9.9. Облік результатів. Результат оцінюють по кожній дослідженій пробі окремо. У зразку продукту констатують присутність Listeria monocytogenes, якщо при посіві на селективні середовища виділені короткі неспороутворюючі грампозитивні палички, каталазопозитивні, рухливі при (25 +- 1) град. С і нерухомі при (37 +- 1) град. С, які утилізують ескулін, зброджують з утворенням кислоти рамнозу і не зброджують маніт і ксилозу, не відновлюють нітрати до нітритів, володіють бета-гемолітичною активністю, дають позитивну реакцію в САМР-тесті з S. aureus і негативну - з R. equi, виявляють лецитиназну активність на поживному агарі с додаванням жовтка курячого яйця й у присутності активованого вугілля.
Результати виявлення Listeria monocytogenes у визначеній наважці продукту записують: "Listeria monocytogenes виявлені в 25 г (куб. см) (у 50-100 г - для продуктів дитячого, лікувального і спеціалізованого харчування) продукту" чи "Listeria monocytogenes не виявлені в 25 г (куб. см) (у 50-100 г - для продуктів дитячого, лікувального і спеціального харчування) продукту".
10. Виявлення Listeria monocytogenes у реакції наростання титру фага (РНФ)
Реакція наростання титру фага - швидкий специфічний метод виявлення лістерій, що забезпечує виявлення збудника в досліджуваному матеріалі без виділення культури і може бути використана як додатковий метод для виявлення L. monocytogenes у харчових продуктах (при проведенні протиепідемічних заходів і при епідрозслідуванні).
РНФ заснована на властивості індикаторного бактеріофага строго специфічно розмножуватися в клітинах гомологічного мікроба. Розмноження бактеріофага супроводжується збільшенням кількості його часток і підвищенням титру.
У реакції застосовують лістеріозні бактеріофаги L2A і L4A. Штами L. monocytogenes I (9-127) і II (9-72) серогруп. Поживні середовища з 0,5% глюкози: 1,5% МПБ, і 0,7% МПА.
При постановці РНФ із пробами харчових продуктів зважують 25 г досліджуваного матеріалу, подрібнюють, поміщають у колбу ємністю 1 куб. дм і додають 250 куб. см МПБ. Суміш протягом 5-10 хв. струшують, потім 9 куб. см переносять у бактеріологічну пробірку N 1 (дослід).
Бактеріофаги використовують у робочому розведенні
(10 000 фагових корпускул у 1 куб. см). Для цього їх розчиняють у
МПБ до вихідного об'єму, зазначеного на етикетці ампули, а потім
на МПБ окремими піпетками роблять п'ять послідовних десятикратних
розведень (в останньому розведенні титр бактеріофага складе
4
1 х 10 ).
Суміш фагів готують шляхом змішування рівних об'ємів фагу L2A і L4A у робочому розведенні.
Для контролю титру бактеріофага, (ставлять один на групу аналізів), проведених одночасно, у пробірку N 2 (контроль) вносять 9 куб. см МПБ.
У пробірки N 1 і 2 вносять по 1 куб. см суміші фагів в робочому розведенні і витримують їх протягом 16-24 год. при кімнатній температурі, після чого в пробірки додають по 1 куб. см хлороформу. Вміст ретельно струшують і залишають при кімнатній температурі на 30-40 хв. Хлороформ осідає на дно, надосадову рідину піддають подальшим дослідженням.
При використанні суміші фагів з дослідної і контрольної пробірок (N 1 і 2) беруть по 0,2 куб. см і переносять по 0,1 куб. см у дві пробірки, що містять по 0,9 куб. см МПБ (один ряд для виявлення фагу L2A, а другий - L4A), а потім з кожної пробірки готують ще одне десятикратне розведення.
Готують суспензії штамів I і II серогруп за стандартом мутності 10 од. шляхом розведення добової агарової культури у фізіологічному розчині. В усі пробірки з розведеним матеріалом додають по 0,1 куб. см суспензії штаму 1 серогрупи для виявлення фагу L2A або штаму II серогрупи для виявлення фагу L4A.
