1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Застосування/введення доз
Введення дози відбувається методом штучного годування череззонд або введенням трубки в орган. В окремих випадках, коли повнудозу ввести не вдається, її розбивають на менші частини, наперіод, який не перевищує 24 години.
Перед дозуванням тварин утримують від їжі наступним чином:наприклад, щурам дають на ніч лише воду, мишам дають воду, а їстине дозволяють 3-4 години. Після такого утримання від їжі тваринзважують, а потім вводять необхідну дозу хімічної речовини. Потім,наступні 3-4 години щурів знову утримують від їжі, а мишей1-2 години. Якщо дозування розбивається на частини, протягомпевного періоду, тварин за необхідності годують і дають воду, взалежності від тривалості такого періоду дозування.
1.5.2. Візуальна перевірка
Завдання візуальної перевірки полягає у виборі відповідноїпочаткової дози для головного експерименту. Тестована хімічнаречовина вводиться окремим тваринам так, як показано в блок-схеміДодатку 1. Візуальна перевірка закінчується тоді, коли прийняторішення щодо розмірів початкової дози для головного експерименту(або, якщо при найменшій фіксованій дозі трапляється летальнийкінець).
Початкова доза для візуальної перевірки береться на основірівнів фіксованої дози в 5, 50, 300 та 2000 мг/кг. Це доза, відякої повинна наступати очевидна токсичність, про що мають свідчитидані лабораторних тестів (в пробірках та на прикладі живихорганізмів), де застосовувались такі самі хімікати, а такожструктурно подібні до них. За відсутності такої інформації,початкова доза хімічної речовини повинна становити 300 мг/кг.
Період між дозуванням кожної тварини повинен бути не менше24 годин. Тварин необхідно оглядати протягом, принаймні, 14 днів.
Лише в окремих випадках, і, якщо в цьому є потреба тадоцільність, дозволяється збільшувати рівень фіксованої дози до5000 мг/кг (див. Додаток 1). З метою охорони тварин забороняєтьсятестування методом ГГС, Категорії 5, в межах доз 2000-5000 мг/кг.Єдиним винятком може бути обґрунтована доцільність такого методу,якщо є велика впевненість в тому, що результати тесту мають прямийзв'язок з проблемами охорони навколишнього середовища та здоров'ялюдини.
У випадку, якщо в результаті візуального тестування принайменшому рівні фіксованої дози (5 мг/кг) тварина помирає,необхідно припинити експеримент та призначити до застосуванняречовину методу ГГС, Категорії 1 (як в Додатку 1). Проте, якщонеобхідне подальше підтвердження класифікації, можна провестинаступну додаткову процедуру. Вводиться доза другій тварині, зрозрахунку 5 мг/кг. Якщо тварина помирає, тоді метод ГГС,Категорії 1 підтверджується, а експеримент одразу припиняється. Увипадку, коли друга тварина виживає, беруть ще не менше трьохтварин для дозування, з розрахунку 5 мг/кг. Враховуючи, що ризиклетального випадку дуже високий, цих тварин дозують послідовно, зметою гуманного ставлення до них та охорони життя. Інтервал міждозуванням кожної з тварин повинен бути достатнім для того, щобпереконатись, що перша тварина виживе після отриманої дози. Якщоза другим разом тварина помирає, порядок дозування одразуприпиняють, а інших тварин також не дозують. Оскільки інцидент здругим летальним випадком (незалежно від кількості протестованихтварин на момент припинення тесту) підпадає під категорію А (двіабо більше смертей), вступає в дію правило класифікації, як вДодатку 2 (розрахунок фіксованої дози 5 мг/кг) (Категорія 1, якщоодна або більше смертей або Категорія 2, якщо лише один летальнийкінець). Крім того, в Додатку 1 містяться рекомендації щодокласифікації за системою ЄС до тих пір, поки не буде запровадженонового ГГС.
1.5.3. Основний експеримент
1.5.3.1. Кількість тварин та рівні дозування
Дія, яка наступає після тестування із застосуваннямпочаткової дози, вказана у блок-схемі Додатку 2. Одна з трьох дійє обов'язковою; необхідно або припинити тестування та призначитивідповідний тест для класифікації ризиків, використавши при цьомубільшу фіксовану дозу, або проводити експеримент при меншійфіксованій дозі. Проте, з метою захисту тварин, необхідно, щоб тадоза хімікату, яка спричинила смерть тварини в ході візуальноготесту, не застосовувалась повторно в головному тесті (див.Додаток 2). Досвід показує, що при застосуванні початкової дозинайймовірнішим буває результат, коли хімічну речовину вдаєтьсякласифікувати, і продовження експерименту далі непотрібно.
Для дослідження дії кожного рівня дози беруть, як правило, доп'яти тварин однієї статі. До складу цієї групи з п'яти тваринвходить одна тварина з візуального тесту, яку дозували згіднопевного рівня дози, а також решта чотири тварини (крім ситуації,хоча таке малоймовірно, коли рівень дози з основного експериментуне було включено у візуальний тест).
