Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції

З метою виконання заходів національної програми боротьби із захворюванням на туберкульоз на 2002 - 2005 роки, затвердженої указом Президента України від 20 серпня 2001 року N 643/2001, щодо поліпшення мікробіологічної діагностіки туберкульозу в Україні

1. Затвердити Інструкцію з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції (додається).

2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Севастопольської міської державних адміністрацій та головного управління Київської міської державної адміністрації довести зазначену Інструкцію до керівників закладів охорони здоров'я і забезпечити її дотримання.

3. Головному фтизіатру МОЗ України (Фещенко Ю.І.) та директору Референс-Центру з мікробіологічної діагностики туберкульозу МОЗ України (Журило О.О.) надати пропозиції щодо проведення семінару з мікробіологічної діагностики туберкульозу для головних спеціалістів управлінь охорони здоров'я з питань лабораторної діагностики та завідуючих лабораторій протитуберкульозних закладів.

4. Наказ МОЗ СРСР від 8 червня 1978 року N 558 "Об унификации микробиологических методов исследования при туберкульозе" вважати таким, що не застосовується на території України.

5. Контроль за виконанням цього наказу покласти на першого заступника Державного секретаря Бобильову О.О.

* Складена під керівництвом Головного фтизіатра і пульмонолога України, академіка АМН України, професора Ю.І.Фещенка співробітниками Інституту фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України д.м.н. О.А.Журило, к.м.н. М.Т.Клименко, к.м.н. А.І.Барбовою, м.н.с. П.С.Трофімовою за участю д.б.н. В.В.Власенка.

В умовах широкого застосування різноманітних антимікобактеріальних препаратів змінилася біологія збудника туберкульозу. Зміни стосуються як морфології мікобактерій, так і їхньої ферментативної активності і біологічних властивостей. У зв'язку з цим значно ускладнилася мікробіологічна діагностика туберкульозу. З'явилися також деякі додаткові труднощі, пов'язані з виділенням у ряді випадків із патологічного матеріалу хворих атипових мікобактерій, діагностика яких можлива тільки з застосуванням комплексного дослідження, що включає мікробіологічні, біохімічні і біологічні методи. Таке комплексне різнобічне дослідження можливе у добре оснащених бактеріологічних лабораторіях із висококваліфікованим персоналом. За останні роки в ряді областей України створені лабораторії, що виконують усі види мікробіологічних досліджень.

Функцію Центральної референс-лабораторії України з діагностики туберкульозу виконує Референс-Центр МОЗ України, розташований на базі Інституту фтизіатрії і пульмонології ім.Ф.Г.Яновського, що співпрацює з ВООЗ з питань діагностики туберкульозу. Референс-Центр виконує весь спектр мікробіологічних досліджень з діагностики туберкульозу, розроблює, апробує й впроваджує нові методи та методики діагностики туберкульозу, здійснює спостереження за етиологічною структурою туберкульозної інфекції, циркуляцією збудників туберкульозу серед населення з метою зниження захворюваності на туберкульоз шляхом профілактичних і протиепідемічних заходів. Референс-Центр є організаційно-методичним центром, що здійснює контроль за якістю всіх досліджень, які проводяться в регіональних лабораторіях протитуберкульозних закладів країни і надає їм методичну допомогу.

Лабораторії обласних протитуберкульозних диспансерів є лабораторіями III рівня і проводять усі види бактеріологічних досліджень, що включають: 1) бактеріоскопію, 2) посів патологічного матеріалу на яєчні середовища, 3) типування виділених мікобактерій і їх таксономічну ідентифікацію, 4) визначення чутливості культур M.tuberculosis (МБТ) до антимікобактеріальних препаратів, 5) біологічну пробу: зараження лабораторних тварин з метою виявлення мікобактерій туберкульозу (при наявності віварію).

Спектр мікробіологічних досліджень, які виконуються з діагностики туберкульозу в міських та районних протитуберкульозних закладах, визначається рівнем технічного оснащення бактеріологічних лабораторій в даних закладах.

Інші лабораторії проводять бактеріоскопію досліджуваного матеріалу, посів його для виділення чистої культури M.tuberculosis (лабораторії II рівня). Периферійні лабораторії, які виконують лише бактеріоскопію харкотиння є лабораторіями I рівня (пункти мікроскопії).

Погіршення епідеміологічної ситуації в країні потребує систематичного перегляду форм і методів профілактики і виявлення туберкульозу серед населення з метою зниження інфікованості, захворюваності та зменшення резервуару туберкульозної інфекції. У більшості виявлених хворих при зверненні туберкульоз діагностується несвоєчасно. Виявлення хворих з занедбаними формами туберкульозу знижує ефективність лікування навіть при застосуванні сучасних методів хіміотерапії. Хворі-бактеріовиділювачі, які тривалий час невідомі протитуберкульозним диспансерам з причин пізньої діагностики, становлять велику епідеміологічну небезпеку для оточуючих, особливо дітей.

Під час епідемії туберкульозу в країні одним із пріоритетних напрямків в системі протитуберкульозних заходів є підвищення рівня знань лікарів з питань клініки та своєчасної діагностики перш за все заразних форм туберкульозу у хворих, які звертаються за медичною допомогою.

Стратегічним пріоритетом в системі виявлення туберкульозу за звертанням повинно бути встановлення етиологічного діагнозу на основі клінічного обстеження, рентгенологічної діагностики органів грудної клітки та мікроскопії мазка харкотиння на мікобактерії туберкульозу.

