Імплементаційний Регламент Комісії (ЄС) 2018/150 від 30 січня 2018 року про внесення змін до Імплементаційного регламенту (ЄС) 2016/1240 стосовно методів дослідження та оцінювання якості молока і молочних продуктів, що підпадають під дію державних інтервенцій та відповідають критеріям для надання допомоги на зберігання на складах приватного користування

Порівняння двох хроматограм повинне виявити місце розташування піка СМРА.

Використовуючи наведену нижче формулу, початковий склад розчину, який має бути використаний для нормального градієнта (див. 8.4.3), можна обчислити як % B = 10 - 2,5 + (13,5 + (RTcmpA - 26)/6) * 30/27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA - 26)/6) * 1,11

де:

8.4.3. Уведення розчинів дослідних проб

Уводять 100 мкл точно відміряної надосадової рідини або фільтрату (8.3.3) в рідинний хроматограф, що працює за швидкості потоку 1,0 мл елюенту (5.2.) на хвилину.

Склад елюенту на початку дослідження отримують з пункту 8.4.2. Зазвичай він близький до A:B = 76:24 (5.2.). Відразу після введення починається лінійний градієнт, який дає 5 % збільшення відсотка B через 27 хвилин. Потім починається лінійний градієнт, який доводить склад елюенту до 90 % B за п'ять хвилин. Цей склад утримується протягом п’яти хвилин, після чого, через лінійний градієнт, змінюється за п'ять хвилин до початкового складу. Залежно від внутрішнього об'єму насосної системи, наступне введення можна здійснювати через 15 хвилин після досягнення початкових умов.

Примітка 1: Час утримування СМРA повинен становити 26 ± 2 хвилини. Цього можна досягнути шляхом варіювання початкових та кінцевих умов першого градієнта. Проте, різниця у % B для початкових та кінцевих умов першого градієнта повинна залишатись на рівні 5 % B.

Примітка 2: Елюенти повинні бути дегазовані достатньою мірою і залишатись у такому стані. Це є суттєво важливим для належного функціонування градієнтної насосної системи. Стандартний відхил для часу утримування піка СМРA повинен бути меншим ніж 0,1 хвилини (n = 10).

Примітка 3: Через кожні п'ять проб необхідно вводити референтний зразок [5] і використовувати для обчислення нового фактора відгуку R. (9.1.1).

8.4.4. Результати хроматографічного дослідження дослідної проби (Е) отримують у вигляді хроматограми, на якій пік СМР А ідентифікують за його часом утримування у близько 26 хвилин.

Інтегратор (6.11.6) автоматично обчислює висоту Н піка СМРA. Місце розташування базової лінії необхідно перевіряти у кожній хроматограмі. Дослідження або інтегрування необхідно повторити, якщо базова лінія неправильно розташована.

Примітка: Якщо пік СМРА достатньо відділений від інших піків, необхідно застосовувати базову лінію від западини до западини, в іншому випадку застосовують опущення перпендикулярів до спільної базової лінії, початкова точка яких повинна бути близько до піка СМРA (отже, не за t = 0 хв!). Використовують такий самий тип інтегрування для стандарту і для проб та, у випадку застосування спільної базової лінії, перевіряють її послідовність для проб та стандарту.

Важливо уважно розглянути вигляд кожної хроматограми перед початком кількісної інтерпретації, щоб виявити будь-які аномалії, спричинені або несправністю обладнання чи колонок, або походженням чи природою досліджуваної проби. Якщо виникають сумніви, дослідження повторюють.

8.5. Калібрування

8.5.1. Для стандартних проб (5.4.1-5.4.2) точно дотримуватися процедури, описаної в пунктах 8.2.-8.4.4. Використовують щойно приготовані розчини, оскільки СМР розкладається у 8 % трихлороцтовому середовищі за кімнатної температури. За 4 °С розчин залишається стабільним впродовж 24 годин. У випадку тривалих серій досліджень, бажано використовувати охолоджений лоток для проб в автоматичному інжекторі.

Примітка: Пункт 8.4.2. можна пропустити, якщо значення % В за початкових умов відоме з попередніх досліджень.