Інтервал між дозуваннями кожного рівня визначається появою,тривалістю та складністю ознак токсичності. Надання медичноїдопомоги тваринам слід відкласти, поки не буде впевненості в тому,що вижили тварини, дозовані раніше. Рекомендується, щоб період міждозуваннями на кожному рівні складав, якщо необхідно, 3-4 дні, щобпровести спостереження сповільнення токсичності. Цей інтервалможна збільшити при необхідності, наприклад, у випадку отриманняневпевнених результатів.
Коли застосовується збільшене фіксоване дозування в5000 мг/кг, необхідно перейти до процедури, описаної в Додатку 3(див. також секцію 1.6.2).
Граничний тест
Граничний тест головним чином застосовують в ситуаціях, колив експериментатора є інформація про те, що тестований матеріалочевидно виявиться нетоксичним, тобто, матиме показник токсичностів межах допустимих норм .Інформацію стосовно токсичності матеріалуможна отримати з даних про тестування подібних хімічних речовин,сумішей або продуктів, враховуючи також характеристику тапроцентне співвідношення компонентів, що можуть виявитисьтоксичними. У подібних ситуаціях, коли майже немає інформації протоксичність або, якщо така токсичність очікується в застосованомуматеріалі, необхідно проводити повне тестування (основний тест).
В якості рекомендації слід зазначити, що граничним тестом занормальних умов буде візуальний тест при дозуванні 2000 мг/кг (або5000 мг/кг в окремих випадках).
1.6. СПОСТЕРЕЖЕННЯ
Тварин спостерігають індивідуально після дозування, хоча браз протягом перших 24 годин, звертаючи особливу увагу на першічотири години. Потім спостерігають щодня, загалом 14 днів, крімситуацій, коли експеримент припиняють, а тварин позбавляють життяз міркувань гуманності, або, якщо тварин знайдено вже мертвими.Проте, тривалість експерименту непотрібно суворо задавати в певнічасові рамки. Тривалість повинна обумовлюватись токсичнимиреакціями, початком та тривалістю відновлювального періоду та можепри потребі розтягуватись. Дуже важливим є зафіксувати, колиз'являються та зникають ознаки токсичності, особливо, якщо єтенденція запізнілої появи таких ознак(11). Результатиспостережень систематично записують, затверджуючи їх стосовнокожної тварини.
Додаткові спостереження необхідно проводити, якщо тваринипродовжують проявляти ознаки токсичності. У процесі спостереженьпотрібно виявити зміни на шкірі, шерсті, очах, слизовій оболонці,а також в дихальній системі, системі кровообігу, вегетативній тацентральній нервовій системі. Також спостерігаються зміни всоматомоторній діяльності та поведінці. Необхідно уважнослідкувати за тим, чи з'являються тремтіння та конвульсії,виділення слини, діарея, впадання в летаргічний сон та кому.Керуватись необхідно критеріями, поданими в Рекомендаціях щодоГуманності (8). Тварин, які перебувають в передсмертному стані абостраждають від сильного болю та недомагань, необхідно позбавлятижиття гуманним способом. Якщо тварин позбавлено життя з гуманнихміркувань або знайдено вже мертвими, необхідно обов'язково якомогаточніше вказати час смерті.
1.6.1. Вага тіла
Вагу тіла тварин необхідно визначити незадовго до початкудозування, а також через тиждень після цього. Будь-які зміни увазі потрібно вираховувати та записувати. Тварин, які вижили, вкінці експерименту зважують, а потім гуманно позбавляють життя.
1.6.2. Патологія
Всім тваринам (навіть тим, які померли під час тесту або булиусунуті від подальшого експерименту з гуманних міркувань) роблятьзагальний розтин. Результати загальних патологічних змін записуютьстосовно кожної тварини окремо. До уваги беруться і результатимікроскопічного дослідження органів, в яких виявлено ознакизагальної патології. Йдеться про тварин, які вижили через 24 абобільше годин після першого дозування. Такі результати можутьвиявитись досить важливими.
2. ДАНІ
Подаються дані стосовно кожної тварини окремо. Крім того, всюінформацію підсумовують у вигляді таблиці, вказуючи кількістьтварин кожної тестованої групи, кількість тварин, в яких виявленоознаки токсичності, кількість тварин, померлих в ході експериментуабо позбавлених життя з гуманних міркувань. Фіксується також чассмерті окремих тварин, опис та час появи ознак токсичності йзворотного процесу, а також результати розтину.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ТЕСТУ
Звітність про результати тесту має містити наступнуінформацію:
Тестована речовина:
- характерні особливості, наявність домішок і, якщонеобхідно, фізико-хімічні властивості (включаючи ізомеризацію),
- дані ідентифікації та номер CAS.
Технологічна рідина (якщо є доцільність):
- якщо використовується інша технологічна рідина, ніж вода,тоді обґрунтувати доцільність такого застосування.
