Імплементаційний Регламент Комісії (ЄС) 2018/150 від 30 січня 2018 року про внесення змін до Імплементаційного регламенту (ЄС) 2016/1240 стосовно методів дослідження та оцінювання якості молока і молочних продуктів, що підпадають під дію державних інтервенцій та відповідають критеріям для надання допомоги на зберігання на складах приватного користування

ЄВРОПЕЙСЬКА КОМІСІЯ

Беручи до уваги Договір про функціонування Європейського Союзу,

Беручи до уваги Регламент Європейського Парламенту і Ради (ЄС) № 1306/2013 від 17 грудня 2013 року про фінансування, управління і моніторинг спільної сільськогосподарської політики та про скасування регламентів Ради (ЄЕС) № 352/78, (ЄС) № 165/94, (ЄС) № 2799/98, (ЄС) № 814/2000, (ЄС) № 1290/2005 і (ЄС) № 485/2008 (- 1), зокрема його статтю 62(2)(i),

Оскільки:

(1) Делегований регламент Комісії (ЄС) 2016/1238 (- 2) та Імплементаційний регламент Комісії (ЄС) 2016/1240 (- 3) установлюють правила щодо застосування державних інтервенцій та допомоги на зберігання на складах приватного користування. Регламент Комісії (ЄС) № 273/2008 (- 4) визначає методи, які слід застосовувати, щоб оцінити, чи молоко і молочні продукти відповідають вимогам допустимості, установленим у згаданих регламентах щодо державних інтервенцій та надання допомоги з метою зберігання на складах приватного користування.

(2) У світлі технічних розробок у методології, використовуваної для дослідження та оцінювання якості молока і молочних продуктів, необхідно внести істотні зміни з метою спрощення та оновлення покликань на стандарти ISO. В інтересах ясності та ефективності та беручи до уваги обсяг і технічний характер змін до положень Регламенту (ЄС) № 273/2008, відповідні положення зазначеного Регламенту необхідно інкорпорувати в Імплементаційний регламент (ЄС) 2016/1240.

(3) Щоб забезпечити уніфіковане дотримання нових стандартів і методів у всіх державах-членах, лабораторіям необхідно надати достатній період часу для перегляду процедур та застосування оновлених методів.

(4) Тому необхідно внести відповідні зміни до Імплементаційного регламенту (ЄС) № 2016/1240.

(5) В інтересах правової визначеності Регламент (ЄС) № 273/2008 необхідно скасувати.

(6) Інструменти, передбачені в цьому Регламенті, відповідають висновку Керівного комітету з питань спільної організації сільськогосподарських ринків,

УХВАЛИЛА ЦЕЙ РЕГЛАМЕНТ:

До Регламенту (ЄС) № 2016/1240 внести такі зміни:

(1) до статті 4 внести такі зміни:

(a) до параграфа 1 внести такі зміни:

(i) пункт (d) викласти у такій редакції:

"(d) для масла: у частинах I та Ia додатка IV до цього Регламенту";

(ii) пункт (e) викласти у такій редакції:

"(e) для сухого знежиреного молока: у частинах I та Ia додатка V до цього Регламенту";

(b) параграф 2 викласти у такій редакції:

"2. Методами, які мають використовуватися для визначення якості зернових культур, масла та сухого знежиреного молока, що підпадає під застосування державних інтервенцій, про які йдеться в додатках I, IV і V відповідно, повинні бути методи, що встановлені найостаннішими версіями відповідних європейських або міжнародних стандартів, у відповідних випадках, введених в дію щонайменше за 6 місяців до першого дня періоду державних інтервенцій, як визначено у статті 12 Регламенту (ЄС) № 1308/2013.";

(2) текст доповнити статтею 60a такого змісту:

"Стаття 60a

Спеціальні положення щодо перевірок, пов’язаних із державними інтервенціями та допомогою на зберігання молока і молочних продуктів на складах приватного користування

1. Допустимість масла, сухого знежиреного молока та сиру для отримання допомоги на зберігання на складах приватного користування установлюється згідно з методами, визначеними у додатках VI, VII і VIII відповідно.

Такі методи встановлюються на основі найостанніших версій відповідних європейських або міжнародних стандартів, у відповідних випадках, введених в дію щонайменше за 6 місяців до першого дня періоду державних інтервенцій, як визначено у статті 12 Регламенту (ЄС) № 1308/2013.

2. Результати перевірок, проведених із застосуванням методів, визначених у цьому Регламенті, оцінюються згідно з додатком IX.";

(3) до додатків внести зміни згідно з додатком до цього Регламенту.

Регламент (ЄС) № 273/2008 скасувати.

Цей Регламент набуває чинності на сьомий день після дня його публікації в Офіційному віснику Європейського Союзу.

