Про удосконалення організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами

Відповідно до абзацу другого статті 6 Закону України "Про захист населення від інфекційних хвороб" та пункту 9 Положення про Міністерство охорони здоров'я України , затвердженого Указом Президента України від 13 квітня 2011 року № 467, з метою подальшого удосконалення організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами

1. Затвердити:

1.1. Методичні рекомендації щодо організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами (далі - Методичні рекомендації), що додаються.

1.2. Склад робочої групи Міністерства охорони здоров'я України супроводу дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами, що додається.

1.3. Примірний перелік лікувально-профілактичних закладів (далі - ЛПЗ), на базі яких проводиться дозорний епідеміологічний нагляд за бактеріальними менінгітами, що додається.

1.4. Примірне положення про Центральну референс-лабораторію з інвазивних бактеріальних захворювань, що додається.

2. Покласти функції Центральної референс-лабораторії з інвазивних бактеріальних захворювань на бактеріологічну лабораторію ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України".

3. Голові Державної санітарно-епідеміологічної служби України (А. Пономаренко) прийняти цей наказ до керівництва та застосування під час здійснення державного санітарно-епідеміологічного нагляду.

4. Керівникам структурних підрозділів з питань охорони здоров'я Донецької та Хмельницької обласних, Київської міської державних адміністрацій спільно з територіальними органами та установами Держсанепідслужби України у Донецькій, Хмельницькій областях та м. Києві:

4.1. Затвердити склад робочих груп супроводу дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами, визначити відповідальних осіб та надіслати копії відповідних наказів до ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України".

4.2. Організувати виконання та забезпечити контроль за повнотою обліку випадків захворювань на бактеріальні менінгіти дітей до 5 років, виконанням комплексу лікувально-діагностичних, профілактичних та протиепідемічних заходів для здійснення дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами.

4.3. Організувати збір, зберігання та передачу зразків ліквору, культур, виділених з ліквору та крові дітей хворих та з підозрою на бактеріальні менінгіти, до лабораторних центрів Держсанепідслужби України у Донецькій, Хмельницькій областях та м. Києві для наступної щомісячної доставки до ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" відповідно до Методичних рекомендацій, затверджених цим наказом.

4.4. Забезпечити раціональне цільове використання медичних виробів та діагностичних препаратів, отриманих у вигляді технічної допомоги від Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВООЗ).

5. Головному лікарю ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" (Л. Некрасова) забезпечити:

5.1. Виконання бактеріологічною лабораторією ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" функцій Центральної референс-лабораторії з інвазивних бактеріальних захворювань відповідно до положення та Методичних рекомендацій, затверджених цим наказом.

5.2. Узагальнення звітів з дозорних регіонів щодо захворюваності на бактеріальні менінгіти, результатів лабораторної діагностики та подання звітів до МОЗ України та ВООЗ.

5.3. Проведення молекулярно-генетичних досліджень зразків ліквору, серологічне типування штамів збудників бактеріальних менінгітів, отриманих з дозорних регіонів.

5.4. Передачу зразків ліквору та виділених культур збудників до Регіональної референс-лабораторії Європейського регіонального бюро ВООЗ в Україні з інвазивних бактеріальних захворювань (Московський національно-дослідний інститут епідеміології та мікробіології ім. Г.Н. Габричевського, Москва, Російська Федерація) для поглибленого вивчення.

5.5. Участь в раундах міжнародного контролю якості.

5.6. Контроль за якістю здійснення комплексу заходів щодо проведення дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами в дозорних регіонах шляхом їх відвідування (за підтримки ВООЗ).

5.7. Надання організаційно-методичної допомоги дозорним лікувально-профілактичним закладам та лабораторним центрам Держсанепідслужби України у Донецькій, Хмельницькій областях та м. Києві у здійсненні комплексу заходів щодо проведення дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами.

5.8. Визначення потреби, замовлення та отримання витратних матеріалів для діагностики бактеріальних менінгітів, передачу їх дозорним лікувально-профілактичним закладам відповідно до переліку ЛПЗ, затвердженого цим наказом.

6. Вважати таким, що втратив чинність, наказ МОЗ України від 02.04.2007 № 159 "Про порядок організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами та рентгенологічно підтвердженими пневмоніями в період впровадження імунізації проти Xib-інфекції".

7. Департаменту реформ та розвитку медичної допомоги (М. Хобзей) відповідно до покладених завдань та функцій у межах компетенції здійснювати моніторинг за дотриманням Методичних рекомендацій закладами охорони здоров'я.

8. Контроль за виконанням цього наказу покласти на першого заступника Міністра О. Качура.

1.1. Ці Методичні рекомендації розроблені відповідно до Закону України "Про захист населення від інфекційних хвороб" та згідно з Положенням про Міністерство охорони здоров'я України , затвердженого Указом Президента України від 13 квітня 2011 року № 467.

Перелік умовних скорочень

ВООЗ - Всесвітня організація охорони здоров'я

БМ - бактеріальні менінгіти

ДНК - дезоксирібонуклеінова кислота

КА - кров'яний агар

КДЛ - клінічно-діагностична лабораторія

ЛА - лабораторний аналіз

ЛПЗ - лікувально-профілактичні заклади

ЛЦ - лабораторні центри Держсанепідслужби України

МОЗ - Міністерство охорони здоров'я України

ПЛР - полімеразна-ланцюгова реакція

РРЛ - Регіональна Референс-лабораторія Європейського регіонального Бюро Всесвітньої організації охорони здоров'я в Україні з інвазивних бактеріальних захворювань

СМР - спинномозкова рідина

ТІ-середовище - транс-ізоляційне середовище

ША - "шоколадний" агар

ЦРЛ - Центральна референс-лабораторія з інвазивних бактеріальних захворювань ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України"

ЦТА - цистин-триптиназний агар

McF - стандарт каламутності Мак Фарланда.