Тварини для експерименту:
- вид/рід тварин,
- мікробіологічний статус тварин, якщо відомо,
- кількість, вік та стать тварин (включаючи, якщо потрібно,обґрунтування вибору самців замість самок),
- інформація про те, звідки тварини, умови утримування, кормтощо.
Умови проведення тесту:
- інформація щодо рецептури/складу речовини, включаючи деталіфізичної форми застосовуваного матеріалу,
- деталі застосування тестованої речовини, включаючи дані прооб'єми та час дозувань,
- інформація про якість їжі та води (також, типраціону/корму, походження, походженні води),
- обґрунтування вибору початкової дози.
Результати:
- результати щодо отриманої інформації та рівень дози длякожної тварини (наприклад, тварини з ознаками токсичності; такождані про смертність, особливості, труднощі та тривалість ефектів),
- введення в таблицю даних про вагу та зміни у вазі,
- індивідуальна вага тварин в день дозування, з тижневимиінтервалами, та в момент смерті або під час настання конвульсій тастраждань,
- дата і час смерті, якщо остання наступила до початкустраждань тварини,
- початок та період тривалості токсичних ознак, і чи не маєце зворотної дії на кожну з тварин,
- результати загального та гістопатологічного розтину кожноїтварини, якщо такі результати є.
Обговорення та інтерпретація результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity(1984) Special report: a new approach to theclassification ofsubstances and preparations on the basis of their acute toxicity.Human Toxicol., 3, p. 85-92.
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R. O(1987) Evaluation of the BTS approach to the testing of substancesand preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6,p. 279-291.
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J.,Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J.and Walker, A.P (1990) The international validation of afixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test.Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482.
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N (1992) Statisticalevaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30,p. 313-324.
(5) Stallard, N. and Whitehead, A (1995) Reducing numbers inthe fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, p. 315-323.
(6) Stallard, N., Whitehead, A and Ridgeway, P. (2002)Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum.Exp. Toxicol., 21, p. 183-196.
(7) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral ToxicityTesting. Environmental Health and Safety Monograph Series onTesting and Assessment No 24. Paris
(8) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition,Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints forExperimental Animals Used in Safety Evaluation. EnvironmentalHealth and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19.
(9) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classificationfor Human Health and Environmental Effects of Chemical Substancesas endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committeeand the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11(http: //webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D.,Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L.,Springer, J.A. and Myers, R.C (1995) Comparison of theUp-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute ToxicityProcedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223-231.
(11) Chan P.K and A. W Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicityand Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rdEdition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, USA.
Додаток 1
Додаток 2
Додаток 3
КРИТЕРІЇ КЛАСИФІКАЦІЇ ТЕСТОВАНИХ РЕЧОВИН
З ОЧІКУВАНИМИ ПОКАЗНИКАМИ НД БІЛЬШЕ 2000 МГ/КГ
50
БЕЗ НЕОБХІДНОСТІ ТЕСТУВАННЯ
Критерії небезпеки Категорії 5 необхідні для того, щоб можнабуло ідентифікувати тестовані речовини, рівень токсичності якихдосить низький, але які за певних обставин можуть становитинебезпеку вразливим групам людей. Очікувані показники НД при
50
пероральному або шкірному подразненні становитимуть
2000-5000 мг/кг або відповідатимуть еквівалентним дозам інших
напрямків тестувань. Тестовані речовини можна було б класифікувати
згідно категорії небезпеки так: 2000 мг/кг < НД < 5000 мг/кг
50
(Категорія 5 в ГГС). Класифікація можлива в наступних випадках:
(а) якщо на таку категорію вказують схеми тестуванняДодатку 2 на основі летальних випадків,
(b) якщо є достатньо доказів того, що НД знаходиться в 50межах показників Категорії 5; або, якщо дослідження іншихтоксичних ефектів в тварин вказують на те, що можлива реальнавелика загроза життю людини;
(c) методом екстраполяції, оцінки або вимірювання даних, якщоне підтверджується зарахування речовини до класу більш загрозливиххімікатів, а також
- коли є достовірна інформація про те, що було виявленогострі токсичні ознаки в людей або
- мав місце летальний кінець під час тестування до показниківКатегорії 4 шляхом перорального введення, чи
- у разі експертного підтвердження того, що з'явились ознакитоксичності під час тестування до показників Категорії 4, завинятком тестів на вияв діареї, пілоерекції або інших невизначенихознак, або
- якщо в разі експертного підтвердження виявиться, що можливігострі ознаки токсичності, отримані в інших експериментах надтваринами.
ТЕСТУВАННЯ ПРИ ДОЗАХ, ЩО ПЕРЕВИЩУЮТЬ 2000 МГ/КГ
В окремих випадках, а також тоді, коли цього вимагаютьспецифічні умови, дозволяється розглядати можливість дозування надодатковому рівні більшої фіксованої дози в 5000 мг/кг. Зміркувань охорони тварин та гуманного ставлення до нихзабороняється тестування при 5000 мг/кг, за винятком, якщо євелика ймовірність того, що результати такого тестування матимутьпрямий зв'язок з проблемами охорони тварин та життя людини (9).