Мікроскопічному дослідженню мазка харкотиння підлягають хворі:

- з наявністю кашлю з харкотинням, або без нього, більше 3-х тижнів;

- з кровохарканням або легеневою кровотечею;

- з симптомами запалення бронхо-легеневої системи;

- з болями в грудній клітці, які пов'язані з диханням або кашлем;

- з рентгенологічними змінами в легенях з підозрою на туберкульоз;

- особи, що контактують з хворими-бактеріовиділювачами, які мають симптоми інтоксикаційного, або бронхо-плевро-легеневого синдромів.

1.1 Харкотиння

Дослідження харкотиння методом мікроскопії мазка необхідно здійснювати у всіх бактеріологічних лабораторіях протитуберкульозних закладів і клініко-діагностичних лабораторіях загальнолікувальної мережі. Хворих, у яких виявлені кислотостійкі мікобактерії, слід направляти в протитуберкульозний диспансер за місцем проживання для подальшого обстеження, підтвердження етиологічного діагнозу туберкульозу, лікування та диспансеризації.

Для одержання коректного результату важливо правильно організувати збирання харкотиння, яке слід проводити без сторонніх людей на відкритому повітрі на території закладу, де аерозолі, які містять МБТ, розсіюються, а збудники туберкульозу гинуть під впливом прямого сонячного світла, або на веранді, або в добре провітрюваній кімнаті, яка повинна кварцуватися і добре оброблятися дезинфектантами. Медичний працівник повинен детально пояснити пацієнту, як слід відкашляти харкотиння з глибоких нижніх дихальних шляхів. З цією метою слід попросити хворого зробити декілька глибоких вдихів і тільки потім похаркати в посуд з послідуючою перевіркою наявності в посуді харкотиння. Якщо харкотиння немає, або хворий не може його відхаркати, матеріал для дослідження треба одержати за допомогою подразнюючих інгаляцій.

Для запобігання зараження туберкульозом при збиранні харкотиння медичний працівник зобов'язаний бути у шапочці, масці, клейончатому фартусі та гумових рукавичках та повинен стояти позаду пацієнта.

Для виявлення кислотостійких мікобактерій в амбулаторних умовах необхідно досліджувати як мінімум 3 мазки харкотиння методом мікроскопії за Цілем-Нільсеном. Першу пробу харкотиння беруть у хворого в день звертання за медичною допомогою в присутності медперсоналу, потім йому дають посуд для збирання ранкового харкотиння (збирає самостійно) і останню (третю) пробу збирають в присутності медперсоналу в день здачі другої проби.

В стаціонарних умовах доцільно проводити дослідження харкотиння 3 доби підряд в ранкові години вище приведеним методом. Харкотиння збирається в скляні ємкості з широким горлом з кришками, а потім передається в лабораторію для дослідження.

При зберіганні та доставці харкотиння в лабораторію на дослідження необхідно також додержуватись заходів по запобіганню зараження туберкульозом. Для зберігання та перевозки використовують спеціальні контейнери або металеві бікси.

Якщо перший мазок виявився позитивним, а хворий не прийшов повторно до лікаря, хворого слід терміново розшукати і сповістити в районний протитуберкульозний диспансер, а також в заклад санітарно-епідеміологічного нагляду, з тим щоб викликати його для подальшого обстеження, встановлення діагнозу і направлення на лікування.

У хворих, що виділяють невелику кількість харкотиння, його варто збирати протягом доби за умови, що воно буде зберігатися в холодному місці (краще в холодильнику), а потім разом із ранковою порцією буде доставлене в лабораторію.

Якщо у хворого харкотиння виділяється епізодично в невеликій кількості, то треба напередодні і ранком дати відхаркувальне або застосувати метод подразнюючої аерозольної інгаляції, що підсилює секрецію бронхів і кашель.

Якщо хоча б 2 зразки харкотиння з трьох показали позитивний результат при проведенні бактеріоскопії на присутність кислотостійких паличок (КСП), то пацієнт відноситься до хворих з позитивним мазком КСП+; він своєчасно повинен бути направлений в районний або міський тубдиспансер на госпіталізацію та лікування.

Якщо з трьох зразків харкотиння, які були досліджені, 1 позитивний на КСП (КСП+), то пацієнта направляють до фтизіатра на дообстеження й вирішення питання про призначення відповідного лікування.

Якщо всі 3 мазки дали негативний результат, але симптоми хвороби стійкі й на рентгенограмі є відповідні зміни, які характерні для туберкульозного процесу, то хворому ставлять діагноз туберкульозу легень з негативним мазком КСП- й прописується відповідний лікувальний режим.

Якщо в 3-х мазках харкотиння при бактеріоскопії КСП не виявлено, але є симптоми захворювання без відповідних змін на рентгенограмі, то хворий лікується по схемі лікування гострих пневмоній.

Якщо через 2 тижні захворювання на тлі неспецифічної антибактеріальної терапії не помітно позитивних клініко-рентгенологічних змін, то у хворого повторно збирають 3 проби харкотиння 3 доби підряд для дослідження мазків методом мікроскопії за Цілем-Нільсеном. При виявленні кислотостійких мікобактерій, хоч в одному з мазків харкотиння, хворий направляється в спеціалізований стаціонар для дообстеження та лікування.

В лабораторії позитивні мазки на КСП зберігаються 6 місяців й при необхідності можуть бути консультовані або передані для ідентифікації в протитуберкульозний диспансер.

Окрім мікроскопії мазка харкотиння, пофарбованого за Цілем-Нільсеном, можливе дослідження матеріалу методом люмінесцентної мікроскопії.

Подразнюючі інгаляції.