Вміст пробірок засівають методом агарових шарів за Граціа. Для цього напередодні дня дослідження в чашки Петрі розливають по 10 куб. см 1,5% МПА; Якщо МПА розливають у день дослідження, то поверхню агару попередньо підсушують протягом 40-50 хв. при (37 +- 1) град. С або 2 год. при кімнатній температурі. Для другого шару використовують розплавлений і охолоджений до (48-50) град. С 0,7% МПА, який варто використовувати протягом години, тому що пізніше він набуває желеподібної консистенції і непридатний для дослідження. У пробірки піпеткою вносять по 2,5-3 куб. см розплавленого й охолодженого до 48-50 град. С 0,7% МПА. Вміст швидко і ретельно перемішують обертанням пробірки між долонями і виливають у чашку Петрі. Суміш легким погойдуванням чашки рівномірно розподіляють другим шаром на поверхні 1,5%-ного МПА. Чашки залишають на рівному місці на 20-30 хвилин (до застигання 0,7% МПА), потім перевертають і інкубують при кімнатній температурі.
Облік реакції проводять через 16-24 год. інкубації посівів.
У дослідних пробах і контролі титру фага підраховують число негативних колоній у всіх чашках. Негативні колонії - округлі, добре помітні на тлі бактеріального росту, прозорі ділянки, що утворяться в результаті лізису бактерій.
При обліку результатів порівнюють кількість негативних колоній на чашках відповідних розведень.
Результати реакції оцінюють за збільшенням титру бактеріофага (кількості негативних колоній):
- збільшення кількості негативних колоній у пробі, що досліджується, відносно контролю в 5 і більше разів (хоча б по одному з розведень) оцінюється як позитивний результат, менше, ніж у 5 разів - негативний;
- суцільний лізис або лізис з острівцями оцінюється як позитивний результат.
При одержанні позитивного результату РНФ дають висновок, що в досліджуваному матеріалі (пробі) виявлені бактерії роду Listeria.
11. Визначення Listeria monocytogenes за допомогою автоматичного імуноаналізатора типу "miniVIDAS"
Дослідження проводять із застосуванням набору VIDAS Listeria monocytogenes II (LMO 2). Для визначення Listeria monocytogenes слід дотримуватись інструкції виробника. Отримання позитивного результату свідчить про наявність у пробі патогенних лістерій. Позитивні результати, отримані експрес-методом потребують підтвердження бактеріологічним методом.
12. Біологічні, серологічні та молекулярно-генетичні дослідження
Біологічні дослідження виділених культур (постановка біопроб на мишах) і їх серологічну діагностику в реакції аглютинації, а також молекулярно-генетичні дослідження біологічного матеріалу, проб з об'єктів довкілля проводять у ході протиепідемічних заходів і при епідрозслідуванні захворювань відповідно до методичних рекомендацій "Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики", затверджених МОЗ СРСР 04.09.86 та інструкцій про застосування до відповідних тест-систем або наборів реагентів для молекулярно-генетичних методів досліджень.
13. Вимоги безпеки
Дослідження харчових продуктів на наявність Listeria monocytogenes проводять відповідно до державних санітарних правил ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю".
Пам'ятати! Listeria monocytogenes є патогенним мікроорганізмом і вимагає особливо обережного обігу. Вагітним жінкам працювати з культурами Listeria monocytogenes не рекомендується.
Ряд реагентів (хлорид літію, реактиви для нітратного тесту), що використовуються при дослідженні небезпечні вимагають обережного обігу. Уникати дотику і вдихання парів. При попаданні на шкіру негайно змити великою кількістю води.
14. Нормативні посилання
2. Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення".
3. Закон України "Про захист населення від інфекційних хвороб".
4. Закон України "Про безпечність та якість харчових продуктів".
5. Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні, затверджене Постановою Кабінету Міністрів України 22.06.99 N 1109, в редакції Постанови Кабінету Міністрів України від 19.08.02 N 1217.
6. ДСП N 9.9.5.064.2000 "Порядок видачі дозволів на роботу із мікроорганізмами I-IV груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК".
7. ДСП N 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю".
8. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований".
9. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".
10. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".
11. ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа".
12. ГОСТ 9958-81 "Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа".
13. ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы микробиологического анализа".
14. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".
15. Методические рекомендации "Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики" МЗ СССР 04.09.86.
16. СанПиН 42-123-4940-88 "Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского лечебного и диетического питания, их компонентов".
17. СанПиН 42-123-4423-87 "Нормативы и методы микробиологического контроля продуктов детского питания, изготовленных на молочных кухнях системы здравоохранения".
18. Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских безпозвоночных, утверждена заместителем главного государственного санитарного врача СССР 22.02.91 N 5319-91.
19. МР 4.4.4.-108-2004 Методичні рекомендації "Періодичність контролю продовольчої сировини та харчових продуктів за показниками безпеки".
20. Положение о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения, утверджено главным государственным санитарным врачом СССР 18.05.79.