Візуальний експеримент
Правила прийняття рішень, які регулюють процедуру, описану вДодатку 1, доповнюються таким чином, щоб можна було використатидозу 5000 мг/кг. Якщо ж використання дози 500 мг/кг призводить дорезультату А (смерть), необхідно зменшити дозу для другої тваринидо 200 мг/; результати Б та В (очевидна токсичність або їївідсутність) дають змогу вибрати дозу в 5000 мг/кг, як головнупочаткову дозу. Так само, якщо використовується доза, відмінна від5000 мг/кг, тестування продовжують до використання дози5000 мг/кг, якщо отримано результати Б та В під час використаннядози 2000 мг/кг; наступний результат А під час застосування дози5000 мг/кг диктуватиме початкову доза головного експерименту2000 мг/кг, а результати Б та В - початкову дозу основноготестування на рівні 5000 мг/кг.
Основний експеримент
Візуальний експеримент
Правила прийняття рішень, які регулюють процедуру, описану вДодатку 2, доповнюються таким чином, щоб можна було використатидозу 5000 мг/кг. Так, якщо застосовується початкова доза основногоексперименту 5000 мг/кг, тоді результати А (>= 2 летальнихвипадки) вимагатимуть тестування другої групи з використаннямдози, що становить 2000 мг/кг; результат Б (очевидна токсичністьта/або <= 1 летальний кінець) або В (відсутність токсичності)призведе до того, що речовину не класифікують за ГГС. Так само,якщо використовується доза, відмінна від 5000 мг/кг, тестуванняпроводять до використання 5000 мг/кг, якщо В становитиме2000 мг/кг; наступний результат А при використання дози 5000 мг/кгпризведе до призначення речовині Категорії 5, а результати Бта В - до декласифікації речовини.
Додаток 4
В.1.tris. ГОСТРА ПЕРОРАЛЬНА ТОКСИЧНІСТЬ - МЕТОД
КЛАСИФІКАЦІЇ ГОСТРОЇ ТОКСИЧНОСТІ
1. МЕТОД
Даний метод є еквівалентним ТІ (ТЕСТОВИХ ІНСТРУКЦІЙ) ОЕСР(2001)
1.1. ВСТУП
Метод класу гострої токсичності (1), наведений у даномутесті, є поетапною процедурою, коли використовується 3 тварини.Приблизно, 2-4 етапи можуть знадобитись, щоб визначити ознакигострої токсичності в тестованій речовині, в залежності відсмертності та ознак наближеної смерті тварин. Цей метод євідтворюваним, в ньому використовують лише кількох тварин, можнакласифікувати хімічні речовини так само, як і в інших методахдослідження гострої токсичності. Метод класу гострої токсичностізаснований на біометричних показниках (2)(3)(4)(5) фіксованих доз,окремо розподілених так, щоб речовину можна було класифікувати таоцінити ступінь небезпеки. Прийнятий в 1996 році метод булоретельно перевірено на живих організмах стосовно показника НД ,
50
як вказано у національний (6) та міжнародній літературі (7).
Рекомендації щодо вибору найвідповіднішого методу тестуваннядля даного завдання можна віднайти в Рекомендаційних Матеріалах звизначення Гострої Пероральної Токсичності (8). Дані Рекомендаціїтакож містять додаткову інформацію про проведення та інтерпретаціюрезультатів методу В.1 частина третя.
Непотрібно застосовувати дози, які подразнюють та роз'їдаютьорганізм і викликають сильний біль та нездужання. Необхідноякомога гуманніше позбавити життя помираючих тварин, а також тих,які вже довгий час страждають від нездужання та сильного болю.Результати, отримані в процесі тестування таких тварин, берутьсядо уваги так само, як і результати тестування тих, які померлисамі. У Рекомендаційних матеріалах міститься інформація прокритерії для прийняття рішень щодо того, як позбавити життяпомираючих тварин, а також тих, які вже довгий час страждають віднездужання та сильного болю (9).
У методі використовуються заздалегідь визначені дози, арезультати дають змогу класифікувати речовину у відповідності доГлобальної Гармонізованої Системи класифікації хімічних речовингострої токсичності (10).
Загалом, в даному методі не ставиться мета визначити точнийпоказник НД , але можна визначити певні межі дії, при яких
50
очікується летальний кінець, оскільки смерть певних тварин є
основним закінченням тестів. Метод дає змогу визначити показник
НД лише тоді, коли смертність перевищує 0% та менша за 100% і є
50
спричиненою двома дозами. Застосування заздалегідь визначених доз
будь-якої речовини та класифікації лише певної кількості тварин,
яких спостерігали в різних станах, покращує можливість лабораторії
отримати певну послідовність та відтворювання.