1.2. Метою дозорного епідеміологічного нагляду за БМ є оцінка ефективності комплексу профілактичних, протиепідемічних та лікувально-діагностичних заходів, спрямованих на зниження захворюваності БМ дитячого населення визначених регіонів для подальшої екстраполяції цих даних на все дитяче населення України.

1.3. Діти віком до 5 років з підозрою на менінгіт, які звернулися за медичною допомогою до амбулаторно-поліклінічної мережі, служби швидкої допомоги, інших закладів охорони здоров'я, госпіталізуються у спеціалізований інфекційний стаціонар з клініко-діагностичною лабораторією відповідного ЛПЗ, який входить до Примірного переліку ЛПЗ, визначеного цим наказом (далі - дозорний стаціонар) відповідно до Протоколів діагностики та лікування інфекційних хвороб у дітей , затверджених наказом від 9 липня 2004 року № 354 "Про затвердження Протоколів діагностики та лікування інфекційних хвороб у дітей".

1.4. Для ефективного проведення дозорного епідеміологічного нагляду і отримання найбільш повної інформації для аналізу та прийняття рішень необхідна чітка взаємодія спеціалістів різного профілю - епідеміологів, інфекціоністів, реаніматологів, педіатрів, імунологів, бактеріологів.

2.1. В систему дозорного епіднагляду включаються всі пацієнти молодше 5 років, у яких підозрюється менінгіт (визначення випадку представлено нижче), і які госпіталізовані (або будуть госпіталізовані) в стаціонарне відділення (інфекційний стаціонар або відділення реанімації та інтенсивної терапії).

Визначення вікових категорій:

молодше 5 років - дитина, яка ще не досягла 5-го року народження; ця категорія включає дітей у віці до 59 місяців і 29 днів (діти у віці 60 місяців в систему дозорного епіднагляду не включаються).

2.2. Клінічні критерії

- загальноінфекційний синдром;

- менінгеальний синдром.

Менінгеальний синдром включає:

- гідроцефально-гіпертензійні симптоми: різкий головний біль дифузного характеру, повторна блювота, загальна гіперестезія;

- менінгеальні симптоми: менінгеальна поза, тонічне напруження м'язів спини, ригідність м'язів потилиці, позитивні симптоми Керніга і Брудзинського (верхній, середній, нижній);

- у дітей раннього віку - вибухання (рідко втягнення) і напруження тім'ячка, позитивний симптом Лесажа, закидання голови назад.

2.3. Лабораторні критерії постановки діагнозу

В лабораторній діагностиці менінгіту використовують наступні методи:

Культуральний: виділення бактеріального патогена зі стерильної в нормі СМР або крові.

Серологічний: визначення антигену в стерильній у нормі СМР за допомогою латексаглютинації, імунохроматографічного дослідження.

Бактеріоскопічний: мікроскопія мазка нативного ліквору, пофарбованого за Грамом.

Молекулярно-генетичний: виявлення у лікворі специфічних фрагментів ДНК збудника бактеріального менінгіту.

2.4. Класифікація випадків

2.4.1. Підозрюваний випадок. Будь-яка дитина у віці до 5 років, що поступає в дозорний стаціонар з ознаками раптового підвищення температури (>38,5 °C ректально або 38 °C в пахвовій западині) і з наступними симптомами в анамнезі: ригідність потиличних м'язів, сплутана свідомість або інші менінгеальні ознаки або кожна дитина до 5 років, госпіталізована з клінічним діагнозом "менінгіт".

2.4.2. Вірогідний випадок. Підозрюваний випадок, як описано вище, у якого за результатами дослідження СМР виявлений, принаймні, один з наступних показників при дослідженні ліквору:

каламутність або непрозорість;

лейкоцитоз (> 100 кл/мм-3);

лейкоцитоз (10 - 99 кл/мм-3) і підвищений рівень білка (>100 мг/дл) або знижений рівень глюкози (< 40 мг/дл).

Примітки:

Якщо результати визначення концентрації білка і глюкози не відомі, то беруться до уваги тільки два перші показники, тобто каламутність СМР і вміст лейкоцитів > 100 кл/мм-3.

Показники білка і глюкози в зразках СМР, що містять кров, не використовують для визначення вірогідного випадку менінгіту, якщо співвідношення еритроцитів до лейкоцитів складає >500:1.

2.4.3. Підтверджений випадок. Це випадок підозри на менінгіт, підтверджений лабораторно: бактеріологічно - виділенням бактеріальної культури збудника або іншими методами: бактеріоскопічно (дослідження мазка, пофарбованого за Грамом), виявленням відповідних бактеріальних антигенів в імунохроматографічному тесті "Binax NOW Streptococcus pneumoniae Test" (далі - тест "Binax"), в реакції латексаглютинації (далі - ЛА) або бактеріальних ДНК в ПЛР (Haemophilus influenzae серотипу b, Streptococcus pneumoniae або Neisseria meningitis) в зразках матеріалу від дитини з клінічними проявами, характерними для БМ.

Дозорний епідеміологічний нагляд за БМ включає збір інформації щодо захворюваності дітей до 5 років, аналіз отриманої інформації і розробку на цій основі планів профілактичних і протиепідемічних заходів.

3.1. Порядок забезпечення дозорного епідеміологічного нагляду за БМ в дозорному стаціонарі.

3.1.1. Виявлення дітей, хворих на БМ та з підозрою на нього, встановлення діагнозу відповідно до клінічного визначення випадку захворювання на БМ, а також забезпечення реєстрації випадків захворювання здійснюється відповідним ЛПЗ.

3.1.2. В кожному дозорному стаціонарі має бути розроблений і затверджений головним лікарем алгоритм виявлення, обліку, лабораторного обстеження дітей, які включаються в систему дозорного епіднагляду відповідно до критеріїв визначених в пунктах 2.2 та 2.3 цих Методичних рекомендацій (включаючи дії персоналу у вихідні, святкові дні та позаробочий час).