21. ДСТУ ISO 11290-1:2003 "Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення та підрахування Listeria monocytogenes, ч. 1. Метод виявлення"
22. ДИРЕКТИВА СОВЕТА 92/46/ЕЕС от 16.06.92 устанавливающая медико-санитарные правила по производству и размещению на рынке сырого молока, молока, подвергнутого тепловой обработке, и продуктов на молочной основе.
| Заступник Головного державного санітарного лікаря України | Л.М.Мухарська |
Додаток
до методичних вказівок
"Організація контролю
і методи виявлення бактерій
Listeria monocytogenes
у харчових продуктах
та продовольчій сировині"
(Рекомендований)
ПОЖИВНІ СЕРЕДОВИЩА
промислового виробництва, зареєстровані в Україні, рекомендовані для виділення Listeria monocytogenes
Для культивування ізолятів
Поживний агар/бульйон - Nutient Agar/Broth (M001/M002)
Приготування: Розмішати 28,0 г порошку M001 або 13,0 г порошку M002 в 1000 куб. см дистильованої води. Прокип'ятити до повного розчинення часток. Розлити у відповідні ємкості. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Для приготування середовища для культивування лістерій в середовище M001 перед стерилізацією вносять глюкозу (10,0 г) і ретельно перемішують, або стерильний розчин глюкози асептично додають (до кінцевої концентрації 1%) в середовище M001 після його стерилізації. Готове середовище має світло-бурштиновий колір, прозоре або з легкою опалесценцією.
Дріжджовий триптон-соєвий агар/бульйон - Tryptone Soya Yeast Extract Agar/Broth (M1214/M1263)
Ці середовища рекомендовані фахівцями комітету ISO для виявлення лістерій, а також для культивування і зберігання багатьох гетеротрофних мікроорганізмів.
Приготування: Розмішати 51,0 г порошку M1214 або 36,0 г порошку M1263 в 1000 куб. см дистильованої води. Кип'ятити до повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Готові середовища мають жовтий колір, прозорі.
Принцип і оцінка результату. За рекомендаціями американських фахівців, для виділення Listeria monocytogenes з молочних продуктів досліджуваний матеріал засівають в середовище збагачення і інкубують при 30 град. С протягом 24-48 год. Потім культуру засівають штрихами на Модифікований агар Мак-Брайда для лістерій (M891) з циклогексамідом або Агар LPM (M1228) з подальшою інкубацією при 35 град. С протягом 48 год. Підозрілі на лістерії колонії відбирають у відбитому світлі (45 град. ), після чого їх розсівають на Дріжджовий Триптон-соєвий агар (M1263). Колонії лістерій виглядають щільними білими або веселково-білими, нагадуючи бите скло. Колонії інших мікроорганізмів жовті або оранжеві.
Середовища селективного збагачення
Основа бульйону Фрейзера - Fraser Broth Base (M1327)
Основа бульйону Фрейзера з добавками FD125I і FD141 рекомендована Міжнародним комітетом стандартизації як первинне, а також як вторинне середовище збагачення для виділення і підрахунку Listeria monocytogenes в харчових продуктах.
Приготування. Розмішати 54,92 г порошку в 1000 куб. см дистильованої води. При необхідності підігріти для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Охолодити до 45-50 град. С і асептично додати розчинений в 10 куб. см 0,2 N NaOH вміст 1 флакона селективної добавки Фрейзера (FD125I) і розчинений в 1-2 куб. см стерильної дистильованої води вміст 2 флаконів добавки Фрейзера (FD141) до 1000 куб. см середовища для первинного збагачення або по 1 флакону FD125I і FD141 до 500 куб. см середовища для вторинного збагачення. Добре перемішати і розлити у пробірки (флакони).
Принцип і оцінка результату. Хлористий літій пригнічує ріст ентерококів. Налідиксова кислота і акрифлавін пригнічують ріст відповідно грамнегативної і грампозитивної флори. Listeria monocytogenes гідролізує ескулін до ескулетину і глюкози. Реагуючи з цитратом заліза, ескулетин утворює коричнево-чорний комплекс, що приводить до потемніння середовища.
Досліджувані зразки засівають в бульйон для первинного збагачення (1 флакон FD125I і 2 флакони FD141 на 1000 куб. см Основи бульйону Фрейзера) і інкубують протягом 24 годин при 30 град. С. Після первинного збагачення 0,1 куб. см культури пересівають в бульйон для вторинного збагачення (1 флакон FD125I і 1 флакон FD141 на 500 куб. см Основи бульйону Фрейзера) і інкубують протягом 18 годин при 35-37 град. С. Культуру висівають на Оксфордський агар або на PALCAM агар для подальшого виділення і підрахунку.