Цей Регламент обов'язковий у повному обсязі та підлягає прямому застосуванню в усіх державах-членах.

Вчинено у Брюсселі 30 січня 2018 року.

До додатків до Імплементаційного регламенту (ЄС) № 2016/1240 внести такі зміни:

(1) до додатка IV внести такі зміни:

(a) у пункті 2 частини I другий підпараграф викласти в такій редакції:

"Кожну пробу оцінюють індивідуально. Повторне відбирання проб або повторне оцінювання заборонено.";

(b) текст доповнити частиною Ia такого змісту:

(2) текст додатка V доповнити частиною Ia такого змісту:

Метод: обернено-фазової ВЕРХ

Метод описує процедуру кількісного визначення фосфатидилсерину (PS) та фосфатидилетаноламіну (РЕ) у сухому знежиреному молоці (СЗМ) і підходить для виявлення сухої речовини маслянки у СЗМ.

Вміст PS + РЕ: масова частка субстанції, визначена з використанням зазначеної тут процедури. Результат виражається у міліграмах фосфатидилетаноламін дипальмітойлу (PEDP) на 100 г порошку.

Екстрагування метанолом амінофосфоліпідів з відновленого сухого молока. Визначення PS та РЕ як похідних омікрон -фталдіальдегіду (ОРА) методом обернено-фазової ВЕРХ (ОФ ВЕРХ) та флуоресцентним детектуванням. Кількісне визначення вмісту PS та РЕ у дослідній пробі шляхом зіставлення зі стандартною пробою, що містить відому кількість PEDP.

Усі реагенти повинні мати визнану аналітичну якість. Вода повинна бути дистильованою або принаймні еквівалентного ступеня чистоти, якщо не зазначено інше.

4.1. Стандартний матеріал: PEDP, чистотою щонайменше 99 %

Примітка: Стандартний матеріал зберігають за температури - 18 °С.

4.2. Реагенти для підготування стандартної проби та дослідної проби

4.2.1. Метанол потрібної для ВЕРХ якості

4.2.2. Хлороформ потрібної для ВЕРХ якості

4.2.3. Триптамін-моногідрохлорид

4.3. Реагенти для дериватизації омікрон -фталдіальдегідом

4.3.1. Гідроксид натрію, водний розчин 12 М

4.3.2. Борна кислота, водний розчин 0,4 М, доведений до pH 10,0 за допомогою гідроксиду натрію (4.3.1)

4.3.3. 2-меркаптоетанол

4.3.4. омікрон -фталдіальдегід (ОРА)

4.4. Елюенти для ВЕРХ

4.4.1. Еелюенти повинні бути приготовлені з використанням реагентів потрібної для ВЕРХ якості.

4.4.2. Вода потрібної для ВЕРХ якості

4.4.3. Метанол з флуориметрично перевіреною чистотою

4.4.4. Тетрагідрофуран

4.4.5. Дигідрофосфат натрію

4.4.6. Ацетат натрію

4.4.7. Оцтова кислота.

5.1. Аналітичні ваги, здатні зважувати з точністю до 1 мг, з дискретністю 0,1 мг

5.2. Лабораторні стакани ємністю 25 та 100 мл

5.3. Дозатори, здатні відмірювати 1 та 10 мл

5.4. Магнітна мішалка

5.5. Градуйовані дозатори, здатні відмірювати 0,2, 0,5 та 5 мл

5.6. Мірні колби ємністю 10, 50 та 100 мл

5.7. Шприци ємністю 20 та 100 мкл

5.8. Ультразвукова баня

5.9. Центрифуга, здатна досягати 27000 x g

5.10. Скляні пробірки ємністю близько 5 мл

5.11. Градуйований циліндр ємністю 25 мл

5.12. pH-метр з точністю вимірювання до 0,1 одиниць pH

5.13. Обладнання для ВЕРХ

5.13.1. Градієнтна насосна система, здатна працювати при швидкості потоку 1,0 мл/хв та тиску 200 бар

5.13.2. Автосемплер з можливістю дериватизації

5.13.3. Нагрівач колонки, здатний підтримувати температуру колонки на рівні 30 °С ± 1 °С

5.13.4. Флуоресцентний детектор, здатний працювати за довжини хвилі збудження 330 нм та довжини хвилі випромінювання 440 нм

5.13.5. Інтегратор або програмне забезпечення з можливістю вимірювання площі піків

5.13.6. Колонка LiChrospher® - 100 (250 x 4.6 мм) або еквівалентна колонка, заповнена октадецилсіланом (C 18), розмір частинок 5 мкм.

Відбирання проб здійснюють згідно зі Стандартом ISO 707.

