішнім стінкам пробірки. Пробірку залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі для осадження крупних часточок культури.

Суспензію культури стандартизують по бактеріальному стандарту каламутності 1 McF. Для цього суспензію (без осаду) обережно, не торкаючись дна пробірки, вдсмоктують ппеткою в іншу пробірку з 0,9 % розчином NaCl.

З цієї суспензії готуються наступні розведення:

- 1:10 (0,9 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,1 мл суспензії);

- 1:100 - контроль 1 (К1) (1,8 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,2 мл розведення 1);

- 1:1000 - контроль 2 (К2) (1,8 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,2 мл К1);

- 1:10000 - контроль 3 (К3) (1,8 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,2 мл К2).

Пробірки маркують.

З кожної пробірки (К1, К2, К3) робиться висів бактеріальної суспензії в кількості 100,0 мкл (0,1 мл) на середовище Льовенштайна-Єнсена. Це контрольні пробірки.

З розведения 1:100 = К1 по 100,0 мкл (0,1 мл) суспензії культури засваться на пробірки з середовищем Льовенштайна-Єнсена, що містять вказан вище концентрації препаратів. Пробірки маркрують і поміщають в горизонтальному положенн в термостат при 37 град. Цельсію, наступного дня перекривають стерильними гумовими корками для запобігання висихання середовища і ставлять вертикально.

Посіви проглядають щотижня. Через 2-4 тижн. після посіву, максимум через 6 тижнів, реєструють отримані результати.

Оцінка результатів.

При обліку результатів за методом Канетт кількість колоній, що виросли в контрольній пробірці К1 (вихідне розведення мікробної суспензії 1:100) приймається за 100 %; кількість колоній, що виросли в К2 відповідає 10 % усі бактеріальній популяції; кількість колоній, що виросли в К3 відповідає 1 % бактеріально популяції.

Якщо в контрольних пробірках К1, К2, К3 при посіві досліджуваного штаму МБТ спостерігається ріст відповідно до вищезгаданих пропорцій, можна робити облік результатів стійкості в пробірках з препаратами. При цьому в К3 повинно бути більше 30 не більше 100 колоній. Інтенсивність росту в контролях в пробірках з препаратами оцінються в такий спосіб:

- - до 10 колоній;

1 + - 10-20 колоній;

2 + - 20-100 колоній, між колоніями можна бачити острівці середовища;

3 + - більше 100 колоній.

Культура МБТ є "чутливою", якщо в пробірці з "критичною" концентрацією препарату нема росту, або спостерігаться до 10 колоній, тобто менше 1 % бактеріальної популяції.

Культура МБТ є "стійкою", якщо в пробірці з "критичною" концетрацією препарату спостерігаться більше 10 колоній, тобто більше 1,0 % бактеріальної популяції.

Дослідження потрібно повторити, якщо:

- нема пропорційності росту між К1, К2, К3;

- К3 - негативний або виросло менше 30 колоній;

- К1, К2, К3 або один з них забруднено;

- забруднені пробірки з препаратами.

Результати визначення резистентності вносяться в таблицю:

Примітка: х - позначені критичні концентрації препаратів в середовищі Льовенштайна - Єнсена.

5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів

Відомо, що бактеріальна популяція, виділена з патологічного матеріалу, часто містить суміш стійких і чутливих мікобактерій. Крім того, вона може містити особини з неоднаковим ступенем стійкості до одного або до декількох медикаментозних засобів, а також мікобактерії з мульти- і полірезистентністю.

Монорезистентною вважається культура M.tuberculosis зі стійкістю до будь-якого одного препарату першого ряду. До першого ряду антимікобактеріальних препаратів відносять ізоніазид, рифампіцин, етамбутол і стрептоміцин. До полірезистентних культур відносять штами M.tuberculosis, які резистентні до двох і більше антимікобактеріальних препаратів першого ряду. Мультирезистентні варіанти M.tuberculosis - це специфічний тип полірезистентності, який спостерігається при одночасній резистентності до ізоніазиду і рифампіцину, з або без резистентності до інших антимікобактеріальних препаратів (The European Respiratory Jornal. - 2000. - V. 16. - P. 364 - 371).

Визначення чутливості M.tuberculosis, як правило, проводиться окремо до кожного антимікобактеріального препарату. Стійкість культури до двох або декількох препаратів може бути обумовлена декількома причинами: або всі мікробні особини даної культури стійкі до двох препаратів (для них введено термін "істинна" подвійна стійкість), або культура складається із суміші мікробних особин, із яких одна частина стійка до одного препарату, а інша - до іншого (для цієї категорії культур введений термін "помилкова" подвійна стійкість).