Бульйон збагачення для лістерій -
Listeria Enrichment Broth (M569)
Приготування. Розмішати 26,0 г порошку частини А і 37,5 г порошку частини В в 1000 куб. см дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення часток. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Готове середовище має жовте забарвлення, прозоре або з легкою опалесценцією.
Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну і пептичний перевар тваринної тканини є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій. Тіамін стимулює ріст лістерій. Роданід і налідиксова кислота пригнічують ріст грамнегативних бактерій. Комбінація селективних речовин і акридинових фарбників пригнічує ріст ентерококів. Контаміновані зразки засівають в Бульйон збагачення для лістерій безпосередньо або проводять холодове збагачення в Триптозному бульйоні (M179), після чого культури відсівають на Селективний агар для лістерій. Гемоліз можна перевірити шляхом висіву на кров'яний агар (M073).
Середовище збагачення для лістерій (UVM) -
Listeria Enrichment Medium (UVM Medium) (M890)
Приготування. Розмішати 54,37 г порошку в 1000 куб. см дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Охолодити до 50 град. С і асептично додати стерилізований фільтруванням розчин акрифлавіну гідрохлориду (до кінцевої концентрації 12 мкг/куб. см або 25 мкг/куб. см). Готове середовище має янтарне забарвлення, з легкою опалесценцією з голубуватим відтінком.
Принцип і оцінка результату. Середовище використовують для двоступеневого селективного збагачення лістерій, що дозволяє збільшити висів Listeria monocytogenes з м'ясних продуктів протягом 3-4 днів. Це середовище рекомендують як середовище первинного збагачення для виділення лістерій, пошкоджених при термічній обробці.
Гідролізат казеїну, протеозопептон, дріжджовий і м'ясний екстракти є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій. Ескулін надає середовищу диференціюючи властивостей. Налідиксова кислота і акрифлавін пригнічують ріст, відповідно, грамнегативних і грампозитивних мікроорганізмів, що, разом з підвищеною концентрацією фосфату, додає середовищу селективних властивостей по відношенню до лістерій.
Для збагачення до 25,0 г або 25,0 куб. см матеріалу додають 225 куб. см середовища, що містить 12 мкг/куб. см акрифлавіну і інкубують при 30 град. С протягом 4 годин, після чого висівають 0,2 куб. см культури на чашки з Селективним агаром для лістерій. Через 24 год. інкубації 0,1 куб. см культури вносять в 10,0 куб. см того ж середовища, що містить 25 мкг/куб. см акрифлавіну гідрохлориду, і через 24 год. знову роблять висів на чашки з Селективним агаром для лістерій. Бульйонні культури лістерій представляють велику небезпеку, в порівнянні з колоніями на агарі, тому при роботі з ними треба дотримуватися особливої обережності.
Бульйон збагачення для лістерій, модифікований -
Listeria Enrichment Broth, Modified (M888)
Приготування. Розмішати 52,0 г порошку в 1000 куб. см дистильованої води. Підігріти (при необхідності) для повного розчинення частинок. Розлити у відповідні ємкості. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Готове середовище має жовте забарвлення, прозоре або з легкою опалесценцією з блакитним відтінком.
Принцип і оцінка результату. Це середовище використовують для селективного збагачення видів Listeria з молока, молочних і інших харчових продуктів. Середовище містить триптозу, дріжджовий і м'ясний екстракти, які є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій, у тому числі вітамінів, амінокислот, мікроелементів. Хлорид натрію підтримує оптимальний осмотичний тиск середовища, а фосфати надають йому буферних властивостей. Налідиксова кислота і акрифлавін пригнічують ріст, відповідно, грамнегативних і грампозитивних мікроорганізмів, за винятком лістерій.
Для збагачення до 25,0 г або 25,0 куб. см матеріалу додають 225 куб. см середовища і, при необхідності, подрібнюють. Інкубацію ведуть при 30 град. С протягом 7 діб, роблячи висів через 1, 2, і 7 днів на Селективний агар для лістерій.
Основа бульйону вторинного збагачення для лістерій -
Fraser Secondary Enrichment Broth Base (M1083)
Це середовище із спеціальною добавкою рекомендують для виділення, культивування і збагачення Listeria monocytogenes з харчових продуктів і об'єктів довкілля.