Якщо у хворого харкотиння виділяється у невеликій кількості, то напередодні і ранком йому дають відхаркувальні препарати чи застосовується подразнювальна аерозольна інгаляція портативним інгалятором. Як інгаляційна суміш рекомендується 15,0 % розчин хлориду натрію в 2,0 - 3,0 % розчині харчової соди. Склад гіпертонічного розчину та його приготування: беруть 1,0 літр дистильованої води, добавляють 150,0 г кухонної солі, 20,0-30,0 г харчової соди, стерилізують і зберігають до 30 діб. Для провокації харкотиння необхідно інгалювання від 30,0 мл до 60,0 мл суміші, підігрітої до (42 - 45) град. Цельсію, і вдихати її не менше 10 - 15 хвилин. У зв'язку з тим, що інгаляційний розчин викликає посилену салівацію ще до появи кашлю з харкотинням, хворий повинен видалити слину в приготовлений лаборантом посуд із хлораміном і тільки після цього зібрати харкотиння для мікробіологічного дослідження. Гіперсекреція бронхіального вмісту у більшості хворих спостерігається ще протягом доби після інгаляції гіпертонічного розчину, що повинно бути використане з метою виявлення мікобактерій. Через що хворому рекомендується зібрати харкотиння для повторного дослідження протягом доби після інгаляції.

Консервування харкотиння.

При неможливості доставки в мікробіологічну лабораторію харкотиння, зібраного для мікробіологічної діагностики туберкульозу, протягом 2 - 8 годин після збору, його необхідно консервувати одним з існуючих консервантів (10,0 % водний розчин трьохзаміщеного фосфорнокислого натрію, 5,0 - 10,0 % розчин гліцерину, 10,0 % розчин натрію хлориду, 2,0 - 3,0 % розчин борної кислоти) шляхом заливання зібраного харкотиння консервантом. Останній консервант найбільш зручний в умовах спекотного клімату.

Харкотиння, зібране в скляну плювальницю, заливають консервантом у співвідношенні 1:1, герметично закривають кришкою, встановлюють у дерев'яний ящик із гніздами і пересилають разом із направленням, в якому вказане прізвище хворого й адреса, у бактеріологічну лабораторію.

1.2 Промивні води бронхів

Правила відбору і доставки промивних вод бронхів.

При відсутності у хворих харкотиння досліджують промивні води бронхів. Промивні води бронхів є матеріалом, з якого значно частіше, ніж із промивних вод шлунка, висіваються мікобактерії туберкульозу при легеневих процесах. Проте, промивання бронхів проводиться лікарем-отоларингологом, тому ця процедура доступна тільки в тих лікувальних закладах, де є такий фахівець.

Промивні води бронхів збирають в стерильний посуд, що закривається, і відразу ж доставляють в мікробіологічну лабораторію (Диагностический бронхоальвеолярный лаваж: Методические рекомендации / А.Г.Хоменко, В.П.Филиппов, К.М.Лебедев и соавт. - М., 1986.- 20 с).

Діагностичний бронхоальвеолярний лаваж (БАЛ) - безпечний метод, що забезпечує прижиттєве дослідження не респіраторних функцій легень. Дослідження бронхоальвеолярного змиву (БАЗ) істотно підвищує ефективність мікробіологічної діагностики туберкульозу. Крім того, метод дозволяє встановити визначені тенденції в зміні життєздатності клітин легень, їх функціональної активності і порушення співвідношень між окремими елементами при різних патологічних процесах. Інформативність БАЗ може бути прирівняна до біопсійних маніпуляцій, і БАЛ необхідно вважати діагностичною процедурою.

Хворому декілька разів підчас вдиху вводять шприцем у трахею 5,0-7,0 мл стерильного ізотонічного розчину, що викликає кашльовий рефлекс. При цьому разом з ізотонічним розчином відкашлюється секрет із глибоких відділів бронхіального дерева.

У хворих із вираженим рвотним рефлексом вказану процедуру виконують після попередньої анестезії надгортанника, гортані і задньої стінки глотки.

Більш доцільно проводити бактеріологічне дослідження відділку бронхів, отриманого на наступний день або через день після проведення бронхоскопії, коли у хворого з'являється самостійний продуктивний кашель з глибинних відділів бронхіального дерева.

1.3 Промивні води шлунка

Іншим методом одержання діагностичного матеріалу від хворих, що не виділяють харкотиння, є промивання шлунка. Найбільш широко цей метод застосовується в клініці дитячого туберкульозу.

M.tuberculosis потрапляють у шлунок при заковтуванні невеликих кількостей харкотиння, яке не відхаркується хворими. Промивні води шлунка беруть натщесерце. Останній прийом їжі хворим повинен бути не менше, ніж за 12 годин до взяття промивних вод шлунка. Для одержання промивних вод шлунка хворому дають випити склянку (200,0 мл) дистильованої води, тому що у водопровідній воді можуть міститися кислотостійкі сапрофіти. Після цього вводять шлунковий зонд і збирають вміст шлунка в стерильну склянку. Матеріал доставляють у лабораторію негайно.

1.4 Сеча

Для дослідження сечі використовують ранкову порцію, отриману після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Отриману сечу центрифугують. Якщо в осаді сечі патологічних елементів нема (кислотостійких паличок), то для дослідження на туберкульоз використовують добову порцію сечі, повторюючи дослідження 2-3 доби підряд.

1.5 Пунктати з закритих порожнин

(спинномозкова рідина, ексудати і трансудати з плевральної і черевної порожнин)

Беруть стерильним шприцем у стерильний посуд і відразу доставляють у лабораторію. У стерильному посуді також негайно доставляють у бактеріологічну лабораторію тканину, отриману шляхом біопсії або під час операції.