7.1. Приготування розчину внутрішнього стандарту

7.1.1. Відмірюють 30,0 ± 0,1 мг триптамін-моногідрохлориду (4.2.3) у мірну колбу ємністю 100 мл (5.6.) і доповнюють до мітки метанолом (4.2.1)

7.1.2. Відмірюють дозатором (5.3.) 1 мл цього розчину у мірну колбу ємністю 10 мл (5.6.) і доповнюють до мітки метанолом (4.2.1), щоб отримати концентрацію триптаміну 0,15 мМ

7.2. Приготування розчину дослідної проби

7.2.1. Відмірюють 1,000 ± 0,001 г проби СЗМ у лабораторну склянку ємністю 25 мл (5.2.). Додають дозатором (5.3.) 10 мл дистильованої води температурою 40 °С ± 1 °С і змішують магнітним змішувачем (5.4.) протягом 30 хвилин, щоб розчинити всі грудки.

7.2.2. Відмірюють дозатором (5.5.) 0,2 мл відновленого молока у мірну колбу ємністю 10 мл (5.6.), за допомогою шприца (5.7.) додають 100 мкл розчину триптаміну 0,15 мМ (7.1.) і доповнюють до об’єму метанолом (4.2.1). Ретельно перемішують шляхом перевертання колби та обробляють ультразвуком (5.8.) протягом 15 хвилин.

7.2.3. Центрифугують (5.9.) за 27000 g x g протягом 10 хвилин і збирають надосадову рідину у скляну пробірку (5.10.)

Примітка: Розчин дослідної проби необхідно зберігати за температури 4 °С до проведення дослідження методом ВЕРХ.

7.3. Приготування розчину зовнішнього стандарту

7.3.1. Відмірюють 55,4 мг PEDP (4.1.) у мірну колбу ємністю 50 мл (5.6.) і додають приблизно 25 мл хлороформу (4.2.2) за допомогою градуйованого циліндра (5.11.). Нагрівають закорковану колбу до 50 °С ± 1 °С і ретельно перемішують, доки PEDP не розчиниться. Охолоджують колбу до 20 °С. доводять до об'єму метанолом (4.2.1) і перемішують шляхом перевертання.

7.3.2. Відмірюють дозатором (5.3.) 1 мл цього розчину у мірну колбу ємністю 100 мл (5.6.) і доводять до об'єму метанолом (4.2.1). Відмірюють дозатором (5.3.) 1 мл цього розчину у мірну колбу ємністю 10мл (5.6), додають 100 мкл (5.7.) розчину триптаміну 0,15 мМ (7.1.) і доводять до об'єму метанолом (4.2.1). Перемішують шляхом перевертання

Примітка: Розчин референтного зразка необхідно зберігати за температури 4 °С до проведення дослідження методом ВЕРХ.

7.4. Приготування дериватизаційного реагенту

Відмірюють 25,0 ±0,1 мг ОРА (4.3.4) у мірну колбу ємністю 10 мл (5.6.), додають дозатором (5.5.) 0.5 мл метанолу (4.2.1) і ретельно перемішують, щоб розчинити ОРА. Доповнюють до мітки розчином борної кислоти (4.3.2) і додають 20 мкл 2-меркаптоетанолу (4.3.3) за допомогою шприца (5.7.).

Примітка: Дериватизаційний реагент необхідно зберігати за температури 4 °С в ампулі з темного скла, так він залишається стабільним протягом одного тижня.

7.5. Визначення методом ВЕРХ

7.5.1. Елюенти (4.4.)

Розчинник A: Розчин дигідрофосфату натрію 0,3 мМ і розчин ацетату натрію 3 мМ (доведений до pH 6,5 ±0,1 за допомогою оцтової кислоти): метанол: тетрагідрофуран = 558:440:2 (об/об/об)

Розчинник B: метанол

7.5.2. Пропонований градієнт елюювання:

Примітка: Градієнт елюювання може потребувати незначної модифікації, щоб досягти розділення, показаного на рисунку 1.

Температура колонки: 30 °С.

7.5.3. Об’єм введення: 50 мкл дериватизаційногореагенту та 50 мкл розчину проби

7.5.4. Врівноваження колонки

Перед щоденним запуском системи колонку промивають 100 % розчином B протягом 15 хвилин, потім встановлюють співвідношення A:B = 40:60 і врівноважують при 1 мл/хв протягом 15 хвилин. Виконують холостий цикл з уведенням метанолу (4.2.1).

Примітка: Перед тривалим зберіганням колонку промивають розчином метанолу: хлороформ = 80:20 (об/об) протягом 30 хвилин.

7.5.5. Визначають вміст PS + РЕ у дослідній пробі

7.5.6. Виконують послідовність хроматографічних досліджень, дотримуючи постійний часовий інтервал між циклами, щоб отримати постійні часи утримування. Вводять розчин зовнішнього стандарту (7.3.) на кожні 5-10 розчинів дослідної проби для обчислення фактора відгуку.