Приготування. Розмішати 57,85 г порошку в 990 куб. см дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Остудити до 45-50 град. С і асептично додати розчинений в 10 куб. см 0,2 N NaOH вміст 1 флакона з однією з добавок Фрейзера (FD064 або FD065). Ретельно перемішати і розлити у відповідний посуд.
Готове середовище має жовте забарвлення, прозоре, з легким преципітатом. Після введення добавки середовище набуває флюоресцентно-жовтого забарвлення і має легкий преципітат.
Принцип і оцінка результату. Протеозопептон, гідролізат казеїну, дріжджовий і м'ясний екстракти є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій. Хлорид літію пригнічує ріст ентерококів. Усі лістерії гідролізують ескулін до ескулетина, який з іонами заліза формує коричнево-чорний або чорний комплекс. Цитрат амонійного заліза стимулює ріст Listeria monocytogenes. Цей бульйон засівають матеріалом з середовища первинного збагачення. Культури, що виросли на бульйоні Фразера, відсівають на щільні середовища для підтвердження присутності лістерій.
Основа селективного бульйону для лістерій -
Listeria Selective Broth Base (M889)
Це середовище з додаванням селективних речовин рекомендують для селективного виділення і культивування Listeria monocytogenes.
| Склад: | грам/куб. дм |
| Гідролізат казеїну Папаїновий перевар соєвого борошна Дріжджовий екстракт Натрію хлорид Калію гідрофосфат Глюкоза Кінцеве значення pH (при 25 град. С) 7,3 +- 0,2 | 17,00 3,00 6,00 5,00 2,50 2,50 |
Приготування. Розмішати 36,0 г порошку в 1000 куб. см дистильованої води. Підігріти для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Охолодити до кімнатної температури і асептично додати розчинений в 5 куб. см 0,2 N NaOH вміст 1 флакона з Селективною добавкою для лістерій II (FD163) або 2 флаконів з Селективною добавкою для лістерій I (FD163I). Перед розливом ретельно перемішати.
Готове середовище має жовте флуоресціююче забарвлення, прозоре, без будь-якого преципітату.
Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну, папаїновий перевар соєвого борошна і дріжджовий екстракт є джерелом необхідних поживних речовин для росту бактерій. Глюкоза є джерелом енергії. Добавки, що вносяться, надають середовищу селективних властивостей. Циклогексамід пригнічує ріст сапрофітних грибів. Налідиксова кислота і акрифлавін пригнічують ріст, відповідно, грамнегативних і грампозитивних мікроорганізмів.
Для збагачення до 25,0 г або 25,0 куб. см матеріалу додають 225 куб. см середовища і, при необхідності, подрібнюють. Інкубацію ведуть при 30 град. С до 7 доби. Вказаний період інкубації підходить для більш ефективного виділення пошкоджених зовнішніми чинниками лістерій з молока і молочних продуктів. Через 1, 2, і 7 днів інкубації матеріал висівають на Селективний агар для лістерій.
Диференційно-діагностичні селективні середовища
Агар для ідентифікації лістерій (PALCAM) -
Listeria Identification Agar (PALCAM) (M1064) Поліміксин (Polymyxin) - Акрифлавін (Acriflavine) - Літій (Lithium-chloride) - Цефтазідім (Ceftazidime) Ескулін (Esculin) - Маніт (Mannitol) агар з добавкою FD061 рекомендований для виділення лістерій з харчових продуктів.
Приготування. Розмішати 34,5 г порошку в 500 куб. см дистильованої води. Прокип'ятити до повного розчинення середовища. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Охолодити до 50 град. С і асептично додати розчинений в дистильованій воді вміст 1 флакона з Селективною добавкою для лістерій (PALCAM) (FD061). Ретельно перемішати і розлити середовище в стерильні чашки Петрі. Готове середовище має червоне забарвлення, прозоре, із злегка опалесцуючою поверхнею.
Принцип і оцінка результату. Середовище є високо селективним через наявність в ньому хлориду літію, цефтазідіму, поліміксину і акрифлавіну. PALCAM агар - диференційно-діагностичне середовище. Використовуються 2 індикаторні системи: ескулінова і манітна.
Listeria monocytogenes гідролізує ескулін на ескулетин і глюкозу. Реагуючи з цитратом заліза, ескулетин утворює коричнево-чорний комплекс, що приводить до потемніння середовища навкруги колоній. Лістерії не ферментують маніт, тому зброджуючі маніт ентерококи і стафілококи формують кольорові колонії (від червоного до жовтого). Мікроаерофільні умови обмежують ріст аеробів, наприклад, представників родів Bacillus і Pseudomonas.