Лабораторія для тестувань повинна звертати увагу на всюможливу інформацію стосовно тестованої речовини. Сюди входитьокремий хімічний склад речовини; її фізико-хімічні властивості;результати тестувань на токсичність, як в пробірці, так і на живихорганізмах; токсикологічні дані про структурно подібні речовини;призначення речовини. Така інформація є необхідною для того, щобпереконатись в тому, що даний тест відповідає вимогам охорониздоров'я людини та дає змогу визначити найвідповіднішу початковудозу.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Гостра пероральна токсичність: стосується пероральноговживання однієї або кількох доз речовини протягом 24 годин, врезультаті чого з'являються шкідливі побічні ефекти.
Запізніла смерть: це означає, що піддослідна тварина непомирає або знаходиться в передсмертному стані протягом 48 годин,а вмирає пізніше - протягом 14-тиденного періоду веденняспостережень.
Доза: кількість застосовуваної хімічної речовини. Дозавиражається в одиницях ваги взятого хімікату на вагу піддослідноїтварини (наприклад, мг/кг).
ГГС: Глобально Гармонізована Система (ГГС) класифікаціїхімічних речовин та сумішей, які викликають гостру токсичність.Спільна діяльність ОЕСР в галузі охорони навколишнього середовищата життя людини, Експертного Комітету ООН з ТранспортуванняНебезпечних Речовин (вивчення фізико-хімічних властивостей) іМіжнародної Організації Праці (МОТ) (використання небезпечнихматеріалів) координується Міжорганізаційною ПрограмоюРаціонального Застосування Хімічних Речовин (МПРЗХР).
Ймовірна смерть: стан, коли піддослідна тварина вмирає абоочікується, що вона помре до наступного очікуваного моментуспостереження. Ознаками такого стану для щурів є, наприклад, появаконвульсій, перевертання набік, лежаче положення та тремтіння.Додаткова інформація міститься у Рекомендаціях щодо Гуманності(9).
Напівлетальна доза: НД (коли гине 50% особин): статистично 50взята повна доза хімічної речовини, в результаті дії якоїочікується летальний кінець у 50% тварин, які приймали хімікатперорально. Показник НД виражається в одиницях ваги тестованої
50
речовини на вагу піддослідної тварини (мг/кг).
Допустима доза: допустима доза під час тестування (2000 або5000 мг/кг).
Вмираючий стан: стан, коли тварина вмирає або не може вижитинавіть при наданні медичної допомоги. Додаткова інформаціяміститься у Рекомендаціях щодо Гуманності (9).
Очікувана смерть: наявність клінічних ознак, які вказують нанаближення летального результату у визначений час задовго дозапланованого часу завершення експерименту. Наприклад: тваринанездатна дотягнутись до їжі або води. Додаткова інформаціяміститься у Рекомендаціях щодо Гуманності (9).
1.3. ПРИНЦИП ТЕСТУВАННЯ
В основі лежить поетапний метод застосування якомога меншоїкількості тварин на кожному етапі. Основним в методі є такожотримання достатньої кількості інформації щодо гострої токсичностіречовини для подальшої її класифікації. Групі тварин, залучених доексперименту, перорально вводять хімічну речовину визначеної дози.Речовину тестують поетапно: по три тварини однієї статі (якправило, самки) на кожному з етапів. Наступний етап визначаєтьсянаявністю/відсутністю смертельного випадку через зазначенуречовину, наприклад:
- подальше тестування непотрібно,
- дозування ще трьох тварин однаковою дозою,
- подальше дозування ще трьох тварин більшою або меншоюдозою.
Деталі методу тестування описано в Додатку 1. За допомогоюцього методу можна провести оцінку класифікації тестованоїречовини стосовно однієї з серій токсичності, що визначаєтьсяфіксованими малозначними показниками НД .
50
1.4. ОПИС МЕТОДУ
1.4.1. Підбір видів тварин
Найкращим з виду гризунів є щур, хоча можна такожзастосовувати інших представників цього виду. Як правило,використовують самок (9), оскільки результати сучасних тестів НД
50
та спеціалізована література говорять про те, що, зазвичай, хоча
різниця між чутливістю статей невелика, проте, якщо такі
відмінності все ж спостерігаються, самки виявляються до певної
міри чутливішими (11). Однак, якщо в результаті вивчення
токсикологічних або токсикокінетичних властивостей структурно
зв'язаних хімічних речовин виявиться, що самці можуть бути
чутливішими, тоді перевага надається цій статі. Під час
використання в тестах самців необхідно обумовлювати доцільність їх
застосування.
Слід використовувати спеціально призначених для лабораторнихдослідів молодих здорових тварин. Важливо, щоб самки ще ненароджували та на момент тесту не чекали потомство. Вік кожноїтварини на момент прийняття дози повинен бути 8-12 тижнів, а вагаповинна падати з інтервалом +- 20% від середньої ваги будь-якихпопередньо дозованих тварин.