Примітка: Колонку необхідно очищувати промиванням 100 % розчином B (7.5.1) протягом щонайменше 30 хвилин через кожні 20-25 циклів.

7.6. Метод інтегрування

7.6.1. Пік PEDP

PEDP елююється у вигляді одиночного піка. Визначте площу піків шляхом їх інтегрування від западини до западини.

7.6.2. Пік триптаміну

Триптамін елююється у вигляді одиночного піку (рисунок 1). Визначте площу піків шляхом інтегрування від западини до западини.

7.6.3. Групи піків PS та РЕ

За описаних умов (рисунок 1), PS елююється у вигляді двох головних, частково нерозділених піків, яким передує менший пік. РЕ елююється у вигляді трьох головних, частково нерозділених піків. Визначають повну площу кожного кластеру піків, окреслюючи базову лінію, як представлено на рисунку 1.

Вміст PS + РЕ у дослідній пробі обчислюється таким чином:

C = 55,36 x ((А2 )/(А1 )) x ((Т1 )/(Т2 ))

де:

C = Вміст PS або РЕ (мг/100 г порошку) у дослідній пробі

А1 = площа піків PEDP розчину стандартної проби (7.3.)

А2 = площа піка PS або РЕ розчину дослідної проби (7.2.)

Т1 = Площа піків триптаміну розчину стандартної проби (7.3.)

Т2 = Площа піка триптаміну розчину дослідної проби (7.2.)

Примітка: Значення повторюваності були обчислені відповідно до Міжнародного стандарту IDF (*).

9.1. Повторюваність

Відносний стандартний відхил повторюваності, що виражає варіативність незалежних аналітичних результатів, отриманих тим самим оператором, з використанням того самого обладнання за тих самих умов для дослідження тієї самої дослідної проби і в короткий інтервал часу повинен не перевищувати 2 % відносного значення. Якщо за цих умов отримані два визначення, відносна різниця між двома результатами повинна бути не більше ніж 6 % від середнього арифметичного результатів.

9.2. Відтворюваність

Якщо два визначення отримані операторами у різних лабораторіях з використанням різного обладнання, за різних умов для дослідження тієї самої дослідної проби, відносна різниця між двома результатами повинна бути не більше ніж 11 % від середнього арифметичного результатів.

10.1. Resmini Р., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., ‘Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids’. Sci. Tecn. Latt.- Cas., 39,395 (1988).

Рисунок 1

Хроматограма ВЕРХ похідних ОРА фосфатидилсерину (PS) та фосфатидилетаноламіну (РЕ) у метаноловому екстракті відновленого сухого знежиреного молока. Представлений метод інтегрування для піків PS, РЕ та триптаміну (внутрішній стандарт)

див. зображення

Цей метод уможливлює виявлення сичужної сироватки у сухому знежиреному молоці, призначеному для державного зберігання, шляхом визначення казеїномакропептидів.

Міжнародний стандарт ISO 707 - Молоко та молочні продукти - Настанови щодо відбирання проб.

Вміст сухої речовини сичужної сироватки визначають як масову частку, визначену за вмістом казеїномакропептидів в рамках описаної процедури.

- Відновлення сухого знежиреного молока, видалення жиру та білків за допомогою трихлороцтової кислоти з наступним центрифугуванням або фільтруванням;

- Визначення кількості казеїномакропептидів (СМР) у надосадовій рідині методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ);

- Оцінювання результатів дослідження проб на основі порівняння (звіряння) з результатами дослідження стандартних проб сухого знежиреного молока з доданням або без додання відомого відсотка сухої сироватки.

Усі реагенти повинні мати визнану аналітичну якість. Використовувана вода повинна бути дистильованою або принаймні еквівалентного ступеня чистоти.

5.1. Розчин трихлороцтової кислоти

Розчиняють 240 г трихлороцтової кислоти (CCl3 COOH) у воді і доводять до 1000 мл. Розчин повинен бути прозорим і безбарвним.

5.2. Елюент, pH 6,0

Розчиняють 1,74 г гідроортофосфату калію (К2 НРО4 ), 12,37 г дигідроортофосфату калію (КН2 РО4 ) і 21,41 г сульфату натрію (Na2 SO4 ) у приблизно 700 мл води. У разі необхідності, доводять до pH 6,0, використовуючи розчин фосфорної кислоти або гідроксиду калію.

Доводять до 1000 мл водою та гомогенізувати.

Примітка: Склад елюенту може бути оновлений, щоб відповідати сертифікату стандартів або рекомендаціям виробників матеріалів для наповнення колонок.

Перед використанням фільтрують елюент через мембранний фільтр з діаметром пор 0,45 мкм.