Введення до складу середовища яєчного жовтка (2,5%) сприяє відновленню пошкоджених клітин. Додавання середовища з кров'ю поверх PALCAM агару дозволяє диференціювати і підрахувати кількість гемолітичних лістерій.
Залежно від типу аналізованого зразка перед висівом на PALCAM агар повинне бути проведено збагачення в різних бульйонах для селективного збагачення.
Основа Оксфордського середовища для лістерій -
Listeria Oxford Medium Base (M1145)
Рекомендовано для виділення Listeria monocytogenes з клінічного матеріалу і зразків харчових продуктів.
| Склад: | грам/куб. дм |
| Пептон спеціальний Літію хлорид Крохмаль кукурудзяний Ескулін Заліза амонійного цитрат Агар-агар Кінцеве значення pH (при 25 град. С) 7,0 +- 0,2 | 23,00 15,00 1,00 1,00 0,50 10,00 |
Приготування. Розмішати 27,75 г порошку в 500 куб. см дистильованої води. Прокип'ятити до повного розчинення середовища. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Охолодити до 50 град. С і асептично додати розчинений в 5 куб. см 50%-го етанолу вміст 1 флакона з селективною добавкою для виділення лістерій (FD172). Ретельно перемішати і розлити середовище в стерильні чашки Петрі. Готове середовище має темно-бурштинове забарвлення з блакитним відблиском.
Принцип і оцінка результату. Хлорид літію і антибіотики пригнічують ріст грамнегативної мікрофлори і більшості грампозитивних мікроорганізмів (окремі штами Staphylococcus утворюють ескулін-негативні колонії). Listeria monocytogenes гідролізує ескулін на ескулетин і глюкозу. Реагуючи з цитратом заліза, ескулетин утворює коричнево-чорний комплекс, що приводить до потемніння середовища навкруги колоній.
Методика виділення лістерій залежить від досліджуваних зразків. Для всіх зразків рекомендується селективне і холодове збагачення.
Для зразків харчових продуктів і матеріалу з об'єктів довкілля звичайно використовують селективне збагачення.
Селективний агар для лістерій (двокомпонентне середовище) -
Listeria Selective Agar (M567)
Середовище запропоновано для культивування і виділення видів Listeria з клінічного і іншого матеріалу
Приготування. Розмішати 39,0 г порошку частини А і 37,5 г порошку частини В в 1000 куб. см дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Готове середовище має жовте забарвлення, прозоре або злегка опалесцує.
Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну і пептичний перевар тваринної тканини є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій. Тіамін (вітамін групи В) стимулює ріст лістерій. Роданід і налідиксова кислота пригнічують ріст грамнегативних бактерій. Комбінація селективних речовин і акридинових фарбників пригнічує ріст ентерококів. Контаміновані зразки засівають в Бульйон збагачення для лістерій безпосередньо або проводять холодове збагачення в Триптозному бульйоні (M179), після чого культури відсівають на Селективний агар для лістерій. Гемоліз можна перевірити шляхом висіву на Кров'яний агар (M073).
Основа агару МакБрайда для лістерій/
Основа агару МакБрайда для лістерій модифікована -
McBride Listeria Agar Base/
Modified McBride Listeria Agar Base (M386/M891)
Середовище використовують для селективного виділення і культивування Listeria monocytogenes з клінічного матеріалу, від персоналу харчових об'єктів і ін.
Приготування. Розмішати 46,0 г порошку в 1000 куб. см дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Охолодити до температури нижче 50 град. С і перед застиганням асептично додати в середовище M386 стерильну дефібриновану кров (до кінцевої концентрації 5% об/об) і в обидва середовища розчинений в 10 куб. см 0,2 N NaOH вміст 1 флакона з добавкою МакБрайда для лістерій (FD171). Ретельно перемішати і розлити в стерильні чашки Петрі. Середовище має світло-бурштинове забарвлення, прозоре або має легку опалесценцію.
Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну, триптоза, м'ясний екстракт, пептичний перевар тваринної тканини, м'ясний екстракт служать джерелом вуглецю, азоту, мінеральних речовин, вітамінів В, мікроелементів і інших важливих чинників для росту лістерій. Фенілетилалкоголь вибірково пригнічує синтез ДНК, має бактеріостатичну дію на грамнегативні бактерії. Гліцин пригнічує ріст деяких бактерій, включаючи Escherichia coli і Enterococcus faecalis. Хлорид літію також володіє антимікробною активністю.