1.4.2. Умови утримування та годування тварин
Температура в експериментальних приміщеннях, де утримуютьтварин повинна бути в межах 22 град.С (+- 3 град.С). Незважаючи нате, що відносна вологість повинна бути, принаймні, 30% та, якщоможливо, не перевищувати 70%, за винятком, коли приміщенняприбирають, необхідно намагатись, щоб цей показник був 50-60%.Освітлення має бути штучним, з частотою 12 годин (світло-темно).Що стосується сучасного годування тварин в лабораторних умовах, тонеобхідно, щоб в їх раціоні кількість питної води не обмежувалась.Тварин групують у клітках, згідно дозування, але важливо, щобкількість особин в одній клітці не заважала нормальномуспостереженню за кожною з них.
1.4.3. Підготовка тварин
Тварин обирають навмання, маркують для індивідуальноїідентифікації та тримають в клітках не менше п'яти днів передпочатком дозування для того, щоб вони акліматизувались влабораторних умовах.
1.4.4. Підготовка доз
В загальному, об'єм дози повинен бути постійним відносноінших видів доз, які застосовуватимуться в експерименті, алевідрізнятись концентрацією приготування. Коли тестують кінцевийпродукт рідини, то може виявитись, що застосування нерозбавленоїречовини, наприклад, при сталій концентрації, є важливішим впроцесі оцінки ризиків, які спричиняє така речовина, і така вимогаіснує з боку деяких керівних органів. В будь-якому випадкумаксимальний об'єм дози не можна збільшувати. Максимальний об'ємдози, яку можна застосовувати один раз, залежить від розмірівпіддослідної тварини. Так, для щурів цей об'єм, як правило, наповинен перевищувати 1 мл/100 г ваги тіла: проте, якщозастосовуються водний розчин, тоді можна за основу взяти показникваги тіла в 2 мл/100 г. Що стосується самої рецептури приготуваннядози, то, якщо можливо, рекомендується воднийрозчин/суспензія/емульсія, які додаються в залежності від того, якрозчиняється суспензія/емульсія в олії (наприклад, кукурудзяній)та інших технологічних рідинах. Коли використовуються іншітехнологічні рідини (не вода), тоді необхідно ознайомитись з їххарактерними особливостями. Дози потрібно готувати безпосередньоперед їх застосуванням, якщо невідома інформація щодо стабільностіприготування на певний період часу, протягом якого ці дози будутьвикористані та вважатимуться придатними до застосування.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Застосування/введення доз
Введення дози відбувається методом штучного годування череззонд або введенням трубки в орган. В окремих випадках, коли повнудозу ввести не вдається, її розбивають на менші частини, наперіод, який не перевищує 24 години.
Перед дозуванням тварин утримують від їжі наступним чином:наприклад, щурам дають на ніч лише воду, мишам дають воду, а їстине дозволяють 3-4 години. Після такого утримання від їжі тваринзважують, а потім вводять необхідну дозу хімічної речовини. Потім,наступні 3-4 години щурів знову утримують від їжі, а мишей1-2 години. Якщо дозування розбивається на частини, протягомпевного періоду, тварин за необхідності годують і дають воду, взалежності від тривалості такого періоду дозування.
1.5.2. Кількість тварин та рівні дозування
На кожному етапі використовують трьох тварин. Початкова дозадля візуальної перевірки береться на основі рівнів фіксованої дозив 5, 50, 300 та 2000 мг/кг. Це доза, від якої повинна наступатисмерть кількох тварин, яким цю дозу введено. Блок-схеми Додатку 1описують процедуру, яку необхідно повторювати для кожноїпочаткової дози. Крім того, в Додатку 4 міститься інформація прорекомендації щодо класифікації за Системою ЄС до тих пір, поки небуде впроваджено нової ГГС.
Якщо є інформація про те, що смерть не може наступити принайбільшому рівні дози (2000 мг/кг ваги тіла). У таких випадкахпроводять граничний тест. Якщо немає інформації про тестовануречовину, тоді з міркувань гуманного ставлення до тварин,вводиться початкова доза 300 мг/кг ваги тіла.
Інтервал між дозуванням та початком надання медичної допомогигрупам залежить від початку появи ознак токсичності, тривалості такритичності цих ознак, медичну допомогу тваринам не надають до тихпір, поки не буде впевненості в тому, що вижили попередньодозовані тварини.
Лише в окремих випадках, і, якщо в цьому є потреба тадоцільність, дозволяється збільшувати рівень фіксованої дози до5000 мг/кг (див. Додаток 2). З метою охорони тварин забороняєтьсятестування методом ГГС, Категорії 5, в межах доз 2000-5000 мг/кг.Єдиним винятком може бути обґрунтована доцільність такого методу,якщо є велика впевненість в тому, що результати тесту мають прямийзв'язок з проблемами охорони навколишнього середовища та здоров'ялюдини.