Хроматограма референтного зразка [5] повинна бути аналогічною до представленої на рисунку. 1. На цьому рисунку пікові СМРА передують два менші піки. Важливо отримати подібне розділення.

8.5.2. Перед початком хроматографічного визначення проб вводять 100 мкл стандартної проби без сичужної сироватки [0] (5.4.1)

Хроматограма не повинна показувати піка в час утримування СМРА

8.5.3. Визначають фактори відгуку R шляхом введення такого самого об’єму фільтрату (8.5.1), який використовувався для проб.

9. ВИРАЖЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

9.1. Метод обчислення та формули

9.1.1. Обчислення фактора відгуку R:

Пік СМРА: R = W/H

де:

R = фактор відгуку піка СМРА

Н = висота піка СМРА

W = кількість сироватки у стандартній пробі [5].

9.2. Обчислення відсоткового вмісту сухої сичужної сироватки у пробі:

W(E) = R x Н(Е)

де:

W(E) = відсотковий вміст (м/м) сичужної сироватки у пробі (Е).

R = фактор відгуку піка СМРА (9.1.1)

Н(Е) = висота піка СМРА проби (Е)

Якщо W(E) більше ніж 1 %, а різниця між часом утримування дослідної проби та часом утримування стандартної проби [5] є менша ніж 0,2 хвилини, це свідчить про присутність сухої речовини сичужної сироватки.

9.3. Точність процедури

9.3.1. Повторюваність

Різниця між результатами двох визначень, проведених одночасно або безпосередньо одне за одним тим самим аналітиком з використанням того самого обладнання на ідентичному дослідному матеріалі, повинна не перевищувати 0,2 % м/м.

9.3.2. Відтворюваність

Не визначена.

9.3.3. Лінійність

В діапазоні від 0 до 16 % сичужної сироватки повинна бути отримана лінійна залежність з коефіцієнтом кореляції > 0,99.

9.4. Інтерпретація

Межа, що становить 1 %, включає невизначеність, пов’язану з відтворюваністю.

Рисунок 1

Стандарт Ni-4.6

(*) Міжнародний IDF стандарт 135B/1991. Молоко та молочні продукти. Прецизійні характеристики аналітичних методів. Схема процедури спільного дослідження."

(3) текст доповнити такими додатками:

"

1. Метод дослідження, наведений у доповненні, використовується, щоб гарантувати, що сир, виготовлений виключно з овечого молока, козячого молока чи буйволячого молока, або з суміші овечого, козячого та буйволячого молока, не містить казеїну коров’ячого молока.

Вважається, що казеїн коров’ячого молока є присутнім у продукті, якщо вміст казеїну коров’ячого молока в досліджуваній пробі дорівнює вмісту чи перевищує його у референтному зразку, що містить 1 % коров’ячого молока, як зазначено у доповненні.

2. Методи виявлення казеїну коров’ячого молока у сирах, про які йдеться в параграфі 1, можуть бути використані за умови, що:

(a) межа детектування становить максимум 0,5 %, та

(b) немає хибно-позитивних результатів, та

(c) казеїн коров’ячого молока може бути виявлений з потрібною чутливістю, навіть після тривалих періодів дозрівання, що може відбуватися у звичайних комерційних умовах.

Якщо будь-яку зі згаданих вище вимог не дотримано, використовуються методи, наведені у доповненні.

Виявлення коров’ячого молока та казеїнату у сирах, виготовлених з овечого молока, козячого молока, буйволячого молока або сумішей овечого, козячого та буйволячого молока методом ізоелектричного фокусування гамма -казеїнів після плазмінолізу.

Метод придатний для чутливого та специфічного виявлення натурального і термічно обробленого коров’ячого молока та казеїнату у свіжих і дозрілих сирах, виготовлених з овечого молока, козячого молока, буйволячого молока або сумішей овечого, козячого та буйволячого молока. Він не придатний для виявлення підроблення молока та сиру концентратами термічно оброблених сироваткових білків коров’ячого молока.