5.3. Розчин для промивання

Змішують один об’єм ацетонітрилу (CH3 CN) і дев’ять об’ємів води. Перед використанням фільтрують суміш через мембранний фільтр з діаметром пор 0,45 мкм.

Примітка: Може бути використаний будь-який інший розчин для промивання з бактерицидною дією, який не погіршує роздільну здатність колонок.

5.4. Стандартні проби

5.4.1. Сухе знежирене молоко, що відповідає вимогам цього Регламенту (тобто [0])

5.4.2. Таке саме сухе знежирене молоко з домішками 5 % (м/м) сичужного типу сухої сироватки стандартного складу (тобто [5])

6.1. Аналітичні ваги

6.2. Необов’язково: центрифуга, здатна досягати відцентрової сили 2200 g, оснащена центрифужними пробірками, закоркованими або з накінечниками, ємністю приблизно 50 мл

6.3. Механічний шейкер

6.4. Магнітна мішалка

6.5. Скляні лійки, діаметром приблизно 7 см

6.6. Фільтрувальний папір, середньої фільтрації, діаметром приблизно 12,5 см

6.7. Скляне фільтрувальне обладнання з мембранним фільтром з діаметром пор 0,45 мкм

6.8. Градуйовані дозатори, що дають змогу відмірювати 10 мл (ISO 648, клас A, або ISO/R 835) або дозувальна система, здатна відмірювати 10,0 мл за дві хвилини

6.9. Дозувальна система, здатна відмірювати 20,0 мл води за температури приблизно 50 °С

6.10. Водяна баня-термостат, установлена на температуру 25 ± 0,5 °С

6.11. Обладнання для ВЕРХ, що складається з:

6.11.1. Насоса

6.11.2. Інжектора, ручного або автоматичного, ємністю від 15 до 30 мкл

6.11.3. Двох з’єднаних послідовно колонок TSK 2000-SW (довжина 30 см, внутрішній діаметр 0,75 см) або еквівалентних колонок (напр. одинична колонка TSK 2000-SWxl, одинична колонка Agilent Technologies Zorbax GF 250) та передколонки (3 см ґ 0,3 см), заповнених I 125 або матеріалом з еквівалентною ефективністю

6.11.4. Термостатичної печі для колонки, установленої на температуру 35 ± 1 °С

6.11.5. УФ детектора зі змінною довжиною хвилі, можливістю вимірювання при 205 нм з чутливістю 0,008 А

6.11.6. Інтегратора з можливістю інтегрування від западини до западини

Примітка: Допускається робота з колонками, утримуваними за кімнатної температури, але їхня роздільна здатність є дещо нижчою. У такому випадку, коливання температури в рамках будь-якої однієї серії досліджень повинне бути менше ніж ± 5 °С.

7.1. Проби відбираються згідно з процедурою, встановленою у Міжнародному стандарті ISO 707. Проте, держави-члени можуть використовувати інший метод відбирання проб за умови, що він відповідає принципам вищезгаданого стандарту.

7.2. Пробу зберігають в умовах, які виключають будь-яке погіршення якості чи зміну складу.

8.1. Приготування розчину дослідної проби

Поміщають сухе молоко в контейнер, ємністю приблизно вдвічі більшою ніж об'єм сухої речовини, оснащений герметичною кришкою. Негайно закривають контейнер. Добре перемішують сухе молоко шляхом багаторазового перевертання контейнера.

8.2. Аналітична наважка

Відмірюють 2,000 ± 0,001 г дослідної проби у центрифужну пробірку (6.2.) або відповідну колбу з корком (50 мл).

8.3. Видалення жиру та білків

8.3.1 До аналітичної наважки додають 20,0 мл теплої води (50 °С). Розчиняють порошок шляхом струшування протягом п’яти хвилин з використанням механічного шейкера (6.3.). Пробірку поміщають у водяну баню (6.10.) і дають температурі вирівнятися до 25 °С

8.3.2. Додають поступово протягом двох хвилин 10,0 мл розчину трихлороцтової кислоти (5.1.) температурою приблизно 25 °С, одночасно енергійно перемішуючи за допомогою магнітної мішалки (6.4.). Пробірку поміщають у водяну баню (6.10.) і залишають на 60 хвилин.

8.3.3. Центрифугують (6.2.) за 2200 g протягом 10 хвилин, або фільтрують через фільтрувальний папір (6.6.), видаляючи перші 5 мл фільтрату

8.4. Хроматографічне визначення

8.4.1. Уводять від 15 до 30 мкл точно відміряної надосадової рідини або фільтрату (8.3.3) в рідинний хроматограф (6.11.), що працює за швидкості потоку 1,0 мл елюенту (5.2.) на хвилину

Примітка 1: Може бути застосована інша швидкість потоку, залежно від внутрішнього діаметру використовуваних колонок або інструкцій виробника колонки.