1.6 Гній із свищів, виділення ран, менструальна кров і виділення з відкритих порожнин

Беруть стерильним шприцем або стерильним ватним тампоном у стерильний посуд і доставляють у лабораторію негайно.

2.1 Деякі біологічні особливості роду Mycobacterium

(21 group Berge'ss Manual Determinative Bacteriology, Ninth Edition)

Мікробіологічні дослідження є одним з найбільш важливих діагностичних тестів при захворюваннях органів дихання, що сприяють своєчасній діагностиці збудника інфекційного процесу, визначають особливості клінічної симптоматики, дозволяють орієнтувати лікаря на ймовірний діагноз і перебіг хвороби, диктують вибір препарату для проведення адекватної антибактеріальної хіміотерапії.

До складу роду Micobacterium сімейства Micobacteriaceae включені кислото- і спиртостійкі (ознака особливо виражена у патогенних видів) аеробні нерухомі грампозитивні прямі чи вигнуті паличкоподібні бактерії. Іноді вони утворюють нитковидні чи міцеліальні структури, які фрагментуються при легкому механічному впливі, на палички чи кокоподібні елементи. Для них характерним є високий вміст ліпідів і восків (до 60,0 %) у клітинних стінках, утворених пептидогликано-арабіногалактановим комплексом; деякі види утворюють каратиноїдні пігменти, що не дифундують. Каталазо - і арилсульфатазопозитивні, резистентні до дії лізоциму. Ростуть повільно, чи дуже повільно (сапрофітні види значно швидше). Мікобактерії широко поширені в навколишньому середовищі - воді, ґрунті, у рослин і тварин. Незважаючи на те, що в даний час ідентифіковано близько 50 видів, рід нараховує близько 200 видів; типовий вид - Mycobacterium tuberculosis. За ознакою патогенності виділяють власне патогенні, що спричиняють конкретні захворювання, і атипові мікобактерії, серед яких є умовно-патогенні і сапрофітні. Для систематики атипових мікобактерій запропоновані різні класифікації, засновані на генетичній спорідненості з M. tuberculosis чи спорідненості з сапрофітними видами; серед запропонованих варіантів найбільше поширення знайшла класифікація Раньона (1959), в основу якої покладені дві властивості - колір колоній і швидкість росту. Відповідно вона виділяє 4 групи атипових мікроорганізмів.

У лабораторній практиці основними методами індикації й ідентифікації різних мікобактерій є бактеріоскопічний метод дослідження (пряма мікроскопія, мікроскопія після збагачення, люмінесцентна мікроскопія, фазовоконтрастна мікроскопія), культуральний метод (швидкість росту, форми колоній і мікроколоній, здатність до утворення пігменту, ріст при різних температурах, здатність до росту на МПА, толерантність до NaCl і деякі біохімічні особливості, що представлені нижче) і біологічний метод. Мікроскопія і бактеріологічний метод проводяться одночасно.

M.tuberculosis - тонкі, прямі чи злегка вигнуті палички розмірами 1,0 - 10,0 х 0,2-0,6 мкм, зі злегка закругленими кінцями, у цитоплазмі містять зернисті утворення (2-10). Морфологія істотно варіює в залежності від віку культури й умов культивування - в молодих культурах палички довші, а в старих схильні до простого розгалуження. Іноді утворюють коковидні структури і L-форми, що зберігають патогенність, а також фільтрівні форми, патогенна роль яких залишається недостатньо вивченою.

Нерухомі, спор не утворюють, позбавлені капсул, але мають мікрокапсулу, яка відокремлена від клітинної стінки осмієфобною зоною.

Кислотостійкі, що обумовлено високим вмістом ліпідів і міколової кислоти в клітинній стінці, а також утворюють кислотолабільні гранули, які переважно складаються з метафосфату (зерна Муха), розташовуються вільно або в цитоплазмі паличок. Грампозитивні, анілінові фарби сприймають погано; за Цілем-Нільсеном забарвлюються в яскраво-червоний колір; за Мухом-Вайссом - у фіолетовий (йодофільність); гранули забарвлюються у відповідний колір.

Аероби, але здатні рости у факультативно анаеробних умовах; 5,0 - 10,0 % вмісту СО2 сприяє більш швидкому росту. Розмножуються повільно, в середньому 14-18 годин. Температурний оптимум 37 - 38 град. Цельсію; потреба в рН 7,0-7,2 (але можуть рости в межах 4,5-8,0). Для росту мають потребу в присутності білкового субстрату і гліцерину, а також вуглецю, хлору, сірки, фосфору, азоту, факторів росту (біотину, нікотинової кислоти, рибофлавіну й ін.), іонів (Mg++, K+, Na+, Fe++). Для вирощування найчастіше використовують щільні яєчні середовища (Льовенштайна-Єнсена, Фінна-2 й ін.). На рідких середовищах ріст спостерігають на 5-7 добу у вигляді сухої зморшкуватої плівки (R - форма), що підіймається на стінки пробірки; середовище залишається прозорим. У середовищах, що містять детергент (твін-80), дають рівномірний ріст по товщі середовища (особливо при періодичному струшуванні). На рідких середовищах і при внутрішньоклітинному розвитку добре виявляється характерний корд-фактор (тригалоза-6,6-димиколат), що обумовлює зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, їх ріст у вигляді серпантиноподібних утворень ("кіс") і має відношення до вірулентності збудника. На щільних середовищах відзначають ріст у вигляді сухого зморшкуватого нальоту кремового кольору; колонії з піднятим центром, що нагадують цвітну капусту, крихкуваті, погано змочуються водою. Колонії легко знімаються з середовища, а при прожарюванні тріскотять. Під впливом антибактеріальних препаратів можуть дисоціювати з утворенням м'яких вологих S - колоній або рости у вигляді гладких чи пігментованих колоній. Відмінна риса M.tuberculosis - здатність до синтезу значної кількості нікотинової кислоти (ніацину), це використовують для її диференціальної діагностики з іншими мікобактеріями (ніациновий тест); одна з умов - необхідність посіву на середовище Льовенштайна-Єнсена, що не містить малахітового зеленого (тому що барвник вступає в реакцію з реагентами, що використані). На середовищах з жовчю утворюють сіруватий маслянистий наліт, обумовлений подовженими паличками.