3.1. Виділення казеїнів з сиру та контрольних стандартів

3.2. Розчинення виділених казеїнів та піддання їх розщепленню плазміном (ЕС.3.4.21.7)

3.3. Ізоелектричне фокусування оброблених плазміном казеїнів у присутності сечовини та забарвлювання білків

3.4. Оцінювання забарвлених смуг гамма 3 -казеїну та гамма 2 -казеїну (доказ наявності коров’ячого молока) шляхом порівняння смуги, отриманої з дослідної проби, зі смугами, отриманими у тому самому гелі з контрольних стандартів, що містять 0 % та 1 % коров’ячого молока.

Якщо не вказано інше, використовуються хімічні речовини аналітичної якості. Вода повинна бути подвійної дистиляції або еквівалентного ступеня чистоти.

Примітка: Наведені нижче дані стосуються лабораторно приготованих поліакриламідних гелів, що містять сечовину, з параметрами 265 x 125 x 0,25 мм. У випадку використання інших параметрів та типів гелю, може виникнути необхідність коригування умов розділення.

Ізоелектричне фокусування

4.1. Реагенти для вироблення поліакриламідних гелів, що містять сечовину

4.1.1. Стоковий розчин гелю

Розчиняють:

4,85 г акриламіду

0,15 г N, N’-метилен-біс-акриламіду (BIS)

48,05 г сечовини

15,00 г гліцерину (87 % м/м)

у воді та доводять до 100 мл і зберігають в ампулі з темного скла в холодильнику.

Примітка: Доступний у продажу готовий акриламід/BIS розчин може бути використаний замість вказаних встановлених масових часток нейротоксичних акриламідів. Якщо такий розчин містить 30 % м/об акриламіду та 0,8 % м/об BIS, для приготування використовується об’єм у 16,2 мл. замість встановлених масових часток. Термін зберігання стокового розчину становить максимум 10 днів; якщо його провідність є вище ніж 5 мкСм, розчин деіонізують шляхом перемішування з 2 г Амберліту MB-3 протягом 30 хвилин, потім пропускають через мембранний фільтр з розміром пор 0,45 мкм.

4.1.2. Розчин гелю

Приготовляють розчин гелю шляхом змішування добавок та амфолітів (*) із стоковим розчином гелю (див. 4.1.1).

9,0 мл стокового розчину

24 мг бета -аланіну

500 мкл амфоліту pH 3,5-9,5

250 мкл амфоліту pH 5-7

250 мкл амфоліту pH 6-8

Розчин гелю перемішують і дегазують протягом двох-трьох хвилин в ультразвуковій ванні або у вакуумі.

Примітка: Приготовляють розчин гелю безпосередньо перед його заливанням (див. 6.2.).

4.1.3. Розчин каталізатора

4.1.3.1. N, N, N’ N’ - тетраметилетилендіамін (Temed)

4.1.3.2. 40 % м/об амоній персульфат (PER):

Розчиняють 800 мг PER у воді та доводять до 2 мл.

Примітка: Завжди використовують щойно приготований розчин PER.

4.2. Контактна рідина

Керосин або рідинний парафін

4.3. Анодний розчин

Розчиняють 5,77 г фосфорної кислоти (85 % м/м) у воді та розводять до 100 мл.

4.4. Катодний розчин

Розчиняють 2,00 г гідроксиду натрію у воді та розводять водою до 100 мл.

Підготування проби

4.5. Реагенти для виділення білків

4.5.1. Розведена оцтова кислота (25,0 мл льодяної оцтової кислоти, доведеної водою до 100 мл)

4.5.2. Дихлорметан

4.5.3. Ацетон

4.6. Буфер для розчинення білків

Розчиняють

5,75 г гліцерину (87 % м/м)

24,03 г сечовини

250 мг дитіотреітолу

у воді та доводять до 50 мл.

Примітка: Зберігають у холодильнику, максимальний термін зберігання - один тиждень.

4.7. Реагенти для розщеплення казеїнів плазміном

4.7.1. Буфер карбонату амонію

Титрують 0,2 моль/л розчин гідрогенкарбонату амонію (1,58 г/100 мл води), що містить 0,05 моль/л етилендіамінтетраоцтову кислоту (EDTA, 1,46г/100 мл), 0,2 моль/л розчином карбонату амонію (1,92 г/100 мл води), що містить 0,05 моль/л EDTA, до досягнення pH 8.