Примітка 2: Необхідно споліскувати колонки водою під час кожного переривання. Ніколи не можна залишати в них елюент (5.2.).

Перед будь-яким перериванням тривалістю більше ніж 24 години, споліскують колонки водою, потім промивають розчином (5.3.) протягом щонайменше трьох годин за швидкості потоку 0,2 мл на хвилину.

8.4.2. Результати хроматографічного дослідження дослідної проби [Е] отримують у вигляді хроматограми, на якій кожен пік ідентифікований за його часом утримування RT таким чином:

Вибір колонки (колонок) може мати істотний вплив на часи утримування окремих піків.

Інтегратор (6.11.6) автоматично обчислює площу А кожного піку:

Важливо уважно розглянути вигляд кожної хроматограми перед початком кількісної інтерпретації, щоб виявити будь-які аномалії, спричинені або несправністю обладнання чи колонок, або походженням чи природою досліджуваної проби.

Якщо виникають сумніви, дослідження повторюють.

8.5.1. Для стандартних проб (5.4.) точно дотримуються процедури, описаної в пунктах 8.2-8.4.2

Використовують щойно приготовані розчини, оскільки СМР розкладається у 8 % трихлороцтовому середовищі. Втрати оцінюються в 0,2 % на годину за 30 °С.

8.5.2. Перед початком хроматографічного дослідження проб, колонки кондиціонують шляхом багаторазового введення стандартної проби (5.4.2) у розчин (8.5.1), доки площа і час утримування піка, що відповідає СМР, не стануть постійними.

8.5.3. Визначають фактори відгуку R шляхом введення такого самого об’єму фільтратів (8.5.1), який використовувався для проб.

9.1. Метод обчислення та формули

9.1.1. Обчислення факторів відгуку R:

де:

RII = фактори відгуку піків II,

AII [0] = площі піків II стандартної проби [0], отримані в 8.5.3.

де:

RIII = фактор відгуку III,

АIII [0] and АIII [5] = площі піка III у стандартних пробах [0] і [5], отримані відповідно в 8.5.3,

W = кількість сироватки у стандартній пробі [5], тобто 5.

9.1.2. Обчислення відносної площі піків у пробі [E]

SII [E] = RII x AII [E]

SIII [E] = RIII x АIII [Е]

SIV [E] = RIV x AIV [E]

де:

SII [E], SIII [E], SIV = відносні площі піків II, III і VI відповідно у пробі [E],

[E]

АII [Е], АIII [Е] = площі піків II і III відповідно у пробі [Е], отримані в 8.4.2,

RII, RIII = фактори відгуку, обчислені в 9.1.1.

9.1.3. Обчислення відносного часу утримування піка III у пробі [Е]:

RRTIII [E] = (RTIII [E])/(RTIII [5])

де:

RRTIII [Е] = відносний час утримування піка III у пробі [Е],

RTIII [Е] = час утримування піка III у пробі [Е], отриманий у 8.4.2,

9.4.1. Експерименти показали, що є лінійна залежність між відносним часом утримування піка III, тобто RRT III [Е], і відсотковим вмістом сухої сироватки, доданої до 10 %

- RRTIII [Е] є < 1,000, коли вміст сироватки є > 5 %;

- RRTIII [Е] є більше або дорівнює 1,000, коли вміст сироватки є менше або дорівнює 5 %.

Допустима невизначеність для значень RRTIII становить ± 0.002.

Зазвичай значення RRTIII [0] мало відхиляється від 1,034. Залежно від стану колонок, це значення може наближатись до величини 1,000, але завжди повинне її перевищувати.

9.2. Обчислення відсоткового вмісту сичужної сухої сироватки у пробі:

W = SIII [E] - [1,3 + (SIII [0] -0,9)]

де:

9.3. Точність процедури

9.3.1. Повторюваність

Різниця між результатами двох визначень, проведених одночасно або безпосередньо одне за одним тим самим аналітиком з використанням того самого обладнання на ідентичному дослідному матеріалі, повинна не перевищувати 0,2 % м/м.

9.3.2. Відтворюваність

Різниця між двома одиничними і незалежними результатами, отриманими у двох різних лабораторіях на ідентичному дослідному матеріалі, повинна не перевищувати 0,4 % м/м.

9.4. Інтерпретація

Припускають відсутність сироватки, якщо відносна площа піка III, SIII [Е], виражена в грамах сичужної сироватки на 100 г продукту, становить менше або дорівнює 2.0 + (SIII [0] - 0,9).

де

9.4.2. Якщо відносна площа піка III, S III [Е], є > 2.0 + (S III [0] - 0.9), а відносна площа піка III, S II [Е] менше або дорівнює 160, вміст сичужної сироватки визначають як вказано в пункті 9.2.