Проведення широкого комплексу мікробіологічних досліджень обумовлено зміною епідеміологічної ситуації, патоморфозом туберкульозу, зміною ряду властивостей збудника, що утруднюють мікробіологічну діагностику туберкульозу.

До числа їх належить:

- олігобацилярність хворих, що виражається як невеликим числом мікобактерій у діагностичному матеріалі, так і епізодичністю бактеріовиділення. У зв'язку з цим достовірна діагностика бактеріовиділення повинна грунтуватися на серії мікробіологічних досліджень;

- зміна культуральних властивостей мікобактерій, втрата ними здатності до росту на деяких штучних живильних середовищах. Тому посів діагностичного матеріалу необхідно проводити не менш, ніж на два різні живильні середовища, чи використовувати попереднє підрощення на рідких живильних середовищах;

- зміна тинкторіальних властивостей збудника, втрата мікобактеріями кислотостійкості і пов'язана з цим недостатня інформативність бактеріоскопічних методів дослідження при фарбуванні за Цілем-Нільсеном. Додаткове використання люмінесцентної мікроскопії і комплексність мікробіологічного дослідження дозволяють виключити цю проблему;

- збільшення ролі неспецифічної мікрофлори у виникненні супутніх захворювань і ускладнень при туберкульозі. У ряді випадків, особливо у хворих з неясною етиологією захворювання, мікробіологічна ідентифікація збудника повинна проводиться за життєвими показаннями, інтервал між одержанням матеріалу від хворого і посівом його на відповідні живильні середовища має бути максимально коротким і не перевищувати 2 години.

З метою встановлення бактеріовиділення чи його відсутності кожен хворий повинен бути комплексно обстежений: дослідження харкотиння (промивних вод бронхів, трахеї, шлунку чи ін.) не менше трьох разів методом бактеріоскопії, трьохразовий посів перед початком лікування у вперше виявленого хворого, або при загостреннях і рецидивах процесу.

В період лікування зазначені дослідження (бактеріоскопія мазка і посів досліджуваного матеріалу) проводяться за схемою 2.1 до закінчення основного курсу хіміотерапії.

Примітки:

БС - бактеріоскопія;

* - якщо наприкінці 2-го місяця лікування результати бактеріоскопії мазка КСП+ (в мазку наявні КСП), є необхідним проведення бактеріоскопії наприкінці 3-го місяця лікування;

** - якщо наприкінці 6-го місяця лікування результати бактеріоскопії мазка КСП+ (в мазку наявні КСП), є необхідним проведення бактеріоскопії наприкінці 8-го місяця лікування.

В період лікування обстеження проводится після дводенної перерви в прийомі антимікобактеріальних препаратів.

2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу

Бактеріоскопічний метод дослідження залишається одним з основних. Перевага цього методу - в його швидкості. Але можливості його обмежені: при прямій бактеріоскопії мазка, забарвленого за Цілем-Нільсеном, мікобактерії туберкульозу можуть бути виявлені тільки при дуже великій їх кількості - 5 000 - 10 000 бактеріальних клітин і більше в 1,0 мл патологічного матеріалу. Хворі, особливо в процесі антибактеріальної терапії, часто виділяють мікобактерії в значно меншій кількості, тоді цей метод може виявитися недостатньо чутливим для їхнього виявлення. У таких випадках застосовують методи "збагачення" патологічного матеріалу.

Приводимо методику прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном (п.2.2.1). Метод прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном доцільно використовувати як попереднє дослідження, однак у світовій практиці і за рекомендаціями ВООЗ у даний час досліджується осад патологічного матеріалу, який отримується після попередньої гомогенізації матеріалу з наступним його центрифугуванням (метод збагачення).

2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном

Принцип методу грунтується на здатності M.tuberculosis після забарвлення їх фуксином при прогріванні утримувати барвник навіть після тривалого знебарвлення в сірчаній кислоті або в солянокислому спирті.

Реактиви

1. 1,0 % розчин основного фуксину (1,0 г основного фуксину розтирають із 2-3 краплями гліцерину, додають по краплі 10,0 мл 96 % етилового спирту і 90,0 мл 5,0 % розчину фенолу (5,0 г кристалічного фенолу або карболової кислоти в 100,0 мл дистильованої води)). Розчин лишають на добу, потім фільтрують через паперовий фільтр. Зберігають у темному місці при кімнатній температурі в добре закритому посуді.

2. Знебарвлюючі розчини: 20,0 % сірчана кислота (20,0 мл концентрованої H2SO4 додають до 80,0 мл стерильної дистильованої води); 3,0 % солянокислий спирт (3,0 мл концентрованої соляної кислои додають до 97,0 мл 70 % етилового спирту).