4.7.2. Бичачий плазмін (ЕС. 3.4.21.7), з активністю щонайменше 5 Од/мл

4.7.3. Розчин епсілон -амінокапронової кислоти для інгібування ферментів

Розчиняють 2,624 г епсілон -амінокапронової кислоти (6-аміно-n-гексанової кислоти) у 100 мл 40 % (об/ об)) етанолу.

4.8. Стандарти

4.8.1. Сертифіковані контрольні стандарти суміші сичужного овечого та козячого знежиреного молока, що містить 0 % і 1 % коров’ячого молока, можна отримати в Інституті еталонних матеріалів та вимірювань Комісії, В-2440 Геель, Бельгія

4.8.2. Підготування внутрішньолабораторних стандартів буйволячого молока з доданням сичужного ферменту, що містять 0 % і 1 % коров’ячого молока

Знежирене молоко приготовляють центрифугуванням або буйволячого або коров’ячого сирого молока за температури 37 °С при 2500 g протягом 20 хвилин. Після швидкого охолодження пробірки та її вмісту до 6-8 °С, верхній шар жиру видаляють повністю. Для підготування 1 % стандарту додають 5,00 мл коров’ячого знежиреного молока до 495 мл буйволячого знежиреного молока в 1-літровій лабораторній склянці, доводять до pH 6,4 доданням розведеної молочної кислоти (10 % м/об). Доводять температуру до 35 °С і додають 100 мкл телячого сичужного ферменту (активність ферменту 1:10000, близько 3000 Од/мл), мішають протягом 1 хвилини і потім залишають накриту алюмінієвою фольгою склянку на одну годину за температури 35 °С, щоб утворився згусток. Після утворення згустку, цільне молоко з доданням сичужного ферменту ліофілізують без попередньої гомогенізації чи зціджування сироватки. Після ліофілізації його тонко подрібнюють до отримання однорідного порошку. Для підготування 0 % стандарту, здійснюють таку саму процедуру з використанням натурального буйволячого знежиреного молока. Стандарти зберігають за температури - 20 °С.

Примітка: Рекомендується перевіряти чистоту буйволячого молока ізоелектричним фокусуванням оброблених плазміном казеїнів перед підготуванням стандартів.

Реагенти для забарвлювання білків

4.9. Фіксатор

Розчиняють 150 г трихлороцтової кислоти у воді і доводять до 1000 мл.

4.10. Знебарвлювальний розчин

Розводять 500 мл метанолу та 200 мл льодяної оцтової кислоти до 2000 мл дистильованою водою.

Примітка: Готують свіжий знебарвлювальний розчин кожного дня; його можна приготувати змішуванням рівних об’ємів стокових розчинів 50 % (об/об) метанолу та 20 % (об/об) льодяної оцтової кислоти.

4.11. Забарвлювальні розчини

4.11.1. Забарвлювальний розчин (стоковий розчин 1)

Розчиняють 3,0 г кумасі діамантового синього G-250 (C.I. 42655) в 1000 мл 90 % (об/об) метанолу з використанням магнітної мішалки (приблизно 45 хвилин), пропускають через два складені фільтри з середньою швидкістю фільтрації.

4.11.2. Забарвлювальний розчин (стоковий розчин 2)

Розчиняють 5,0 г пентагідрату сульфату міді в 1000 мл 20 % (об/об) оцтової кислоти.

4.11.3. Забарвлювальний розчин (робочий розчин)

Змішують разом по 125 мл кожного зі стокових розчинів (4.11.1, 4.11.2) безпосередньо перед забарвлюванням.

Примітка: Забарвлювальний розчин повинен бути приготований у той день, коли його мають використовувати.