9.4.3. Якщо відносна площа піка III, S III [Е], є > 2.0 + (S III [0] - 0.9), а відносна площа піка II, II n [Е] менше або дорівнює 160, визначають загальний вміст білка (Р %); потім розглядають графіки 1 і 2.

9.4.3.1. Дані, отримані після дослідження проб сухого знежиреного молока без домішок із високим загальним вмістом білка, згруповані на графіках 1 і 2.

Суцільна лінія представляє лінійну регресію, коефіцієнти якої обчислюються методом найменших квадратів.

Пунктирна пряма лінія визначає верхню межу відносної площі піка III з імовірністю того, що її не буде перевищено у 90 % випадків.

Пунктирні прямі лінії на графіках 1 і 2 мають такі рівняння:

де відповідно:

SIII це відносна площа піка III, обчислена або за загальним вмістом білка, або за відносною площею піка SII [Е],

Р % це загальний вміст білка, виражений як відсотковий вміст, за масою,

SII [Е] це відносна площа проби, обчислена в пункті 9.1.2.

Ці рівняння еквівалентні величині 1,3, згаданій у пункті 9.2.

Розбіжність (Т1 та Т2 ) між установленою відносною площею SIII [Е] та відносною площею SIII виражається таким способом: Т1 = SIII [E] - [(0,376 Р % - 10,7) + (SIII [0] - 0,9)]Т2 = SIII [E] - (0,0123 SII [E] + 0,93) + (SII [0] - 0,9)]

Вміст сичужної сироватки обчислюється за такою формулою: W = Т2 + 0.91

де:

0,91 - це відстань по вертикальній осі між суцільною і пунктирною прямими лініями.

1. МЕТА: ВИЯВЛЕННЯ ДОМІШОК СУХОЇ РЕЧОВИНИ СИЧУЖНОЇ СИРОВАТКИ ДО СУХОГО ЗНЕЖИРЕНОГО МОЛОКА

2. ПЕРЕЛІК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ: МІЖНАРОДНИЙ СТАНДАРТ ISO 707

3. ВИЗНАЧЕННЯ

Вміст сухої речовини сичужної сироватки визначають як масову частку, визначену за вмістом казеїномакропептидів в рамках описаної процедури.

4. ПРИНЦИП

Проби досліджують на казеїномакропептид A в рамках процедури обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії (процедура ВЕРХ). Оцінювання результатів дослідження проб на основі порівняння (звіряння) з результатами дослідження стандартних проб сухого знежиреного молока з доданням або без додання відомого відсотка сухої сироватки. Результати вище ніж 1 % (м/м) вказують на присутність сухої речовини сичужної сироватки.

5. РЕАГЕНТИ

Усі реагенти повинні мати визнану аналітичну якість. Використовувана вода повинна бути дистильованою або принаймні еквівалентного ступеня чистоти. Ацетонітрил повинен бути спектроскопічної якості або потрібної для ВЕРХ якості.

5.1. Розчин трихлороцтової кислоти

Розчиняють 240 г трихлороцтової кислоти (CCl3 COOH) у воді і доводять до 1000 мл. Розчин повинен бути прозорим і безбарвним.

5.2. Елюенти A та B

Елюент A: 150 мл ацетонітрилу (CH3 CN), 20 мл ізопропанолу (СН3 СНОНСН3 ) та 1,00 мл трифтороцтової кислоти (TFA, CF3 COOH) поміщають у мірну колбу ємністю 1000 мл. Доводять до 1000 мл водою.

Елюент B: 550 мл ацетонітрилу, 20 мл ізопропанолу та 1,00 мл TFA поміщають у мірну колбу ємністю 1000 мл. Доводять до 1000 мл водою. Перед використанням фільтрують елюент через мембранний фільтр з діаметром пор 0,45 мкм.

5.3. Консервація колонки

Після проведення досліджень колонку промивають елюентом B (за допомогою градієнта), а потім промивають ацетонітрилом (за допомогою градієнта протягом 30 хвилин). Колонку зберігають в ацето нітрилі.

5.4. Стандартні проби

5.4.1. Сухе знежирене молоко, що відповідає вимогам для державного зберігання (тобто [0]).

5.4.2. Таке саме сухе знежирене молоко з домішками 5 % (м/м) сичужного типу сухої сироватки стандартного складу (тобто [5]).

5.4.3. Таке саме сухе знежирене молоко з домішками 50 % (м/м) сичужного типу сухої сироватки стандартного складу (тобто [50]).