1.5.3. Граничний тест
Граничний тест головним чином застосовують в ситуаціях, колив експериментатора є інформація про те, що тестований матеріалочевидно виявиться нетоксичним, тобто, матиме показник токсичностів межах допустимих норм. Інформацію стосовно токсичності матеріалуможна отримати з даних про тестування подібних хімічних речовин,сумішей або продуктів, враховуючи також характеристику тапроцентне співвідношення компонентів, що можуть виявитисьтоксичними. У подібних ситуаціях, коли майже немає інформації протоксичність або, якщо очікується така токсичність застосованогоматеріалу, необхідно проводити повне тестування (основний тест).
Граничний тест із застосуванням дози 2000 мг/кг ваги тіламоже проводитись на шести тваринах (по три тварини на етап). Вокремих випадках граничний тест проводять на трьох тваринах іззастосуванням дози 5000 мг/кг (див. Додаток 2). Якщо в результатізастосування речовини настає летальний кінець, може виявитисьнеобхідним провести подальше тестування із застосуванням меншоїдози.
1.6. СПОСТЕРЕЖЕННЯ
Тварин спостерігають індивідуально після дозування, хоча браз протягом перших 30 хвилин, періодично протягом 24 годин,особливо на перші чотири години. Потім спостерігають щодня,протягом 14 днів, крім ситуацій, коли експеримент припиняють, атварин позбавляють життя з міркувань гуманності, або, якщо тваринзнайдено вже мертвими. Проте, тривалість експерименту непотрібносуворо ставити в певні часові рамки. Тривалість повиннаобумовлюватись токсичними реакціями, початком та тривалістювідновлювального періоду та може при потребі розтягуватись. Дужеважливим є зафіксувати, коли з'являються та зникають ознакитоксичності, особливо, якщо є тенденція запізнілої появи такихознак (12). Результати спостережень систематично записують,затверджуючи їх окремо стосовно кожній тварині.
Додаткові спостереження необхідно проводити, якщо тваринипродовжують проявляти ознаки токсичності. У процесі спостереженьпотрібно виявити зміни на шкірі, шерсті, очах, слизовій оболонці,а також в дихальній системі, системі кровообігу, вегетативній тацентральній нервовій системі. Також спостерігаються зміни всоматомоторній діяльності та поведінці. Необхідно уважнослідкувати за тим, чи з'являються тремтіння та конвульсії,виділення слини, діарея, впадання в летаргійний сон та кому.Керуватись необхідно критеріями, поданими в Рекомендаціях щодоГуманності (9). Тварин, що помирають або страждають від сильногоболю та нездужання, необхідно позбавляти життя гуманним способом.Якщо тварин позбавлено життя з гуманних міркувань або знайдено вжемертвими, необхідно обов'язково якомога точніше вказати чассмерті.
1.6.1. Вага тіла
Вагу тіла тварин необхідно визначити незадовго до початкудозування, а також через тиждень після цього. Будь-які зміни увазі потрібно вираховувати та записувати. Тварин, які вижили, вкінці експерименту зважують, а потім гуманно позбавляють життя.
1.6.2. Патологія
Всім тваринам (навіть тим, які померли під час тесту або булиусунуті від подальшого експерименту з гуманних міркувань) роблятьзагальний розтин. Результати загальних патологічних змін записуютьокремо стосовно кожної тварини. До уваги беруться і результатимікроскопічного дослідження органів, в яких виявлено ознакизагальної патології. Йдеться про тварин, які вижили через 24 абобільше годин після першого дозування. Такі результати можутьвиявитись досить важливими.
2. ДАНІ
Подаються дані окремо про кожну тварину. Крім того, всюінформацію підсумовують у вигляді таблиці, вказуючи кількістьтварин кожної тестованої групи, кількість тварин, в яких виявленоознаки токсичності, кількість померлих в ході експерименту абопозбавлених життя з гуманних міркувань. Фіксується також чассмерті окремих тварин, опис та час появи ознак токсичності тазворотного процесу, а також результати розтину.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. Звітність про результати тесту
Повідомлення результатів тесту повинно включати наступнуінформацію:
Тестована речовина:
- характерні особливості, наявність домішок і, якщонеобхідно, фізико-хімічні властивості (включаючи ізомеризацію),
- дані про ідентифікацію та номер CAS.
Технологічна рідина (якщо є доцільність):
- необхідність вибору рідини (якщо це не вода).
Піддослідні тварини:
- вид/рід тварин,
- мікробіологічний статус тварин, якщо відомо,
- кількість, вік та стать тварин (включаючи, якщо потрібно,обґрунтування вибору самців замість самок),
- інформація про те, звідки тварини, умови утримування, кормтощо.
Умови проведення тесту:
- інформація щодо рецептури/складу речовини, включаючи деталіфізичної форми застосовуваного матеріалу,
- деталі застосування тестованої речовини, включаючи дані прооб'єми та час дозувань,
- інформація про якість їжі та води (також, типраціону/корму, походження, походженні води),
- обґрунтування вибору початкової дози.