5.1. Скляні пластини (265 x 125 x 4 мм); гумовий валик (ширина 15 см); вирівнювальний столик

5.2. Лист із нанесеним гелем (265 x 125 мм)

5.3. Покривний лист (280 x 125 мм). Приклеюють смужку клейкої стрічки (280 x 6 x 0,25 мм) до кожного довгого краю (див. рисунок 1)

5.4. Камера для електрофокусування з охоложувальною пластиною (напр., 265 x 125 мм) та відповідним джерелом живлення ( більше або дорівнює 2,5 кВ) або автоматичний електрофоретичний прилад

5.5. Циркуляційний кріостат, термостатично контрольований на 12 ± 0,5 °С

5.6. Центрифуга з регулюванням до 3000 g

5.7. Електродні смужки (довжиною більше або дорівнює 265 мм)

5.8. Пластикові пляшки-капанки для анодного та катодного розчинів

5.9. Аплікатори проб (10 x 5 мм, фільтрувальний папір, віскозний або з низькою адсорбцією білків)

5.10. Посуд з неіржавної сталі або зі скла для забарвлювання та знебарвлювання (напр., лотки для інструментів 280 x 150 мм)

5.12. Регульований гомогенізатор (діаметр стрижня 10 мм), з діапазоном від 8000 до 20000 об/хв

5.13. Магнітна мішалка

5.14. Ультразвукова баня

5.15. Апарат для зварювання плівки

5.16. Мікродозатори ємністю 25 мкл

5.17. Вакуум-концентратор або ліофілізатор

5.18. Водяна баня-термостат з регулятором, регульована до 35 та 40 ± 1 °С, з шейкером

5.19. Денситометричне обладнання з вимірюванням при лямбда = 634 нм

6.1. Підготування проби

6.1.1. Виділення казеїнів

Відмірюють кількість, еквівалентну 5 грамам сухої маси сиру або контрольним стандартам, у 100 мл центрифужну пробірку, додають 60 мл дистильованої води і гомогенізують за допомогою стрижневого гомогенізатора (від 8000 до 10000 об/хв). Доводять до pH 4,6 розведеною оцтовою кислотою (4.5.1) та центрифугують (5 хвилин, 3000 g). Зливають жир і сироватку, гомогенізують залишок за 20000 об/хв у 40 мл дистильованої води, доведеної до pH 4,5 розведеною оцтовою кислотою (4.5.1), додають 20 мл дихлорметану (4.5.2), знову гомогенізують та центрифугують (5 хвилин, 3000 g). Шар казеїну між водною та органічною фазами (див. рисунок 2) видаляють шпателем і зливають обидві фази. Повторно гомогенізують казеїн у 40 мл дистильованої води (див. вище) і 20 мл дихлорметану (4.5.2) та центрифугують. Процедуру повторюють допоки обидві екстраговані фази не стануть безбарвними (два-три рази). Гомогенізують залишок білків з 50 мл ацетону (4.5.3) і пропускають через складений фільтрувальний папір з середньою швидкістю фільтрації. Змивають залишок на фільтрі двома окремими 25 мл порціями ацетону кожного разу і дають висохнути на повітрі або в струмені азоту, потім тонко подрібнюють у ступці.

Примітка: Сухі ізоляти казеїну необхідно зберігати за температури -20 °С.

6.1.2. Розщеплення плазміном бета -казеїнів для інтенсифікації гамма -казеїнів

Диспергують 25 мг виділених казеїнів (6.1.1) у 0,5 мл буферного розчину карбонату амонію (4.7.1) та гомогенізують протягом 20 хвилин, використовуючи, наприклад, оброблення ультразвуком. Підігрівають до 40 °С і додають 10 мкл плазміну (4.7.2), перемішують та інкубують протягом однієї години за температури 40 °С, постійно струшуючи. Щоб інгібувати фермент, додають 20 мкл розчину епсілон -амінокапронової кислоти (4.7.3), потім додають 200 мг сечовини у твердому стані та 2 мг дитіотреітолу.

Примітка: Щоб отримати кращу симетрію у фокусованих смугах казеїну, рекомендується ліофілізувати розчин після додання епсілон -амінокапронової кислоти і потім розчинити отримані ліофілізати у 0,5 мл буферу для розчинення білків (4.6.).

6.2. Приготування поліакриламідних гелів, що містять сечовину

Додавши декілька крапель води, розкочують валиком лист із нанесеним гелем (5.2.) на скляній пластині (5.1.), видаляючи надлишок води паперовим рушником або серветкою. Таким самим чином розкочують валиком покривний лист (5.3.) з прокладками (0,25 мм) на іншій скляній пластині. Кладуть пластину горизонтально на вирівнювальний столик.