6. ОБЛАДНАННЯ

6.1. Аналітичні ваги

6.2. Необов’язково: центрифуга, здатна досягати відцентрової сили 2200 g, оснащена центрифужними пробірками, закоркованими або з накінечниками, ємністю приблизно 50 мл

6.3. Механічний шейкер

6.4. Магнітна мішалка

6.5. Скляні лійки, діаметром приблизно 7 см

6.6. Фільтрувальний папір, середньої фільтрації, діаметром приблизно 12,5 см

6.7. Скляне фільтрувальне обладнання з мембранним фільтром з діаметром пор 0,45 мкм

6.8. Градуйовані дозатори, що дають змогу відмірювати 10 мл (ISO 648, клас A, або ISO/R 835), або дозувальна система, здатна відмірювати 10,0 мл за дві хвилини

6.9. Дозувальна система, здатна відмірювати 20,0 мл води за температури приблизно 50 °С

6.10. Водяна баня-термостат, установлена на температуру 25 ± 0,5 °С

6.11. Обладнання для ВЕРХ, що складається з:

6.11.1. Бінарної градієнтної насосної системи

6.11.2. Інжектора, ручного або автоматичного, ємністю 100 мкл

6.11.3. Колонки Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (довжина 25 см, внутрішній діаметр 0,46 см) або еквівалентної колонки на базі широкопористого силікагелю для обернено-фазової хроматографії

6.11.4. Термостатичної печі для колонки, установленої на температуру 35 ± 1 °С

6.11.5. УФ детектора зі змінною довжиною хвилі, можливістю вимірювання при 210 нм (якщо необхідно, можна використовувати вище значення довжини хвилі до 220 нм) з чутливістю 0,02 А

6.11.6. Інтегратора з можливістю інтегрування по спільній базовій лінії або від западини до западини

Примітка: Допускається робота колонки за кімнатної температури за умови, що кімнатна температура не коливається більш ніж на 1 °С, інакше спостерігається занадто велика варіація в часі утримування СМРА.

7. ВІДБИРАННЯ ПРОБ

7.1. Проби відбираються згідно з процедурою, встановленою у Міжнародному стандарті ISO 707. Проте, держави-члени можуть використовувати інший метод відбирання проб за умови, що він відповідає принципам вищезгаданого стандарту.

7.2. Пробу зберігають в умовах, які виключають будь-яке погіршення якості чи зміну складу.

8. ПРОЦЕДУРА

8.1. Приготування розчину дослідної проби

Поміщають сухе молоко в контейнер, ємністю приблизно вдвічі більшою ніж об'єм сухої речовини, оснащений герметичною кришкою. Негайно закривають контейнер. Добре перемішують сухе молоко шляхом багаторазового перевертання контейнера.

8.2. Аналітична наважка

Відмірюють 2,00 ± 0,001 г дослідної проби у центрифужну пробірку (6.2.) або відповідну колбу з пробкою (50 мл).

Примітка: У випадку сумішей, відмірюють таку кількість дослідної проби, щоб знежирена наважка проби відповідала 2,00 г.

8.3. Видалення жиру та білків

8.3.1. До аналітичної наважки додають 20,0 мл теплої води (50°С). Розчиняють порошок шляхом струшування протягом п’яти хвилин з використанням механічного шейкера (6.3.). Пробірку поміщають у водяну баню (6.10.) і дають температурі вирівнятися до 25°С

8.3.2. Додають поступово протягом двох хвилин 10,0 мл розчину трихлороцтової кислоти (5.1.) температурою приблизно 25 °С, одночасно енергійно перемішуючи за допомогою магнітної мішалки (6.4.). Пробірку поміщають у водяну баню (6.10.) і залишають на 60 хвилин.

8.3.3 Центрифугують (6.2.) за 2200 g протягом 10 хвилин, або фільтрують через фільтрувальний папір (6.6.), видаляючи перші 5 мл фільтрату

8.4. Хроматографічне визначення

8.4.1. Метод обернено-фазової ВЕРХ виключає можливість отримання хибно-позитивних результатів завдяки присутності кислої маслянки в порошку.

8.4.2. Перед проведенням дослідження методом обернено-фазової ВЕРХ необхідно оптимізувати умови градієнта. Час утримування 26 ± 2 хвилини для СМРА є оптимальним для градієнтних систем з мертвим об'ємом близько 6 мл (об'єм від точки, в якій розчинники змішуються, до об'єму в петлі інжектора включно). Для градієнтних систем з меншим мертвим об'ємом (напр., 2 мл) необхідно застосовувати 22 хвилини як оптимальний час утримування.

Беруть розчини стандартних проб (5.4.) з доданням 50 % сичужної сироватки та без такого додання.

Уводять 100 мкл надосадової рідини або фільтрату (8.3.3) в рідинних хроматограф, що працює за умов градієнта, виявленого емпіричним шляхом, наведених у таблиці 1.