Результати:
- результати щодо отриманої інформації та рівень дози длякожної тварини (наприклад, тварини з ознаками токсичності; такождані про смертність, особливості, труднощі та тривалість ефектів,
- введення в таблицю даних про вагу та зміни у вазі,
- індивідуальна вага тварин в день дозування, з тижневимиінтервалами, та в момент смерті або під час настання конвульсій тастраждань,
- дата й час смерті, якщо остання наступила перед початкомстраждань тварини,
- початок і період тривалості токсичних ознак, і чи не має цезворотної дії на кожну з тварин,
- результати загального та гістопатологічного розтину окремостосовно кожної тварини, якщо такі результати є.
Обговорення та інтерпретація результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D (1986) NewPerspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol.Lett., Suppl. 31, p. 86.
(2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D (1989)Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien.Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336-341.
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E(1994) The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method(Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559-610.
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1995)The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of theAcute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729-734.
(5) Diener W., and Schlede E., (1999) Acute Toxicity ClassMethods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16,p. 129-134.
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D., (1992). ANational Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method - AnAlternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D., (1994)The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method(Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659-670.
(8) OECD, (2001) Guidance Document on Acute Oral ToxicityTesting. Environmental Health and SafetyMonograph Series onTesting and Assessment No 24. Paris.
(9) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition,Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints forExperimental Animals Used in Safety Evaluation. EnvironmentalHealth and Safety Monograph Series on Testing and AssessmentNo 19.
(10) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard ClassificationSystem For Human Health And Environmental Effects Of ChemicalSubstances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the ChemicalsCommittee and the Working Party on Chemicals in November 1998,Part 2, p. 11 (http:// webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).
(11) Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D.,Stitzel K.A., Walker A.P., Chu I.; Goddard M., Segal L., SpringerJ.A. and Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and Down,Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd.Chem. Toxicol 33, p. 223-231.
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. AcuteToxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods ow Toxicology.Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York,USA.
Додаток 1
НЕОБХІДНА ПРОЦЕДУРА СТОСОВНО КОЖНОЇ ПОЧАТКОВОЇ ДОЗИ
ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ
Для кожної початкової дози є схеми тестування (як вказано вданому Додатку), які описують подальшу процедуру.
- Додаток 1а: початкова доза: 5 мг/кг на вагу тіла,
- Додаток 1б: початкова доза: 50 мг/кг на вагу тіла,
- Додаток 1в: початкова доза: 300 мг/кг на вагу тіла,
- Додаток 1г: початкова доза: 2000 мг/кг на вагу тіла
Нижчеподані стрілки вказують на те, як відбуваєтьсяпроцедура, в залежності від кількості померлих або гуманнопозбавлених життя тварин.
Додаток 1А
Додаток 1В
Додаток 1С
Додаток 1D
Додаток 2
КРИТЕРІЇ КЛАСИФІКАЦІЇ ТЕСТОВАНИХ РЕЧОВИН
З ОЧІКУВАНИМИ ПОКАЗНИКАМИ НД БІЛЬШЕ 2000 МГ/КГ
50
БЕЗ НЕОБХІДНОСТІ ТЕСТУВАННЯ
Критерії небезпеки Категорії 5 необхідні для того, щоб можнабуло ідентифікувати тестовані речовини, рівень токсичності якихдосить низький, але які за певних обставин можуть становитинебезпеку вразливим групам людей. Очікувані показники НД при
50
пероральному або шкірному подразненні становитимуть
2000-5000 мг/кг або відповідатимуть еквівалентним дозам інших
напрямків тестувань. Тестовані речовини можна було б класифікувати
згідно категорії небезпеки так: 2000 мг/кг < НД < 5000 мг/кг
50
(Категорія 5 в ГГС). Класифікація можлива в наступних випадках:
(а) якщо на таку категорію вказують схеми тестуванняДодаток 1а-1г базуючись на летальних випадках,
(b) якщо є достатньо доказів того, що НД знаходиться в 50межах показників Категорії 5; або, якщо дослідження іншихтоксичних ефектів в тварин вказують на те, що можлива реальнавелика загроза життю людини;
(c) методом екстраполяції, оцінки або вимірювання даних, якщоне підтверджується зарахування речовини до класу більш загрозливиххімікатів, а також
- коли є достовірна інформація про те, що було виявленогострі токсичні ознаки у людей або
- мав місце летальний кінець під час тестування шляхомперорального введення, відповідно до показників Категорії 4, чи
- у разі експертного підтвердження того, що з'явились ознакитоксичності під час тестування, відповідно до показниківКатегорії 4, за винятком тестів на вияв діареї, пілоерекції абоінших невизначених ознак, або
- якщо в разі експертного підтвердження виявиться, що можливігострі ознаки токсичності, отримані в ході інших експериментів надтваринами.