Додають 10 мкл Temed (4.1.3.1) до підготовленого і деаерованого розчину гелю (4.1.2), перемішують і додають 10 мкл розчину PER (4.1.3.2), ретельно перемішують і відразу рівномірно виливають у центр покривного листа. Ставлять один край пластини з нанесеним гелем (нанесеною стороною донизу) на пластину з покривним листом і повільно опускають її таким чином, щоб між листами сформувалась і рівномірно розподілилась гелева плівка без бульбашок (рисунок 3). Обережно опускають пластину з нанесеним гелем повністю за допомогою тонкого шпателя і кладуть на неї зверху ще три скляні пластини, які діятимуть як гніт. Після завершення полімеризації (близько 60 хвилин) відділяють гель, що полімеризувався на листі із нанесеним гелем, разом з покривним листом, легко постукуючи по скляних пластинах. Обережно очищують зворотну сторону листа носія, щоб видалити залишки гелю та сечовини. Зварюють повздовжні краї "гелевого сендвіча", щоб отримати плівкову трубку, і зберігають у холодильнику (максимум шість тижнів).

Примітка: Покривний лист з прокладками може бути використаний повторно. Поліакриламідний гель можна порізати на пластини меншого розміру, що рекомендується, коли є кілька проб або використовується автоматичний електрофоретичний прилад (два гелі, розміром 4,5 x 5 см).

6.3. Ізоелектричне фокусування

Встановлюють охолоджувальний термостат на 12 °С. Протирають зворотну сторону листа із нанесеним гелем керосином, потім капають кілька крапель керосину (4.2.) у центр охолоджувального блока. Потім на ньому розкочують валиком "гелевий сендвіч", стороною листа носія донизу, не допускаючи утворення бульбашок. Витирають надлишок керосину і знімають покривний лист. Змочують електродні смужки електродними розчинами (4.3., 4.4.), обрізають по довжині гелю і поміщають у визначені місця (відстань між електродами 9,5 см).

Умови ізоелектричного фокусування:

6.3.1. Розмір гелю 265 x 125 x 0,25 мм

Примітка: Якщо товщина чи ширина гелів змінюються, величини сили струму та потужності повинні бути відповідно скореговані (наприклад, подвоюють величини сили струму та потужності, якщо використовується гель розміром 265 x 125 x 0,5 мм).

6.3.2. Приклад програмування напруги для автоматичного електрофоретичного приладу (2 гелі розміром 5,0 x 4,5 см), електроди без смужок, прикладені безпосередньо до гелю

Кладуть аплікатор проб на етапі 2 при 0 В• год.

Знімають аплікатор проб на етапі 2 при 30 В• год.

6.4. Забарвлювання білків

6.4.1. Фіксація білків

Виймають електродні смужки відразу після вимкнення живлення і негайно поміщають гель у посудину для забарвлювання/знебарвлювання, наповнену 200 мл фіксатора (4.9.); залишають на 15 хвилин, постійно струшуючи.

6.4.2. Промивання та забарвлювання пластини гелю

Старанно зціджують фіксатор і промивають пластину гелю два рази по 30 секунд у 100 мл знебарвлювального розчину (4.10.). Зливають знебарвлювальний розчин і наповнюють посудину 250 мл забарвлювального розчину (4.11.3); витримують протягом 45 хвилин, легко струшуючи.

6.4.3. Знебарвлювання пластини гелю

Зливають забарвлювальний розчин, промивають пластину гелю двічі, щоразу використовуючи 100 мл знебарвлювального розчину (4.10.), потім збовтують у 200 мл знебарвлювального розчину протягом 15 хв і повторюють етап знебарвлювання щонайменше два чи три рази, доки середовище не стане прозорим і безбарвним. Потім споліскують пластину гелю дистильованою водою (2 x 2 хвилини) і висушують на повітрі (2-3 години) або феном (10-15 хвилин).

Примітка 1: Фіксування, промивання, забарвлювання і знебарвлювання здійснюють за температури 20 °С. Не допускають підвищених температур.