3. Дофарбовуючий розчин: 0,25 % метиленового синього (0,25 г метиленового синього на 1,0 л дистильованої води).

4. Фільтрувальний папір.

Всі розчини маркуються і зберігаються в посуді з темного скла при кімнатній температурі протягом 6-12 місяців.

Спеціальне обладнання

Мікроскоп з імерсійним об'єктивом

Газовий або спиртовий пальник

Предметні скельця

Дерев'яна паличка

Хід дослідження

Приготування мазка харкотиння:

Фіксуйте препарати, використовуючи один із наступних методів:

- Проведіть скельце (мазком догори) через полум'я 3-4 рази. Не перегрівайте мазок. Перед забарвленням мазок необхідно охолодити.

- Фіксуйте мазки не менше 2 годин на електронагрівачі для сушки предметних скелець (при температурі + (65 - 75) град. Цельсію).

Цінність мазків при дослідженні іншого біологічного матеріалу (не з легень)

Так як туберкульозні бактерії можуть вражати майже будь-які органи, лабораторія може отримувати для дослідження різноманітний матеріал, наприклад, біологічні рідини, тканини, гній та сечу. Результати бактеріоскопічного дослідження цих матеріалів мають обмежене значення, тому в таких випадках рекомендується використовувати культуральний метод дослідження.

Промивні води шлунка. Не слід використовувати проби промивних вод шлунка для приготування мазків, так як при цьому можуть бути отримані некоректні результати. Кислотостійкі сапрофітні бактерії нерідко присутні у воді та в харчових продуктах, з якими вони можуть потрапити в шлунок. При бактеріоскопічному дослідженні неможливо віддиференціювати такі мікроорганізми від туберкульозних бактерій.

Мазок з гортані. Мікроскопія мазків з гортані не представляє цінності. Негативні результати нічого не значать, тому краще зберегти такий матеріал для культурального дослідження.

Гній та густий аспірат. Мазки з такого матеріалу повинні бути дуже тонкими. Товсті мазки звичайно змиваються з предметних скелець, а якщо вони й зберігаються на склі, то все одно після забарвлення дуже важко віддиференціювати кислотостікі бактерії. Труднощі можуть виникнути й при наявності в мазку великої кількості крові, так як іноді елементи крові можуть бути причиною утворення кислотостійких артефактів.

Плевральна рідина. Матеріал з плевральної рідини повинен бути відцентрифугований, після чого для приготування тонкого мазку використовують осад.

Спиномозкова рідина. Мікроскопія мазків із спиномозкової рідини рідко дає позитивні результати, а осад концентрованої рідини краще використовувати для посіву.

Сеча. Мікроскопія мазків із осаду відцентрифугованої сечі не дозволяє отримати достовірні результати, тому бактеріоскопічне дослідження сечі проводити недоцільно.

Фарбування мазків.

Примітка: Для запобігання отримання хибнопозитивних результатів бактеріоскопії рекомендується знебарвлюючі та дофарбовуючі розчини наносити безпосередньо на мазок. Слід відмовитися від занурення скелець з мазками в посуд із знебарвлюючими та дофарбовуючими розчинами.

Оцінка результатів. Препарат мікроскопують під імерсією. На перегляд препарату звичайно потрібно біля 15 хвилин. Цього часу достатньо, щоб виявити поодинокі мікобактерії в препараті. В цьому випадку необхідно переглянути не менш 300 полів зору.

В останній час при мікроскопії можна спостерігати морфологічні і тінкторіальні зміни M.tuberculosis під впливом антимікобактеріальних препаратів, що приводить до утруднення диференціації їх від атипових і сапрофітних мікобактерій. Відомо, що М.tuberculosis можуть частково змінювати кислотостійкість, набувати кокоподібної, сегментоподібної форми, а також подвійних коків, розташованих бобоподібно, як всередині лейкоцитів, так і самостійно. Це ускладнює їх диференціацію.

Кількість мікобактерій в мазку (або колоній в пробірці при культуральному методі дослідження) в процесі антимікобактеріальної терапії є орієнтовним показником її ефективності або непрямим свідченням розвитку стійкості мікобактерій до антимікобактеріальних препаратів. Якщо в процесі лікування кількість мікобактерій у препараті не зменшується в порівнянні з початковим - терапію хворого варто змінити.

Дуже важливо визначити живі чи неживі мікобактерії, оскільки вирішити це питання неможливо шляхом фарбування мазка за Цілем-Нільсеном. З цією метою приготований мазок фіксують над полум'ям, фарбують 1,0 % розчином малахітового зеленого протягом 5 - 10 хвилин, підігріваючи мазок до появи парів. Після цього фарбу зливають, мазок промивають водою і забарвлюють карболовим фуксином (в розведенні 1:5) протягом 5 хвилин. При цьому живі мікобактерії фарбуються в зелений колір, а нежиттєздатні - в червоний. Цитохімічний метод визначення життєздатності мікобактерій застосовують для проб з великою кількістю мікобактерій.

Предметні скельця використовуються лише нові. Мазки з позитивними результатами знищують в установленому порядку, так як на скельцях можуть зберігатися мікобактерії попередніх аналізів.

2.2.2 Метод збагачення

У випадку відсутності мікобактерій при прямому мікроскопічному дослідженні та при наявності клінічних ознак туберкульозу застосовують різні методи обробки досліджуваного матеріалу з метою концентрації збудника - методи збагачення.

Наводимо найбільш поширену та найменш трудомістку методику збагачення досліджуваного матеріалу.