3.1.3. На кожний виявлений випадок захворювання на менінгіт у дітей віком до 5 років, при підозрі на це захворювання, а також у разі зміни діагнозу медичні працівники дозорного стаціонару направляють протягом 12 годин екстрене повідомлення про інфекційне захворювання за формою № 058/о , затвердженою наказом МОЗ України від 10 січня 2006 року № 1 "Про затвердження Форм первинної облікової документації з інфекційної, дерматовенерологічної, онкологічної захворюваності та інструкцій щодо їх заповнення", зареєстрованого в Міністерстві юстиції України від 8 червня 2006 року за № 686/12560 (зі змінами та доповненнями), з використанням доступних засобів зв'язку (телефону телефон/факс, інтернет).

3.1.4. Кожен випадок захворювання на менінгіт у дітей віком до 5 років підлягає реєстрації та обліку за місцем його виявлення у формі № 060/о "Журнал обліку інфекційних захворювань" , затвердженою наказом МОЗ України від 10 січня 2006 року № 1 "Про затвердження Форм первинної облікової документації з інфекційної, дерматовенерологічної, онкологічної захворюваності та інструкцій щодо їх заповнення", зареєстрованого в Міністерстві юстиції України від 08 червня 2006 року за № 686/12560 (зі змінами та доповненнями).

3.1.5. Клінічні зразки (СМР та кров) для лабораторного дослідження повинні бути відібрані до початку антимікробної терапії або, якщо антибактеріальна терапія вже проводиться, перед повторним (черговим) введенням антибіотика і невідкладно доставлені до лабораторії у придатному для проведення лабораторних досліджень стані.

Із спинномозкового каналу, лікар за допомогою люмбальної (міжхребетної) пункції стерильно, дотримуючись правил асептики, відбирає СМР в день госпіталізації хворого у 3 стерильні пробірки (по 1 мл мінімум; при можливості, по 3 - 4 мл): пробірка № 1 для цитологічних та біохімічних (визначення білка та глюкози) досліджень; пробірка № 2 для бактеріологічних досліджень, тесту "Binax" та ЛА, пробірка № 3 (кріопробірка або Епендорф) - для дослідження методом ПЛР.

3.1.6. Відповідальний лікар - інфекціоніст дитячий дозорного стаціонару готує і вносить первинні дані на кожний підозрюваний, вірогідний та підтверджений випадок БМ до бланку "Заключного донесення", який передають до головних управлінь Донецького та Хмельницького обласних, Київського міського територіальних органів Держсанепідслужби України.

Форма "Заключного донесення" заповнюється на усі підозрілі, вірогідні та підтверджені випадки захворювання на менінгіт серед дітей віком до 5 років (незалежно від заключного діагнозу).

3.1.7. Лабораторії дозорних стаціонарів:

- з матеріалу у пробірці № 1 підраховують цитоз та роблять біохімічні дослідження ліквору; з пробірки № 2 - бактеріоскопію мазка пофарбованого за Грамом та первинний посів осаду СМР на поживні середовища, супернатант використовують для ЛА; пробірку № 3 заморожують та зберігають у морозильній камері. Про отримані результати інформують відповідального лікаря. Більш детально ці процедури описані в розділі 4 цих Методичних рекомендацій;

- передають у стислі терміни, з дотриманням вимог біологічної безпеки усі зразки СМР (включаючи залишки СМР, що залишилися від досліджень в КДЛ - окрема кріопробірка), виділені культури, у супроводі "Паспорта штаму" (додаток 3 до цих Методичних рекомендацій) та направлення, до ДУ "Донецький обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України" та ДУ "Хмельницький обласний лабораторний центр Держсанепідслужби України, ДУ "Київський міський лабораторний центр Держсанепідслужби України для подальшої передачі в ЦРЛ;

- забезпечують стаціонар стерильним лабораторним посудом та необхідними поживними середовищами;

- систематично беруть участь в раундах зовнішнього контролю якості мікробіологічних досліджень на бактеріальні менінгіти. Терміни проведення раундів зовнішнього контролю визначає ЦРЛ;

- беруть участь в раундах професійного тестування (міжнародний контроль якості досліджень), що організує та проводить ВООЗ.

3.2. Завдання ДЗ "Український центр з контролю та моніторингу захворювань МОЗ України" та ЦРЛ щодо забезпечення дозорного епідеміологічного нагляду за БМ в дозорних регіонах.

3.2.1. Координація діяльності Донецької та Хмельницької обласних, Київської міської робочих груп щодо проведення дозорного епіднагляду за БМ.

3.2.2. Митне очищення, отримання та розподіл діагностичних препаратів, медичних виробів, отриманих як технічна допомога від ВООЗ.

3.2.3. Організація та проведення необхідних тренінгів для лікарів-бактеріологів КДЛ дозорних стаціонарів та ЛЦ.

3.2.4. Отримання інформації щодо випадків менінгітів, аналіз, внесення її в електронну базу даних. Щомісячна передача електронної бази даних до ВООЗ відповідно до наданої програми.

3.2.5. Узагальнення отриманої інформації і інформування МОЗ до 25 числа першого наступного за звітним кварталом місяця.

3.2.6. Впровадження в практичну діяльність закладів та установ, залучених в систему дозорного епіднагляду за БМ, рекомендації ВООЗ.