Примітка 2: Якщо перевагу надають більш чутливому методу забарвлювання сріблом (напр., Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17-1150-01), оброблені плазміном казеїнові проби повинні бути розведені до 5 мг/мл.

Оцінювання проводять шляхом порівняння білкових смуг невідомої проби з контрольними стандартами на тому самому гелі. Виявлення коров’ячого молока у сирах з овечого молока, козячого молока і буйволячого молока та сумішей овечого, козячого і буйволячого молока здійснюють за допомогою гамма 3 -казеїнів та гамма 2 -казеїнів, ізоелектричні точки яких варіюються в діапазоні між pH 6,5 та pH 7,5 (рисунки 4 a, b, рисунок 5). Межа детектування становить менше ніж 0,5 %.

7.1. Візуальна оцінка

Для візуальної оцінки кількості коров’ячого молока рекомендується скоригувати концентрації проб та стандартів таким чином, щоб отримати такий самий рівень інтенсивності візуалізації овечих, козячих та/або буйволячих гамма 2 -казеїнів та гамма з-казеїнів (див. ‘гамма 2 E,G,B’ та ‘гамма 3 E,G,B’ на рисунках 4 a, b та рисунку 5). Після цього кількість коров’ячого молока (менше ніж, дорівнює чи більше ніж 1 %) у невідомій пробі може бути оцінена безпосередньо шляхом порівняння інтенсивності візуалізації коров’ячих гамма 3 -казеїнів та гамма 2 -казеїнів (див. ‘гамма 3 С’ та ‘гамма 2 С’ на рисунках 4 a, b та рисунку 5) з тими у 0 % та 1 % контрольних стандартах (овечі та козячі), або внутрішньолабораторних стандартах (буйволячі).

7.2. Денситометрична оцінка

За можливості, застосовують денситометрію (5.19.) для визначення співвідношення площі піків коров’ячих до овечих, козячих та/або буйволячих гамма 2 -казеїнів та гамма 3 -казеїнів (див. рисунок 5). Порівнюють це значення зі співвідношенням площі піків гамма 2 -казеїнів та гамма 3 -казеїнів 1 % контрольного стандарту (овечі та козячі) або внутрішньолабораторного стандарту (буйволячі), досліджуваних на тому самому гелі.

Примітка: Цей метод працює задовільно, якщо є чіткий позитивний сигнал стосовно обох коров’ячих гамма 2 -казеїнів та гамма 3 -казеїнів в 1 % контрольному стандарті, але не в 0 % контрольному стандарті. Якщо ні, процедуру оптимізують, точно дотримуючись детальних інструкцій методу.

Пробу оцінюють як позитивну, якщо обидва коров’ячі гамма 2 -казеїни та гамма 3 -казеїни або відповідні співвідношення площі піків дорівнюють або перевищують рівень 1 % контрольного стандарту.

Addeo F., Moiо L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Восса A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of гамма 2 -caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Восса A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 мю m polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

a = стрічка прокладка (0,25 mm); b = покривний лист (5.3.); c, e = скляні пластини (5.1.); d = розчин гелю (4.1.2); f = лист із нанесеним гелем (5.2.)

% СМ = відсотковий вміст коров’ячого молока, C = коров'яче, E = овече, G = козяче

Показана верхня частина IEF гелю.

% СМ = відсотковий вміст коров’ячого молока; 1 + = проба, що містить 1 % коров'ячого молока та з доданим чистим коров’ячим казеїном на середині доріжки. C = коров'яче, E = овече, G = козяче, B = буйволяче.

Показано повну відстань розділення IEF гелю.

a, b = стандарти, що містять 0 та 1 % коров’ячого молока; c-g = проби сиру, що містять 0, 1, 2, 3 та 7 % коров'ячого молока. C = коров’яче, E = овече, G = козяче.

Відскановано верхню частину IEF гелю при лямбда = 634 нм.

Дослідження проводяться в лабораторіях, призначених відповідно до статті 12 Регламенту (ЄС) № 882/2004 (**), або призначених компетентними органами держави-члена.

1. Відбирання проб проводиться згідно з нормативними положеннями, які стосуються обумовленого продукту. Якщо жодних положень щодо відбирання проб спеціально не передбачено, тоді застосовуються положення, визначені в ISO 707, Молоко та молочні продукти - Настанови щодо відбирання проб.