Кип'ятіння з содовим розчином

Харкотиння хворого збирають у кишенькову плювальницю в кількості 10 - 20 мл. Туди додають рівний об'єм стерильного 5,0 % розчину харчової соди (бікарбонату натрію), ставлять на водяну баню і кип'ятять протягом 45 хвилин з моменту закипання води. Далі після охолодження вміст виливають в центрифужні пробірки, центрифугують при 3500 об/хв. протягом 25 - 30 хвилин, надосадову рідину зливають, а з осаду роблять тонкі мазки, фіксують їх, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують під імерсійною системою світлового мікроскопу.

Кип'ятіння з содовим розчином широко використовується в даний час, завдяки його простоті, ефективності, доступності та безпечності.

Оцінка результатів світлової мікроскопії.

Для запобігання отримання хибнопозитивних результатів при проведенні бактеріоскопії необхідно:

- імерсійне масло наносити на скельце піпеткою, не торкаючись поверхні мазка;

- об'єктив не повинен торкатися поверхні мазка, а легко стикатися з верхнім меніском імерсійного масла.

Перегляд мазків треба робити за певною системою, це вимагає стандартизації, що гарантує перегляд найбільш репрезентативних полів у мазку. Для того, щоб переконатися в однократності проглядання полів зору, необхідно дотримуватися визначеного порядку і керуватися наступними рекомендаціями:

- перегляд мазків, забарвлених за Цілем-Нільсеном, завжди проводиться під 100 кратним об'єктивом з імерсією;

- обов'язково включати позитивний і негативний контролі. Позитивний контроль гарантує придатність розчинів до фарбування і правильність методу. Негативний контроль підтверджує відсутність у розчинах і барвниках кислотостійких артефактів;

- техніка перегляду мазка: мазок проглядається кілька разів по довжині зигзагоподібно;

- мазок можна кваліфікувати як негативний після перегляду не менше 300 полів зору. У досвідченого мікроскопіста на цю роботу піде 15 хвилин. У мазку площею 1,0 х 2,0 см кількість мікроскопічних полів зору від краю до краю буде відповідати 100. У випадку, якщо мазок явно позитивний, немає необхідності переглядати весь мазок і перегляд декількох полів (20-50) достатній для оцінки його як позитивного.

Мікроскопічне дослідження повинне показати, чи присутні в мазку кислотостійкі палички, і, якщо присутні, необхідно дати їх кількісну оцінку в полі зору. При прямій бактеріоскопії у повноцінному полі зору повинен бути присутнім один з наступних елементів бронхіального секрету: лейкоцити, еластичні волокна і миготливий епітелій. Після збагачення цих елементів немає, бо вони зникають під впливом обробки матеріалу. Результати повинні бути представлені в кількісному вираженні. При фарбуванні мазків за методом Ціля-Нільсена рекомендується наступний порядок видачі результатів:

Примітки: КСП - кислостійкі палички; п/зору - поле зору.

2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія

Люмінесцентна мікроскопія має більш високу чутливість у виявленні мікобактерій. Метод може бути використаний при різних видах обробки біологічного матеріалу. Цей метод значно збільшує діагностичну ефективність мікроскопічних досліджень. Швидкість виявлення мікобактерій, простота флюорохромування робить його широко доступним для практичних лабораторій. Перевагою методу люмінесцентної мікроскопії є те, що він дозволяє проводити дослідження при менших збільшеннях мікроскопа і, отже, переглядати в короткий термін значно більше полей зору, ніж при звичайній мікроскопії з імерсійною системою. Застосовуючи малі збільшення, вдається швидше виявити мікобактерії туберкульозу. Люмінесцентна мікроскопія дозволяє збільшити знахідки у порівнянні з прямою бактеріоскопією мазка. Цей метод крім того найбільш економічний з усіх бактеріоскопічних методів дослідження і рекомендується як основний метод в обласних протитуберкульозних диспансерах для проведення скринінгових досліджень із розрахунку 1 люмінесцентний мікроскоп на 500 тис. - 1 млн. населення.

Даний метод мікроскопії грунтується на здатності мікобактерій сприймати люмінесцентні барвники і потім світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. При цьому в залежності від застосовуваних барвників мікобактерії дають яскраво-червоне світіння на зеленому, чи золотаво-жовте на темно-зеленому тлі поля зору.

Існує ряд методик забарвлення препаратів для люмінесцентної мікроскопії: акридиновим жовтогарячим; аураміном і родаміном за Боєм; аураміном за Хагеманом; аураміном за Хагеманом в модифікації Набонна.

Для забарвлення препаратів акридиновим жовтогарячим необхідні наступні реактиви: акрединовий жовтогарячий, 3,0 % солянокислий спирт, метиловий спирт, 10,0 % розчин аміаку. З акрединового жовтогарячого готується основний розчин шляхом розчинення 1,0 г барвника в 100,0 мл дистильованої води. З основного розчину готується робочий розчин шляхом додавання 10,0 мл основного розчину до 990,0 мл дистильованої води. Сюди ж додається 3 - 6 крапель 10,0 % розчину аміаку, рН має бути не менше 9,0. Мазки готують з осаду, отриманого при обробці матеріалу для посіву, краплю якого наносять на скельце звичайним способом. Препарати фіксуються метиловим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Скельця для препаратів повинні бути новими, тонкими і без подряпин. Забарвлення препаратів здійснюють шляхом занурення фіксованих мазків у робочий розчин акридинового жовтогарячого на 24 години без підігріву. Потім мазки двічі по 10 хвилин знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом, промивають дистильованою водою, висушують у термостаті і мікроскопують.