3.2.7. Забезпечення лабораторного супроводу системи дозорного епіднагляду:

- підтримання та видача лабораторіям дозорних регіонів референс-штамів для контролю якості поживних середовищ та постановки діагностичних тестів;

- підтвердження та типування виділених культур збудників БМ, а за необхідності, або/при виникненні труднощів на місцях - проведення ідентифікації збудників захворювання;

- визначення чутливості виділених культур - збудників БМ до антибіотиків;

- ведення банку зразків СМР;

- тестування СМР за допомогою ПЛР, при необхідності, проведення усього комплексу досліджень з метою визначення етіологічного чинника БМ;

- передача зразків СМР та виділених культур збудників БМ до РРЛ;

- участь у системі Міжнародного контролю якості досліджень;

- організація та проведення зовнішнього контролю якості досліджень (готує та надає контрольні "імітаційні" задачі бактеріологічним лабораторіям ЛЦ та дозорних стаціонарів);

- участь в нарадах та тренінгах лабораторної мережі ВООЗ по дозорному епіднагляду за інвазивними бактеріальними захворюваннями в установленому порядку.

4.1. Забір і обробка матеріалу для дослідження

Основним біологічним матеріалом для лабораторних досліджень при БМ служать СМР і кров. Загальні вимоги до забору матеріалу надані у п. 3.2.3 цих Методичних рекомендацій.

При заборі і посіві досліджуваного матеріалу слід дотримуватись наступних вимог:

- виключити випадкову контамінацію матеріалу сторонньою мікрофлорою (правильний забір матеріалу, точний доступ до осередку інфекції, дотримання правил асептики);

- не допустити загибелі збудника з моменту забору матеріалу і до початку роботи з ним в лабораторії (доставка зразків або посівів в лабораторію негайно в теплому вигляді або тимчасове зберігання у відповідних умовах).

4.1.1. Спинномозкова рідина. Забір СМР проводять через голку для люмбальної пункції в 3 стерильні пробірки. В кожну з пробірок бажано зібрати 1 - 2 мл СМР (при можливості, по 3 - 4 мл). Для проведення всього комплексу лабораторних досліджень загальний об'єм відібраної СМР має складати не менше 3 мл. У випадку якщо, це неможливо технічно, має бути відібрано не менше 1 мл.

Пробірка № 1 має бути відправлена в клінічну лабораторію для біохімічного та цитологічного аналізу. СМР, що залишилася після проведення досліджень, необхідно зберегти та передати в бактеріологічну лабораторію для подальшого дослідження за допомогою тесту "Binax" та ЛА;

Пробірка № 2 - (стерильна, центрифужна, сумісна з центрифугою, якою користуються в лабораторії) має бути відправлена в бактеріологічну лабораторію для бактеріоскопії, бактеріологічного дослідження, тесту "Binax" та ЛА;

Пробірка № 3 - (кріопробірка або Епендорф) - має бути направлена для дослідження методом ПЛР в ЦРЛ). СМР, що залишилася після проведення досліджень в ЦРЛ, використовується для тесту "Binax" та ЛА (при необхідності) та для подальших досліджень в РРЛ.

При недостатній кількості СМР пріоритет має віддаватися мікробіологічному дослідженню, зокрема:

якщо доступні тільки 2 пробірки, вміст однієї має бути використаний для визначення глюкози, білка і цитологічного аналізу (залишок СМР передати до бактеріологічної лабораторії для подальших досліджень), а інша для бактеріоскопії, тесту "Binax", ЛА, бактеріологічного посіву та ПЛР;

якщо доступна тільки одна пробірка, то бажано, щоб вона поступила в бактеріологічну лабораторію для проведення бактеріоскопії, тесту "Binax", ЛА, бактеріологічного посіву та передачі в ЦРЛ для проведення ПЛР.

4.1.2. Кров. Кров для бактеріологічного дослідження відбирають з вени під час надходження хворого в стаціонар з дотриманням правил асептики і до початку антибіотикотерапії в кількості 2,0 - 4,0 мл - у дітей і 1,0 - 2,0 мл - у новонароджених і одразу засівають у флакони для гемокультур безпосередньо у відділенні.

Необхідно звертати увагу на те, що об'єм зразка, поміщений у флакон не повинен перевищувати 4-х мл.

Флакони для гемокультур перед використанням переглядають на предмет пошкоджень і дефектів, а також перевіряють їх термін придатності.

Не рекомендується міняти голки між венопункцією і посівом на середовище для гемокультур, а також надягати ковпачки на голки після використання, оскільки в цьому випадку існує високий ризик травми.

4.2. Зберігання та доставка матеріалу для досліджень

4.2.1. СМР. Зразок СМР для бактеріологічного дослідження має бути відправлений до бактеріологічної лабораторії та посіяний на відповідні поживні середовища протягом першої години після забору. Матеріал доставляють в спеціальних транспортних контейнерах, здатних підтримувати температуру (36 ± 1) °C. Роботу з матеріалом починають відразу після його надходження в лабораторію.

Зразки СМР, призначені для бактеріологічного дослідження, не повинні поміщатися в холодильник.

При неможливості швидкої доставки СМР з стаціонару в лабораторію (нічний час, вихідні і святкові дні тощо) рекомендується наступний порядок дій.

Посіяти СМР у кількості 0,5 - 1,0 мл у флакон з TI-середовищем. Флакон з середовищем дістають із холодильника, як мінімум, за 30 хвилин до посіву СМР. Для забезпечення оптимальних умов для росту мікроорганізмів середовище має бути прогріто до кімнатної температури (допускається використання термостату). До внесення матеріалу у флакон з середовищем його перевіряють візуально на наявність видимих ознак проросту або каламутності. За наявності ознак проросту або каламутності утилізують флакон з середовищем, оскільки воно може бути контамінованим.

Вказати на флаконі дату, П.І.Б. пацієнта і іншу необхідну інформацію.

Підняти стерильним пінцетом середню частину металевого ковпачка флакона. Продезінфікувати кришку 70% спиртом і дати висохнути (30 - 60 сек.). За допомогою стерильного шприца набрати 0,5 - 1,0 мл СМР з пробірки № 2 і внести у флакон, проткнувши голкою гумову пробку. Після посіву, перевернути флакон з TI-середовищем кілька разів для перемішування.