Визначення Listeria monocytogenes істотно поліпшується при використанні одно- або двохетапного збагачення матеріалу на рідкому середовищі. Відповідно до одноетапного методу, інфікований матеріал засівають безпосередньо на Збагачувальний бульйон для лістерій. За двохетапним методом спочатку матеріал засівають в Триптозний бульйон (M177) і інкубують в холодильнику при 4 град. С протягом декількох тижнів для холодового збагачення (лістерії можуть розмножуватися при низьких температурах). Потім інокулюють Збагачувальний бульйон для лістерій і, далі, роблять висів на селективний агар, наприклад, модифікований агар МакБрайда. Підозрілі на лістерії колонії відбирають при відбитому (45 град.) освітленні. Колонії лістерій щільні білі або веселково-білі, мають вид битого скла. Дрібні колонії мають блакитний відтінок. Колонії інших мікроорганізмів жовто-оранжеві. Агар МакБрайда можна використовувати як основне середовище (з додаванням крові або без неї).
Основа селективного агару LPM для лістерій -
LPM Agar Base (M1228)
Агар LPM (з літієм, фенілетанолом і моксалактамом) рекомендують для виділення і культивування Listeria monocytogenes з молочних і інших харчових продуктів.
Приготування. Розмішати 50,5 г порошку в 1000 куб. см дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 12 хв. Охолодити до 50 град. С і асептично додати добавку FD151. Ретельно перемішати і розлити в чашки Петрі. Готове середовище має жовте забарвлення, прозоре або з легкою опалесценцією.
Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну, м'ясний екстракт і пептичний перевар тваринної тканини є джерелом необхідних поживних речовин для росту. Гліциновий ангідрид, хлорид літію і фенілетанол пригнічують ріст грампозитивних коків і грамнегативних паличок. Моксалактам пригнічує ріст грампозитивних і грамнегативних бактерій, включаючи стафілококи, протеї і псевдомонади. При косому освітленні колонії Listeria monocytogenes виглядають веселковими блакитно-зеленими.
Нітратний агар/Нітратний бульйон -
Nitrate Agar/Broth (M072/M439)
Ці середовища рекомендують для визначення нітратредуктази у бактерій.
| Склад: | M072 грам/куб. дм | M439 грам/куб. дм |
| Пептичний перевар тваринної тканини М'ясний екстракт Калію нітрат Агар-агар Кінцеве значення pH (при 25 град. С) | 5,00 3,00 1,00 12,00 6,8 +- 0,2 | 5,00 3,00 1,00 - 7,0 +- 0,2 |
Приготування. Розмішати 21,0 г порошку M072 або 9,0 г порошку M439 в 1000 куб. см дистильованої води. Прокип'ятити для повного розчинення частинок. Розлити в пробірки. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Охолодити пробірки з середовищем в нахиленому стані. Готове середовище має світло-бурштиновий колір, прозоре або з легкою опалесценцією.
Принцип і оцінка результату. Здатність відновлювати нітрат є варіабельною ознакою і може використовуватися для диференціації і ідентифікації бактерій, зокрема представників родини ентеробактерій. Неферментуючі бактерії і ряд інших грамнегативних паличок варіюють за здібністю до редукції нітратів. Деякі з них здатні до денітрифікації з відновленням нітрату до газоподібного азоту. Утворення азоту з нітрату є важливим диференціальним тестом для ферментуючих глюкозу грамнегативних бактерій. Відновлення нітрату звичайно відбувається в анаеробних умовах, коли мікроорганізми "відщеплюють" кисень з нітрату. Представники Enterobacteriaceae, зазвичай, відновлюють нітрат до нітриту, який реагує з сульфаніловою кислотою і N,N-диметил-1-нафтиламіном, внаслідок чого розвивається червоне забарвлення (реакція Гріса). Якщо мікроорганізм активно редукує нітрат, тест треба проводити раніше, поки утворений нітрит повністю не перейшов в газоподібний азот.
Приготування реактивів для нітратного тесту:
1. Сульфанілова кислота: розчинити 8,0 г сульфанілової кислоти в 1 куб. дм 5N оцтової кислоти.
2. Альфа-Нафтиламіновий реактив: розчинити 5,0 г альфа-нафтиламіну в 1 куб. дм 5N оцтової кислоти.
УВАГА: реактиви токсичні, вимагають обережного обігу; уникати піпетування ротом, утворення аерозолів, попадання реактивів на шкіру.