2. Лабораторні звіти про результати досліджень повинні містити інформацію, достатню для оцінювання результатів, яке має бути проведене згідно з доповненням.

3. Для досліджень, що вимагаються згідно з правилами Союзу, повинні бути відібрані дублікати проб.

4. Якщо виникає спір щодо результатів, платіжна агенція повинна забезпечити проведення необхідного дослідження обумовленого продукту повторно, а витрати повинна нести сторона, що програла.

Згадане вище дослідження проводиться за умови, що запечатані дублікати проб продукту є в наявності і належно зберігаються в компетентному органі. Виробник повинен надіслати запит платіжній агенції на проведення дослідження протягом 7 робочих днів після нотифікації результатів першого дослідження. Дослідження повинна проводити платіжна агенція протягом 21 робочих днів після отримання запиту.

5. Результат повторного дослідження є остаточним.

6. Якщо виробник може довести, протягом п’яти робочих днів з моменту відбирання проб, що процедура відбирання проб не була проведена коректно, відбирання проб повинно бути повторене, якщо це можливо. Якщо відбирання проб не може бути повторене, партія повинна бути прийнята.

Якщо законодавство стосовно державних інтервенцій та допомоги на зберігання на складах приватного користування встановлює детальні процедури відбирання проб, тоді слід дотримуватись тих процедур. У всіх інших випадках використовується проба із щонайменше 3-х одиничних проб, довільно відібраних з партії, поданої для контролю. Допускається підготування змішаних проб. Отриманий результат порівнюється з допустимими концентраціями шляхом обчислення 95 % довірчого інтервалу як помноженого на 2 стандартного відхилу, де стандартний відхил залежить від того, чи (1) метод валідований у рамках міжнародної співпраці з визначеними величинами длясігма г та сігма R, або чи (2), у випадку внутрішньої валідації, була обчислена внутрішня відтворюваність. Цей довірчий інтервал тоді дорівнюватиме невизначеності вимірювання результату.

У цьому випадку, стандартний відхил повторюваності сігма г та стандартний відхил відтворюваності сігма R встановлені, і лабораторія може підтвердити відповідність робочим характеристикам валідованого методу.

Обчислюють середнє арифметичне Формула числа n повторених вимірювань.

Обчислюють розширену невизначеність (k = 2) для Формула за формулою

Формула

Якщо кінцевий результат х вимірювання обчислюють з використанням формули типу х = у 1 + у 2, х = у 1 - у 2, х = у 1 • у 2 або х = у 1 /y 2, у таких випадках дотримуються звичайних процедур об’єднання стандартних відхилів.

Партію вважають такою, що не відповідає верхній межі допустимої концентрації UL, якщо

Формула;

в іншому випадку, її вважають такою, що відповідає UL.

Партію вважають такою, що не відповідає нижній межі допустимої концентрації LL, якщо

Формула;

в іншому випадку, її вважають такою, що відповідає LL.

У випадках, коли використовують методи, не зазначені в цьому Регламенті, а міри прецизійності не були встановлені, проводиться внутрішня валідація. У формулах для обчислення розширеної невизначеності U використовуються стандартний відхил внутрішньої повторюваності сігма іг та стандартний відхил внутрішньої відтворюваності сігма iR замість сігма г та сігма R , відповідно.

Правила, яких слід дотримуватись перевірки на відповідність допустимій концентрації, зазначені в пункті 1. Однак, якщо партію вважають такою, що не відповідає допустимій концентрації, вимірювання повинні бути повторені з використанням методу, зазначеному в цьому Регламенті, а результати оцінені згідно з пунктом 1.

(*) Продукти Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) та Resolyte® pH 5-7 і pH 6-8 (BDH, Merck) виявились особливо придатними для отримання потрібного розділення гамма -казеїнів.

(**) Регламент Європейського Парламенту і Ради (ЄС) № 882/2004 від 29 квітня 2004 року про офіційний контроль для забезпечення перевірки на відповідність законодавству щодо кормів та харчових продуктів, правил щодо здоров'я та благополуччя тварин (OB L 165, 30.04.2004, с. 1).

"