Якщо доставка в лабораторію затримується (до наступного дня або більше), вставити через гумову пробку флакона з ТІ-середовищем вентиляційну голку (стерильна голка для підшкірних ін'єкцій закрита стерильною ватою). Голка не повинна бути занурена в рідку фазу.

Зберігати флакони з посівами у вертикальному положенні при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 до відправки в лабораторію.

Посіви не повинні піддаватися дії прямого сонячного світла, зайвого нагріву і пилу. Перед транспортуванням в лабораторію видалити вентиляційні голки для запобігання витіканню рідкої фази і контамінації зразків під час транспортування і протерти гумову пробку 70% спиртом.

Якщо флакони з ТІ-середовищем можуть бути доставлені в лабораторію того ж дня, їх не вентилюють.

Зразки СМР для ПЛР необхідно по можливості швидко заморожувати при температурі -70 °C. За відсутності морозильної камери, що підтримує температуру -70 °C, використовують морозильну камеру на -20 °C. До заморожування зразки зберігають при температурі 2 - 8 °C в умовах холодильника не більше доби, враховуючи, що інформативність результатів ПЛР буде зворотно пропорційна часу затримки перед заморожуванням.

4.2.2. Кров. При неможливості негайно відправити флакони з гемокультурою в лабораторію їх зберігають в термостаті температурі 25 °C, при відсутності термостата - в умовах кімнатної температури до моменту відправки. Посіви не повинні поміщатися в холодильник.

4.3. Методи мікробіологічних досліджень

Лабораторії дозорних стаціонарів повинні використовувати наступні методи мікробіологічного дослідження: бактеріоскопія СМР, бактеріологічний посів СМР та крові, видова ідентифікація отриманих ізолятів, тест "Binax" та ЛА з СМР та виділеними штамами збудників, визначення чутливості їх до антибактеріальних препаратів.

В залежності від кількості СМР, що надійшла на дослідження, лікар-бактеріолог має визначити пріоритетність методів, з урахуванням наступного.

Якщо в пробірці, що надійшла до бактеріологічної лабораторії, міститься більше 1 мл СМР, то необхідно:

Струсити пробірку з СМР.

Відібрати в кріопробірку 0,5 мл СМР і заморозити для проведення ПЛР в ЦРЛ.

СМР, що залишилася, центрифугувати при 1200 g 5 - 10 хв. Осад, що утворився, використати для бактеріологічного посіву, приготування мазка для бактеріоскопії, а супернатант - для проведення тесту "Binax" та ЛА (при негативному результаті тесту "Binax").

Якщо в бактеріологічну лабораторію поступило менше 1 мл СМР, то:

Пробу не потрібно центрифугувати.

Струсити пробірку.

Приготувати мазок для бактеріоскопії, пофарбувати за Грамом, зробити посів на чашки з КА і ША.

СМР, що залишилася, у тому числі після досліджень в клінічній лабораторії, використовують для проведення тесту "Binax" та ЛА (при негативному результаті тесту "Binax") і направлення до ЦРЛ.

У всіх випадках бактеріологічний посів СМР здійснюють перед проведенням тесту "Binax", оскільки тампони, які використовуються в цьому тесті, не є стерильними, тому результати бактеріологічного дослідження СМР після занурення в неї тампона "Binax" можуть виявитися некоректними.

4.3.1. Бактеріоскопія мазка нативного ліквору

Приготування мазку з нативного ліквору. Фарбування за Грамом.

1. Провести центрифугування СМР при 1000 g 10 - 15 хв., якщо об'єм доступного для дослідження матеріалу > 1 мл.

2. Підготувати мазок шляхом нанесення 1 - 2 крапель ретельно перемішаного осаду СМР на предметне скло так, щоб крапля(і) утворила(и) одну велику пляму мутнуватої, однорідної суспензії. При цьому мають використовуватися нові предметні стекла.

3. Висушити мазок природним шляхом на повітрі.

4. Для фіксації пронести мазок 2 - 3 рази через полум'я пальника (не допускати перегріву предметного скла, оскільки це може зумовити значне спотворення істинної картини або руйнування клітин).

5. Залити мазок розчином кристалічного фіолетового (через фільтрувальний папір) і залишити на 1 хвилину.

6. Зняти фільтрувальний папір. Залити мазок розчином Люголя і залишити на 1 хвилину.

7. Знебарвити 96% етиловим спиртом протягом 5 - 10 сек., поки не перестануть відходити цівки фарби.

8. Ополоснути мазок дистильованою водою.

9. Провести контрастне фарбування сафраніном протягом 20 - 30 сек. або карболовим фуксином - 10 - 15 сек.

10. Промити мазок водою і висушити за допомогою фільтрувального паперу.

11. Провести бактеріоскопію мазка (в світлі що проходить з використанням масляної імерсії). Перегляд мазка проводять ретельно, переглядаючи як мінімум 20 полів зору, або до того часу, поки бактерії не будуть виявлені. Пряма мікроскопія дозволяє встановити наявність бактерій, що викликали захворювання.

N.meningitidis можуть розташовуватись поза клітиною або всередині лейкоцитів, за Грамом забарвлюються негативно, виглядають як диплококи схожі на зернини кави.

H.influenzae в мазках - дрібні грамнегативні кокобактерії або палички, схильні до поліморфізму, оточені ледь помітною ніжною капсулою, розташовані у вигляді коротких ланцюжків або ниток.

S.pneumoniae мають вигляд ланцетовидних диплококів та коротких ланцюжків, утворюють капсулу; вони грампозитивні, добре фарбуються усіма аніліновими барвниками, при цьому капсула залишається безбарвною і помітна тільки на забарвленому фоні.

Опис морфології інших бактерій викладений у відповідних нормативних документах.

Результат бактеріоскопії ліквору негайно сповіщають в стаціонар.

4.3.2. Бактеріологічне дослідження

Культивування посівів при первинному виділенні збудників менінгіту з СМР, крові та отриманні чистої культури має проводитися в атмосфері, що містить 5 - 10% CO2. З цією метою використовують CO2-термостати, анаеростати, спеціальні ємності, що герметично закриваються (типу GENbox) з газогенераторними пакетами. При їх відсутності для створення підвищеної концентрації CO2 можна використовувати будь-який посуд з притертою кришкою, наприклад, ексикатор із свічкою. Чашки з посівами розміщують в середині судини догори дном, там же закріплюють запалену свічку висотою 2 - 3 см та накривають кришкою. До моменту затухання свічки створюється підвищена концентрація CO2 (7 - 10%).

Бактеріологічний посів спинномозкової рідини.

Посів СМР на чашки з ША та КА бажано зробити безпосередньо "біля ліжка хворого" в стаціонарі після проведення пункції.

Чашки з поживними середовищами так само як і все приладдя необхідне для забору патологічного матеріалу, в достатній кількості повинні зберігатися в профільному відділенні стаціонару або їх негайно (при необхідності) доставляють з бактеріологічної лабораторії. Середовища зберігають в умовах холодильника (+4 °C). Перед пункцією поживні середовища дістають з холодильника і прогрівають в термостаті при 37 °C не менше 30 хв.

Після проведення пункції безпосередньо з пункційної голки виконують посів СМР на чашки з ША та КА. Чашку обережно відкривають і на поверхню середовища капають 3 - 4 краплі СМР. Чашку закривають, ставлять на рівну поверхню і за допомогою декількох кругових рухів чашки по поверхні столу розподіляють краплі СМР по поверхні агару. Після того, як СМР вбереться (звичайно 2 - 3 хвилини) необхідно зафіксувати дно і кришку чашки (наприклад пластиром) для того, щоб не виникло її випадкового відкриття.

Якщо посів СМР "біля ліжка хворого" не зроблено, його проводять в бактеріологічній лабораторії. Для цього стерильною пластиковою бактеріологічною петлею збирають невелику кількість СМР з осаду, що утворився після центрифугування або з пробірки, призначеної для бактеріологічних досліджень і проводять посів штрихом на заздалегідь прогріті в термостаті чашки з ША та КА.

Посіви інкубують при температурі (36 ± 1) °C протягом 24 - 48 годин в атмосфері CO2. За наявності росту на щільних поживних середовищах проводять візуальну оцінку колоній, що виросли, готують мазок, фарбують за Грамом, мікроскопують, визначають наявність оксидази, каталази і, залежно від отриманого результату, проводять подальшу ідентифікацію збудника і визначення чутливості до антибіотиків.

При надходженні до лабораторії посіву на TI-середовищі лабораторне дослідження проводять згідно наступної схеми:

A. При надходженні флаконів з ТІ-середовищем в день посіву:

Вставити в них вентиляційні голки та інкубувати при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Через 18 - 24 години інкубації очистити кришку флакона з посівом на TI-середовищі тампоном, змоченим спиртом, і при необхідності пропалити над полум'ям пальника. Стерильними шприцами з голками перенести 50 - 100 мкл рідкої частини TI-середовища на чашки з КА та ША;.

Інкубувати чашки з посівами при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 протягом 24 годин.

Посіви на TI-середовищі (з вентиляційною голкою) продовжувати інкубувати при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 до 7 діб.

Якщо через 24 години відсутній ріст на чашках з ША і КА відсутній, то дослідження проводять наступним чином:

Очистити кришку флакона з TI середовищем тампоном, просоченим спиртом, добре струсити флакон, щоб перемішати вміст і відібрати всю рідку фазу (бульйон), в стерильний одноразовий шприц.

Розлити бульйон в одну або декілька стерильних пробірок і центрифугувати при 3000 об/хв. протягом 10 хв.

Відібрати супернатант і дослідити його в реакції латексаглютинації. Супернатант, що залишився, заморозити для передачі в ЦРЛ.

Приготувати з частини осаду мазок і пофарбувати його за Грамом.

Осад, що залишився, посіяти штрихом на ША та КА. Інкубувати посіви в атмосфері CO2 при 37 °C 48 годин. Переглянути чашки на предмет росту через 24 години.

Якщо ріст на чашках відсутній, видалити алюмінієву кришку і гумову пробку флакона з середовищем TI. Зібрати стерильним тампоном матеріал з поверхні скошеного агару і посіяти його на ША та КА, інкубувати посіви в умовах, вказаних вище.

При наявності росту провести ідентифікацію виділених культур та визначення їх чутливості до антибактеріальних препаратів.

B. При надходженні флаконів з ТІ-середовищем в лабораторію з вентиляційними голками після 24 - 48 год. інкубації у відділенні, стерильними шприцами з голками, перенести 50 - 100 мкл рідкої частини TI-середовища на чашки з КА та ША. Далі дослідження проводити як вказано в пункті A.

На будь-якому етапі лабораторного дослідження, при необхідності, можуть додатково використовуватися поживні середовища, для виявлення інших збудників бактеріальних менінгітів відповідно наказу МОЗ України від 15.04.2005 № 170 "Про затвердження методичних вказівок з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів".

Бактеріологічний посів крові. Для вирощування посівів крові використовується автоматичний аналізатор гемокультур (наприклад BacT/ALERT і ін.). Посів здійснюють за рекомендаціям виробника щодо правильного використання аналізатора і поживних середовищ.

Проміжок часу між забором зразка і початком інкубації посіву повинен бути мінімальний, це дозволяє уникнути можливого негативного впливу на певні мікроорганізми наприклад S.pneumoniae.

Інкубація посівів крові. Посіви, що надійшли з відділень, помістити в автоматичний аналізатор гемокультур відповідно до інструкції виробника приладу. попередньо перевіривши їх на наявність ознак пошкоджень. Пошкоджені флакони не повинні поміщатися в аналізатор.

Посіви інкубують при (36 ± 1) °C до 5 діб.

Бактеріоскопія і висів. Після надходження сигналу про те, що у флаконі спостерігається ріст мікроорганізмів, його необхідно дістати з аналізатору, продезінфікувати гумову пробку спиртом і дати висохнути. Стерильним шприцом з голкою відібрати декілька крапель суміші рідкої фази з кров'ю. Посіяти штрихом по 1 краплі на чашки з ША та КА. Нанести 1 краплю на предметне скло для фарбування за Грамом. Негайно повідомити про результати бактеріоскопії лікуючого лікаря.

Інкубувати посіви на щільних середовищах при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 протягом 18 - 24 год.

Провести ідентифікацію отриманих культур згідно стандартним схемам. Провести визначення чутливості до антибактеріальних препаратів.

Всі культури, виділені із зразків крові, включаючи можливі контамінанти, повинні бути ідентифіковані до виду, поміщені в середовище для кріоконсервації і заморожені при -70 °C (-20 °C) для подальших досліджень в ЦРЛ.

Якщо після висіву на щільних поживних середовищах ріст відсутній, відібрати 1 мл бульйонної культури з початкового флакона для гемокультур в кріопробірку, заморозити зразок при -70 °C (-20 °C) для подальшого проведення ПЛР в ЦРЛ.

У випадку, якщо після закінчення 5 днів інкубації система не дає сигналу про наявність росту, проводять висів з флаконів на чашки з КА та ША, якщо після висіву ріст на щільних середовищах відсутній, приготувати мазок з бульйону, пофарбувати за Грамом. Якщо в мазку виявлені мікроорганізми, відібрати 1 мл бульйонної культури з початкового флакона для гемокультур в кріопробірку, заморозити зразок при -70 °C (-20 °C) для подальшого проведення ПЛР в ЦРЛ.

Якщо аналізатор повністю завантажений, але в лабораторію поступили нові посіви крові необхідно:

Видалити з приладу флакони з посівами, які інкубувалися довше за все, і продовжити інкубацію їх в термостаті при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 до 5 діб, щоденно переглядаючи на наявність росту. При появі росту або після 5 діб інкубації навіть при відсутності візуально помітного росту, провести висів на чашки з ША та КА. Зробити мазок і пофарбувати за Грамом. Повідомити про результати бактеріоскопії лікуючого лікаря.

Провести ідентифікацію отриманих культур згідно стандартним схемам. Провести визначення чутливості до антибактеріальних препаратів.

Якщо після висіву ріст на щільних середовищах відсутній, приготувати мазок з бульйону, пофарбувати за Грамом. Якщо в мазку виявлені мікроорганізми, відібрати 1 мл бульйонної культури з початкового флакона для гемокультур в кріопробірку, заморозити зразок при -70 °C (-20 °C) для подальшого проведення ПЛР в ЦРЛ.

Експрес-методи діагностики

Одними з найпростіших методів, що дозволяють швидко дати висновок про відсутність або наявність в СМР хворого специфічних антигенів збудників, є реакція ЛА і імунохроматографічний тест.

Реакція латекс-аглютинації. При проведенні пробопідготовки до ЛА і власне реакції необхідно точно слідувати інструкції, що додається до набору реактивів. Одну краплю кожного латексного реактиву (заздалегідь реактиви рекомендується ретельно струсити) нанести на спеціальні паперові карти, прикладені до набору. Потім додати супернатант або фільтрат СМР до кожної краплі латексного реактиву. Перемішати чистим аплікатором. Обережно похитати паперову карту. Поява аглютинації протягом декількох хвилин з одним з реактивів свідчить про присутність у досліджуваному зразку специфічного антигена.

Експрес тест "Binax NOW Streptococcus pneumoniae Test" є імунохроматографічним тестом, що проводиться на мембрані, для виявлення розчинного антигену пневмокока в СМР.

Кролячі антитіла до антигену S.pneumoniae адсорбовані у вигляді смуги на нітроцелюлозної мембрани в зоні читання результату. Козячі антитіла проти IgG кролика адсорбовані на тій же мембрані у вигляді другої смуги (контрольна лінія). Кролячі антитіла до антигену S.pneumoniae разом з антивидовими антитілами, кон'юговані з пофарбованими частинками для візуалізації, нанесені на волокнисту інертну підкладку і висушені. Підкладка, яка містить кон'югат та мембранна смужка з'єднані для формування тест-смужки. Дана тест-смужка вмонтована в касету у формі книжки, що відкривається, і має лунку для внесення тампона з досліджуваним зразком, розташовану на протилежному боці касети.

Для проведення тесту тампон, що додається до тесту, занурюють у досліджуваний зразок СМР, виймають і поміщають в лунку касети. Потім додають реагент A (буферний розчин), що додається до тесту у пластикової крапельниці. Касету закривають для приведення досліджуваного зразка в контакт з тест-смужкою. Антиген S.pneumoniae, що міститься в досліджуваному зразку, зв'язується з розташованими на підкладці антитілами пофарбованого кон'югату, і цей забарвлений комплекс антиген-кон'югат зв'язується за рахунок наявності антигена з іммобілізованими на мембрані кролячими антитілами до антигенів S.pneumoniae, формуючи пофарбовану лінію в зоні читання зразка. Іммобілізовані на смужці у вигляді лінії козячі антитіла проти IgG кролика також зв'язують пофарбований кон'югат, формуючи контрольну лінію.

Облік результатів тесту проводять по наявності або відсутності візуально помітних забарвлених ліній від рожевого до пурпурного кольору.

Позитивний результат, який реєструється протягом 15 хвилин, у залежності від концентрації антигену, присутнього в зразку СМР, включає появу двох пофарбованих ліній в зоні читання результату.

Негативний результат, також читається через 15 хвилин, дає лише одну пофарбовану контрольну лінію і свідчить про те, що антиген S.pneumoniae в досліджуваному зразку СМР не виявлений.

Відсутність пофарбованої контрольної лінії, незалежно від наявності або відсутності пофарбованої лінії в зоні читання результату, свідчить про недійсність проведеного тесту.

4.3.3. Ідентифікація збудників бактеріальних менінгітів

Neisseria meningitidis

Характеристика збудника. За "Визначником бактерій Берджі" Neisseria meningitidis, відноситься до роду Neisseria. Рід Neisseria належить до "Групи грамнегативних аеробних та мікроаерофільних паличок і коків". Морфологічно клітини менінгококів мають округлу форму і розміри порядку 0,6 - 1,0 мкм. Величина мікробних клітин і їх форма можуть розрізнятися, що визначає характерну для менінгококів ознаку клітинного "поліморфізму". Ця ознака особливо виражена в мазках із свіжих культур, при цьому загальна морфологічна картина культурального мазка, пофарбованого за Грамом, має вид лежачих безладно поліморфних (по величині і забарвленню) грамнегативних коків (ефект "розсипаного гороху"). Парне розташування менінгококів (диплококів) спостерігають в препаратах, приготованих з рідин і органів ураженого організму. В СМР менінгококи часто розташовуються внутрішньолейкоцитарно і мають форму кавового зерна.

Менінгококи нерухливі, спор не утворюють, джгутиків не мають, аероби, надзвичайно чутливі до дії факторів зовнішнього середовища. Температурний оптимум життєдіяльності - +37 °C в атмосфері з підвищеним вмістом CO2 (5 - 10%) і вологості. Менінгококи потребують високопоживних середовищ, що містять нативні білки або кров тваринного походження. При рості на щільних поживних середовищах утворюють невеликі, злегка опуклі, напівпрозорі колонії з ідеально рівними краями. При інкубації посівів в термостаті протягом 2 - 5 днів колонії збільшуються в розмірі, стають менш прозорими і краї їх набувають нерівний вигляд. Біохімічна активність менінгококів невелика, з числа багатьох вуглеводів вони ферментують тільки глюкозу і мальтозу з утворенням кислоти без газу, не розріджують желатин, оксидазо-, каталазопозитивні. Відповідно до особливостей будови полісахаридної капсули менінгококи підрозділяють на 12 серогруп: A, B, C, X, У, Z, W-135, 29-E, K, H, L, I.

Ідентифікація Neisseria meningitidis

Виділення та ідентифікацію менінгококів виконують по наступних тестах:

1. Виявлення в нативному матеріалі диплококів з характерними морфологічними ознаками.

2. Характерний ріст тільки на високопоживних середовищах.

3. Типова морфологія культурального мазка за Грамом.

4. Наявність активності каталази і цитохромоксидази.

5. Сахаролітична активність відносно глюкози і мальтози.

6. Виявлення специфічних антигенів в СМР та/або сироватці крові в ЛА.

При посіві на поживні середовища і подальшій інкубації протягом 18 - 24 годин при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 виявляються наступні культуральні властивості: на чашках з ША та КА менінгококи ростуть у вигляді ніжних напівпрозорих сіруватих колоній з ідеально рівними краями, з блискучою поверхнею, розміром 1 - 2 мм. Мають маслянисту консистенцію, не міняють кольору середовища.

Тест на каталазу. Метод базується на здатності мікроорганізмів, що мають фермент каталазу, розщепляти перекис водню, утворюючи воду та кисень.

На предметне скло нанести краплю 10% перекису водню, в неї пластиковою одноразовою петлею або скляною паличкою внести 18 - 24 годинну культуру досліджуваного штаму, вирощену на КА при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, і розтерти круговими рухами. Слід намагатися не зачепити частинки КА, оскільки еритроцити в КА можуть стати причиною хибнопозитивної реакції.

При позитивній реакції утворюється піна (бульбашки газу).

Позитивний контроль - Staphylococcus spp.

Негативний контроль - S.pneumoniae.

Тест на цитохромоксидазу. Реагент тетраметил-пара-фенілендиаміна гідрохлорид набуває синьо-фіолетового забарвлення під впливом мікроорганізмів, продукуючих фермент цитохромоксидазу.

Для постановки тесту використовують комерційні диски або стрипи для визначення оксидази.

Пластиковою петлею або дерев'яною паличкою зняти колонію 18 - 24 годинної культури досліджуваного штаму, вирощену на КА при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2. Втерти її в оксидазний стрип або диск. Не слід користуватися нихромовою петлею із-за вірогідності одержати хибнопозитивну реакцію.

Оксидазопозитивні культури через 10 - 30 сек. дають синьо-фіолетове забарвлення.

Позитивний контроль - контрольний штам N.meningitidis або N.lactamica.

Негативний контроль - S.pneumoniae або S.mitis.

Визначення сахаролітичної активності. Пластиковою петлею проводять посів чистої 18 - 24 годинної культури, вирощеної на КА при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, на попередньо прогріті до кімнатної температури щільні поживні середовища з вуглеводами.

Посів проводять шляхом приблизно 8 "уколів" петлею з посівним матеріалом в пробірку з середовищем, занурюючи її на глибину 10 мм від поверхні. Для кожного вуглеводу використовують окремі одноразові петлі.

Посіви інкубують при температурі (36 ± 1) °C без атмосфери CO2 від 72 годин до 5 діб.

Позитивний результат - поява видимих ознак каламутності і жовтого забарвлення у верхній частині стовпчика середовища.

Зміна кольору середовища на жовтий без помутніння, як правило, не є позитивною реакцією.

Для контролю якості використовують контрольні штами N.meningitidis, N.lactamica і N.sicca.