Проведення тесту: Внести декілька крапель кожного реактиву в пробірку з досліджуваною культурою. На відновлення нітрату указує поява червоного або рожевого кольору середовища. Як негативний контроль ставлять тест з незасіяним середовищем. За відсутності почервоніння середовища, в пробірку додають щіпку порошку цинку, щоб переконатися у присутності нітрату в середовищі. Цинк відновлює нітрат, що супроводжується появою червоного забарвлення (у присутності тест-реактиву). Слід мати на увазі, що внесення дуже великої кількості цинку може привести до хибнонегативної реакції. Нітратний тест не є вирішальним для ідентифікації. Остаточну ідентифікацію проводять з урахуванням морфологічних ознак, фарбування за Грамом, біохімічних і серологічних характеристик мікроорганізму.
Бульйон для визначення цукролітичної активності лістерій -
Carbogydrate Consumption Broth (M1264)
Рекомендується для культивування і диференціації різних видів лістерій.
| Склад: | грам/куб. дм |
| Протеозопептон Натрію хлорид М'ясний екстракт Бромкрезоловий пурпуровий Кінцеве значення pH (при 25 град. С) 6,8 +- 0,2 | 10,00 5,00 1,00 0,10 |
Приготування. Розмішати 16,1 г порошку в 990 куб. см дистильованої води. Нагрівати, при необхідності, до повного розчинення компонентів середовища. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Асептично додати 10 куб. см стерильного розчину відповідного вуглеводу до кінцевої концентрації 0,5%. Добре перемішати і розлити у пробірки. Готове середовище має пурпуровий колір, прозоре, не має преципітату.
Принцип і оцінка результату. Бульйон для визначення цукролітичної активності використовується для культивування і диференціації лістерій різних видів. Відповідно до рекомендацій FDA і Комітету ISO, він має низьку концентрацію бромкрезолового пурпурного. Диференціація лістерій заснована на здатності ферментувати глюкозу, дульцит, рамнозу, рафінозу і саліцин.
Пептон і м'ясний екстракт є джерелами вуглецю і азоту, включаючи незамінні амінокислоти, вітаміни і мікроелементи, необхідні для метаболізму бактерій. Бромкрезоловий пурпуровий служить індикатором кислотності середовища і при її закисленні жовтіє.
Основа бульйону з бромкрезоловим пурпурним для лістерій -
Purple Broth Base (M284D)
Рекомендовано Комітетом ISO для вивчення ферментації цукрів чистими культурами Listeria.
| Склад: | грам/куб. дм |
| Протеозопептон Яловичий екстракт Натрію хлорид Бромкрезоловий пурпуровий Кінцеве значення pH (при 25 град. С) 6,8 +- 0,2 | 10,00 1,00 5,00 0,02 |
Приготування. Розмішати 16 г порошку в 1000 куб. см дистильованої води. Додати 5-10 г певного вуглеводу і стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв.
Можливий альтернативний спосіб приготування середовища: до 900 куб. см основи бульйону додають 100 куб. см 5-10% розчину вуглеводу.
При стерилізації вуглеводів автоклавуванням слід дотримуватися обережності, щоб не допустити гідролізу вуглеводів. Готове середовище має пурпурове забарвлення.
Принцип і оцінка результату. Індикатором ферментації вуглеводів служить бромкрезоловий пурпуровий, який при закисленні середовища забарвлює його в жовтий колір. Утворення газу констатують за появою пухирців в поплавцях.
В бульйон засівають добову чисту культуру лістерій і інкубують протягом 24-72 годин (до 7 днів, якщо буде потрібно) при 35 град. С. Концентрація вуглеводів, що рекомендується - 1%.
Основа кров'яного агару -
Blood Agar Base (M073)
| Склад: | грам/куб. дм |
| Настій яловичого серця Триптоза Натрію хлорид Агар-агар Кінцеве значення pH (при 25 град. С) | 500,00 10,00 5,00 15,00 7,3 +- 0,2 |
Приготування. Розмішати 40,0 г порошку в 1000 куб. см дистильованої води. Прокип'ятити для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121 град. С) протягом 15 хв. Охолодити до 50 град. С і асептично внести до 5% стерильної дефібринованої крові. Ретельно перемішати і розлити середовище в чашки Петрі. Основа середовища має світло-бурштинове забарвлення, прозора або з легкою опалесценцією при затвердінні. Після додавання крові середовище повинне мати вишнево-червоний колір з легкою опалесценцією.
Принцип і оцінка результату. Це середовище з настоєм серця використовують як основу для приготування кров'яного агару для визначення гемолітичних реакцій. Основа високопоживна і може використовуватись без додавання крові як середовище загального призначення.
| Заступник Головного державного санітарного лікаря України | Л.М.Мухарська |