Для забарвлення препаратів аураміном і родаміном за Боєм необхідні наступні реактиви: аурамін 00, родамін С, 3,0 % солянокислий спирт, 0,25 % водний розчин метиленової синьки. Родамін С можна заміняти подвійною кількістю родаміу 6 Ж. Робочий розчин аураміну і родаміну готується шляхом додавання 1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну до 1000,0 мл дистильованої води. Фіксований над полум'ям пальника мазок забарвлюють протягом 10 хвилин робочим розчином при легкому підігріванні, потім мазок промивають водою, знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом і знову промивають водою. Гасіння тла роблять шляхом забарвлення препарату 0,25 % розчином метиленового синього, після чого препарат промивають водою, висушують на повітрі і мікроскопують.

Методика забарвлення препарату за Хагеманом в модифікації Набонна (аураміновий метод): на фіксований мазок наливають розчин аураміну 00 на 15 хвилин (не нагрівають мазки й не використовують стрічки фільтровального папірця), потім препарат ретельно промивають водою, знебарвлюють солянокислим спиртом 3 - 5 хвилин, промивають водою, дофарбовують розчином кислого фуксину протягом 2 хвилин, ретельно промивають водою, висушують і мікроскопують. Забарвлені препарати мають малиново-червоний колір. При люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій світяться золотаво-зеленим кольором на темному чи бурувато-червоному тлі.

Методика забарвлення препаратів за Боєм в модифікації Полякової: фіксовані препарати забарвлюють розчином, що містить аурамін (1:1000) і родамін С (1:1000) протягом 20 хвилин. Потім препарат промивають водопровідною водою і знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Потім цей препарат знову промивають водою і після гасіння тла 0,25 % розчином метиленової синьки протягом 1 - 2 хвилин, промивання водою і висушування, він готовий до мікроскопії. При даному методі забарвлення в препаратах при люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій мають золотаво-жовтогарячий колір.

При люмінесцентній мікроскопії необхідно правильно (відповідно до інструкцій) користуватися освітлювальною апаратурою. Позитивна відповідь дається при виявленні не менше 3-х клітин мікобактерій у препараті. Кількість клітин мікобактерій оцінюється так само, як і в методиці світлової мікроскопії препаратів, пофарбованих за Цілем-Нільсеном.

Люмінесцентний метод мікроскопії підвищує результативність досліджень по виявленню клітин мікобактерій у досліджуваному матеріалі на 18,0 - 20,0 % у порівнянні зі світловою мікроскопією препаратів з нативного матеріалу і на 8,0 - 10,0 % - препаратів з матеріалу після збагачення. Слід зазначити, що люмінесцентна та пряма мікроскопія не дає можливості диференціювати M.tuberculosis від сапрофітних та умовно-патогенних мікобактерій.

Приготування барвників і реактивів для люмінесцентної мікроскопії

Розчин аураміну 00 і родаміну С (для забарвлення за Боєм):

1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну С розчиняють у 1000,0 мл дистильованої води (для цього розчину можна застосовувати родамін 6 Ж в кількості 0,2 г на 1000,0 мл дистильованої води).

3,0 % солянокислий спирт (для забарвлення за Боєм): 3,0 мл соляної кислоти додається до 97,0 мл 70 % спирту.

Розчин аураміну 00 (для забарвлення за Хагеманом): 1,0 г аураміну 00 розчиняють у 1000,0 мл дистильованої води. У фарбу додають 5,0 мл 5,0 % розчину карболової кислоти. Водний розчин аураміну 00 не повинен давати пластівців при додаванні в нього карболової кислоти.

Кислий фуксин (для забарвлення за Хагеманом): 1,0 г кислого фуксину розчиняється в 390,0 мл дистильованої води. До цього розчину додається 10,0 мл концентрованої оцтової кислоти.

Солянокислий спирт (для знебарвлення препаратів при забарвленні за Хагеманом): до 90,0 мл спирту-ректифікату, налитого в градуйовану посудину, доливається 4,0 мл концентрованої соляної кислоти, що димить, і висипається 4,0 г хімічно чистої кухонної солі. Потім доливається дистильована вода до мітки 100,0 мл (частина нерозчиненої кухонної солі залишається в осаді).

0,25 % розчин метиленової синьки: до 100,0 мл дистильованої води додається 0,25 г метиленового синього.

Основні розчини флюорохромів можуть зберігатися в темряві багато місяців у темних флаконах, закритих скляними притертими корками чи гумовими корками, обгорненими алюмінієвою фольгою. Робочі розчини не повинні зберігатися більше 6 - 7 діб. Фільтрувальний папір застосовувати не можна. Якщо барвник розчинений не цілком і є осад, флакон з розчином на кілька годин можна помістити в термостат при 37 град. Цельсію.

Оцінка результатів люмінесцентної мікроскопії.

Мазки, пофарбовані для люмінесцентної мікроскопії, якщо неможливо переглянути відразу після приготування, слід зберігати в темному місці, переважно в холодильнику, максимум протягом доби, оскільки з часом інтенсивність світіння флюорохромів може знижуватися.

При люмінесцентній мікроскопії мазків, як правило, використовується менше збільшення (250-630), у порівнянні зі збільшенням, використовуваним при перегляді мазків, пофарбованих за методом Ціля-Нільсена (1000). Поле зору в люмінесцентному мікроскопі охоплює більшу частину мазка, ніж при світловій мікроскопії. Представлена нижче схема дозволяє порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях, незалежно від використаного методу мікроскопії і збільшення: