МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
Н А К А З
| 11.08.2006 N 559 |
Про затвердження методичних вказівок "Організація контролю і методи виявлення бактерій Listeria monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині"
Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення"
НАКАЗУЮ:
1. Затвердити рекомендовані Комітетом з питань гігієнічного регламентування Міністерства охорони здоров'я України методичні вказівки "Організація контролю і методи виявлення бактерій Listeria monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині" (далі - методичні вказівки), що додаються.
2. Департаменту державного санепіднагляду Міністерства охорони здоров'я України довести методичні вказівки до установ та закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств та інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.
3. Контроль за виконанням цього наказу покласти на Директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України Пономаренка А.М.
| Перший заступник Міністра, Головний державний санітарний лікар України | С.П.Бережнов |
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ МОЗ України
11.08.2006 N 559
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
"Організація контролю і методи виявлення бактерій Listeria monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині"
1. Загальні положення
1.1. Методичні вказівки "Організація контролю і методи виявлення бактерій Listeria monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині" (далі - методичні вказівки) розроблені на підставі законів України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення України", "Про захист населення від інфекційних хвороб" та постанови Кабінету Міністрів України від 22.06.99 N 1109 "Про затвердження Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні".
1.2. До переліку патогенних мікроорганізмів при контролі харчових продуктів та продовольчої сировини за показниками біологічної безпеки введений новий мікробіологічний показник "Listeria monocytogenes - не допускаються у 25 г продуктів масового призначення й у 50-100 г для продуктів дитячого і спеціалізованого харчування".
1.3. Методичні вказівки встановлюють основні принципи організації контролю і методику проведення лабораторних досліджень харчових продуктів і продовольчої сировини (далі - Продукції) з метою встановлення в певному об'ємі (масі) наявності або відсутності бактерій Listeria monocytogenes.
1.4. Методичні вказівки призначені для застосування в установах державної санітарно-епідеміологічної служби України при здійсненні контролю та нагляду за якістю та безпекою харчових продуктів і продовольчої сировини, в тому числі тих, що надходять за імпортом; проведенні робіт для потреб державної санітарно-епідеміологічної експертизи; бактеріологічній діагностиці захворювань з харчовим шляхом передачі та інших видів робіт, що передбачені чинним законодавством, а також для лабораторій, акредитованих у встановленому порядку на право проведення контролю за якістю та безпекою харчових продуктів і продовольчої сировини.
1.5. Методичні вказівки застосовуються при дослідженні харчових продуктів і продовольчої сировини у ході проведення протиепідемічних заходів при виникненні спалахів харчових отруєнь та гострих кишкових інфекцій, а також при здійсненні державного санітарно-епідеміологічного нагляду.
2. Коротка характеристика мікроорганізмів роду Listeria
До збудників лістеріозу належать два із шести відомих на сьогодні видів бактерій роду Listeria - L. monocytogenes (патогенна для людини і тварин) і L. ivanovii (патогенна для тварин, рідко - для людини).
Дев'яте видання "Визначник бактерій Берджі" відносить рід Listeria до 19 групи мікроорганізмів - грампозитивні неспороутворюючі палички правильної форми. Представники цього роду - короткі палички правильної форми, розміром 0,4-0,5 х 0,5-2 мкм із закругленими кінцями, іноді майже коки, одиничні або в коротких ланцюжках, рідше в довгих нитках. Грампозитивні, спор і капсул не утворюють, не кислотостійкі. Мікроорганізми роду Listeria, вирощені при 35-37 град. С, рухливі за рахунок перитрихіальних джгутиків, при 20-25 град. С ця здатність втрачається. Факультативні анаероби. Хемоорганотрофи, метаболізм бродильного типу; зброджують глюкозу з утворенням в основному L(+)-лактату. Каталазопозитивні, оксидазонегативні. Утворюють цитохроми. Можуть перетворюватися в L-форми і паразитувати внутрішньоклітинно, що обумовлює недостатню ефективність у ряді випадків антибактеріальної терапії, пояснює схильність до затяжного і хронічного перебігу, можливість латентної форми і бактеріоносійства.
Лістерії дуже стійкі в довкіллі, ростуть у широкому інтервалі температур (від 3 до 42 град. С), pH (від < 5,5 до 9,5), добре переносять низькі температури і здатні розмножуватися при температурі (4-6) град. С в ґрунті, воді, на рослинах, в органах трупів. У різних харчових продуктах (молоко, м'ясо тощо) розмножуються при температурі побутового холодильника.
У ґрунті, гної, воді, на рослинах вони залишаються життєздатними до 600 діб, на забруднених поверхнях приміщень сільськогосподарського призначення в літній період (9...22 град. С) лістерії зберігають життєздатність до 25 діб, а в зимовий період (-2-23 град. С) до 130 діб. У льоду вони здатні зберігатися від 5,5 міс. до 2,5 років.
При температурі 70 град. С гинуть через 20-30 хвилин, при 100 град. С - через 3-5 хвилин; інактивуються розчинами формаліну (0,5%-1%), фенолу (5%), хлорного вапна (100 мг активного хлору в 1 куб. дм).
3. Організація контролю продукції на Listeria monocytogenes
3.1. Лабораторний контроль за відсутністю Listeria monocytogenes у продукції, де нормується цей показник, проводиться:
- в порядку державного санітарно-епідеміологічного нагляду за якістю та безпекою продукції при її виробництві, зберігання, транспортуванні та реалізації, а також наданні послуг у сфері торгівлі і громадського харчування;
- при здійсненні державної санітарно-епідеміологічної експертизи з метою надання відповідних висновків, свідоцтв, дозволів та інших документів, що передбачені чинним законодавством;
- при здійсненні виробничого контролю за якістю та безпекою продукції;
- при проведенні протиепідемічних заходів, а також епідеміологічному розслідуванні захворювань.
3.2. Періодичний відбір зразків харчової продукції для дослідження її за показниками біологічної безпеки, в тому числі і на наявність Listeria monocytogenes, здійснюється відповідно до Положення про державну санітарно-епідеміологічну службу України, затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 19 серпня 2002 р. N 1218.
3.3. Порядок контролю і кратність досліджень встановлюються відповідно до нормативних документів, затверджених або погоджених у встановленому порядку Міністерством охорони здоров'я України, при цьому враховується специфіка виробництва, ступінь його епідемічного ризику, матеріально-технічне оснащення тощо.
Особливу увагу приділяють підприємствам, що виробляють продукти дитячого харчування, дитячим молочним кухням, харчоблокам дитячих лікувально-профілактичних закладів, стаціонарів для онкологічних, гематологічних хворих, будинків дитини, пологових будинків, будинків-інтернатів (пансіонатів) для громадян похилого віку, інвалідів та дітей тощо.
3.3.1. При проведенні державного санітарно-епідеміологічного нагляду мінімальна рекомендована періодичність вибіркового лабораторного контролю продукції - 1 раз у квартал; для дитячого і дієтичного харчування - 2 рази.
3.3.2. При здійсненні виробничого контролю організація і періодичність лабораторних досліджень продукції за показником Listeria monocytogenes встановлюються виробником і, при необхідності, узгоджуються з територіальними установами державної санітарно-епідеміологічної служби. При складанні графіка виробничого контролю продукції за показником Listeria monocytogenes рекомендовано визначати періодичність за п. 3.3.1.
3.4. Дослідження продукції за показником Listeria monocytogenes здійснюються лабораторіями державної санітарно-епідеміологічної служби або іншими лабораторіями, що мають дозвіл на роботу, оформлений згідно з вимогами державних санітарних правил ДСП N 9.9.5.064.2000 "Порядок видачі дозволів на роботу із мікроорганізмами I-IV груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК" та атестовані/акредитовані МОЗ України у встановленому порядку.
3.5. Дослідженню за показником "відсутність Listeria monocytogenes в 25 г продукції (у 50-100 г для продуктів дитячого і спеціалізованого харчування)" підлягають - харчові не консервовані продукти: м'ясо та птиця, м'ясопродукти та птахопродукти, молоко та молочні продукти, сири, риба, рибопродукти, нерибні об'єкти промислу та продукція з них, жирові продукти тваринного походження (за винятком жирів топлених), холодні готові страви, що виробляються на об'єктах громадського харчування, торгівлі, в кулінарних цехах тощо (салати, супи, інші продукти та страви з сирих овочів).
3.6. У харчових продуктах, призначених для безпосереднього вживання в їжу, для яких відсутні мікробіологічні нормативи або дані про можливість виділення Listeria monocytogenes, контроль Listeria monocytogenes не проводиться, однак у випадку захворювань людей і/або порушень щодо забезпечення якості і безпеки харчових продуктів зразки таких продуктів повинні бути направлені на лабораторне дослідження.
4. Організація лабораторних досліджень на Listeria monocytogenes
Допускається організація лабораторних досліджень шляхом їх поетапного виконання в лабораторіях установ державної санітарно-епідеміологічної служби різних рівнів. При відсутності можливості ідентифікації виділених культур на місці їх передають у лабораторії вищого рівня державної санітарно-епідеміологічної служби, що мають відповідну матеріально-технічну базу і кваліфікований персонал, для видачі остаточного результату.
При передачі культур додержуються вимог "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", затвердженого Головним державним санітарним лікарем СРСР 18.05.79.
5. Сутність методу
Метод виявлення L. monocytogenes, гармонізований з Міжнародним стандартом ISO 11290-1:1996, передбачає визначення наявності або відсутності L. monocytogenes у нормованій масі продукту відповідно до затверджених нормативів, виражених в альтернативній формі і заснованими на існуючій системі відбору зразків і оцінки результатів аналізу.
Метод виявлення бактерій Listeria monocytogenes складається з наступних етапів: посів певної кількості продукту в рідкі селективні середовища, інкубація посівів, виявлення в них бактерій, здатних рости й утворювати типові колонії на щільних диференційно-діагностичних середовищах. Належність виділених культур до Listeria monocytogenes визначається за біохімічними, морфологічними та іншими властивостями. Допускається виявлення бактерій Listeria monocytogenes за допомогою автоматичного імуноаналізатора типу "miniVIDAS" у якості експрес-методу.
При проведенні досліджень харчових продуктів на
наявність/відсутність L. monocytogenes застосовуються спеціальні
селективні і диференційно-діагностичні середовища. Селективність
середовищ стосовно супутньої мікрофлори забезпечується включенням
до їх складу хлориду літію, акрифлавіну, циклогексаміду,
налідиксової кислоти, поліміксину або інших антибіотиків. Внесення
ескуліну і цитрату амонію заліза дозволяє підтверджувати наявність
лістерій за почорнінням середовища за рахунок гідролізу ескуліну в
+
присутності іонів Fe .
Підтверджуючі тести родової і видової належності включають фарбування за Грамом, визначення рухливості виділених на щільних середовищах типових за фізіологічними та морфологічними ознаками культур, їх здатності відновлювати нітрати до нітритів, зброджувати рамнозу, ксилозу і маніт, гідролізувати лецитин на середовищі з яєчним жовтком, а також визначення наявності бета-гемолізу на кров'яному агарі і диференціацію L. monocytogenes від інших гемолізуючих лістерій у САМР-тесті.
6. Апаратура, матеріали, лабораторний посуд, реактиви, поживні середовища
6.1. Апаратура та інструментарій
Баня водяна з підігрівом, в якій підтримується температура (47 +-2) град. С
Бактеріологічні петлі платиново-іридієві, нікелево-хромові, або петлі одноразового користування діаметром 3 мм
Ваги лабораторні загального призначення, 2 і 4 класів точності, з найбільшою межею зважування 200 г
Газова або електрична плитка
Годинник механічний сигнальний (таймер)
Гомогенізатор перистальтичного типу "Стомахер" або інших найменувань
Імуноаналізатор автоматичний типу "miniVIDAS"
Мікроскоп біологічний з фазовим контрастом
Опромінювач бактерицидний ОБН-150 або інших видів
Пальники газові або спиртівки лабораторні
Пінцет медичний
pH-метр (іономір) з поділками шкали до 0,01 pH, за температури 25 град. С, погрішність вимірів +-0,1 од. pH
Калориметр типу "Денси-ла-метр"
Система для отримання очищеної води аналітичної якості, або дистилятор, що забезпечує якість дистильованої води відповідно до ГОСТ 6709-72
Скальпель хірургічний, 15 см
Стерилізатори парові медичні з максимальним робочим тиском 0,2 МПа
Термостати, що дозволяють підтримувати робочу температуру в межах (25 +- 1) град. С, (30 +- 1) та (37 +- 1) град. С
Холодильник лабораторний або побутовий електричний
Шафа сушильна стерилізаційна, що дозволяє підтримувати температуру (160 +- 5) град. С
Штативи для пробірок
Шпателі металеві або пластикові
6.2. Лабораторний посуд та матеріали
Вата медична гігроскопічна
Каструлі емальовані
Колби плоскодонні конічні чи круглі різної місткості
Ковпачки силіконові або металеві
Лійки скляні
Марля медична
Маркери по склу
Папір фільтрувальний лабораторний
Піпетки місткістю 1, 2, 5 і 10 куб. см
Полістиролові планшети U-подібні
Пробірки Уленгута (поплавці)
Пробірки
Пробки силіконові, гумові або ін., що витримують стерилізацію
Скельця предметні та покривні для мікропрепаратів
Термометр ртутний з діапазоном виміру від 0 до 100 град. С (ціна поділки шкали 1 град. С)
Циліндри місткістю 100, 250, 500 куб. см або мензурки місткістю 250, 500, 1000 куб. см
Чашки Петрі скляні або пластикові
6.3. Реактиви та поживні середовища
---------------
* Каталожний номер продукції фірми HiMedia.
Допускається використання інших комерційних поживних середовищ (ПС) та діагностичних препаратів аналогічного призначення для проведення досліджень відповідно до цього документа, зареєстрованих та дозволених до застосування в Україні. При їх застосуванні варто керуватися рекомендаціями виробника.
7. Підготовка до дослідження
7.1. Приготування розчинів та реактивів
7.2. Приготування поживних середовищ
Загальні вимоги до виготовлення ПС викладені в ГОСТ 10444.1-84.
З метою підвищення достовірності та якості досліджень, перевагу слід віддавати ПС та діагностичним препаратам промислового виробництва, зареєстрованих та рекомендованих до використання в Україні.
ПС промислового виготовлення, названі в п. 6.3.2, готують відповідно до прописів на етикетці або відповідно до рекомендацій фірми виробника.
Допускається застосування ПС, приготовлених безпосередньо в лабораторії з окремих компонентів за п.п. 7.2.1-7.2.10.
Готові середовища розливають у стерильний посуд і зберігають у захищених від світла умовах при температурі (2-8) град. С.
7.2.1. Поживний агар (МПА) з 1% глюкози і поживний бульйон (МПБ) з 1% глюкози готують відповідно до ГОСТ 10444.1.
7.2.2. Триптон-соєвий бульйон із дріжджовим екстрактом (TSYEB)/Триптон-соєвий агар із дріжджовим екстрактом (TS YEA).
Склад (г/куб. дм): гідролізат казеїну - 17,0; папаїновий перевар соєвого борошна - 3,0; натрій хлористий - 5,0; калію гідрофосфат - 2,5; глюкоза - 2,5; дріжджовий екстракт - 6,0; агар-агар (для TSYEA) - 15,0.
Компоненти розчиняють у 1 куб. дм дистильованої води, ретельно перемішують, установлюють pH (7,3 +- 0,2) і автоклавують при (121 +- 1) град. С протягом 15 хвилин.
7.2.3. Середовища селективного збагачення типу бульйону Фрейзера.
Приготування основи середовища (г/куб. дм): ферментативний гідролізат казеїну - 5,0; пептон - 5,0; м'ясний екстракт - 5,0; дріжджовий екстракт - 5,0; натрію хлорид - 20,0; калію дигідрофосфат - 1,35; натрію гідрофосфат - 12,0; ескулін - 1,0; літій хлористий - 3,0, заліза амонійного цитрат - 0,25 розчиняють у 1 куб. дм дистильованої води, ретельно перемішують, встановлюють pH (7,2 +- 0,2) і автоклавують при (121 +- 1) град. С 15 хвилин.
Перед застосуванням до основи середовища додають асептично розчин селективних компонентів наступного складу:
| Середовище типу бульйону Фрейзера | ||
| первинного збагачення * | вторинного збагачення | |
| налідиксова кислота | - 10 мг | - 20 мг |
| акрифлавіну гідрохлорид | - 12,5 мг | - 25 мг |
---------------
* Допускається при приготуванні середовища типу бульйону Фрезера первинного збагачення готувати основу середовища без додавання ескуліну та цитрату заліза амонійного.
Спосіб приготування: зазначені компоненти розчинити в 10 куб. см стерильного 0,2 N гідроксиду натрію.
7.2.4. PALCAM-агар (поліміксин-акрифлавін-літію хлорид-цефтазидім-ескулін-манітол - агар) - селективне диференційно-діагностичне середовище для виділення лістерій.
Приготування основи середовища (г/куб. дм): пептон м'ясний ферментативний - 23,0; дріжджовий екстракт - 3,0; крохмаль - 1,0; натрію хлорид - 5,0; ескулін - 0,8; літію хлорид - 15,0; заліза амонію цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; маніт - 10,0; феноловий червоний - 0,08; агар - 15,0 розчиняють у 1 куб. дм дистильованої води, ретельно перемішують, установлюють pH (7,0 +- 0,2) і автоклавують при (121 +- 1) град. С 15 хв.
До стерильної розплавленої основи середовища додають асептично розчин селективних компонентів наступного складу: акрифлавін - 0,005; поліміксин "В" - 100 000 од.; цефтазидім - 0,02 у 10 куб. см стерильної дистильованої води.
Готове середовище розливають у стерильні чашки Петрі.
7.2.5. Селективне диференційно-діагностичне середовище для виділення лістерій типу Оксфордського агару.
Приготування основи середовища (г/куб. дм): пептон м'ясний ферментативний - 23,0; крохмаль кукурудзяний - 1,0; натрію хлорид - 15,0; ескулін - 1,0; літію хлорид - 15,0; заліза амонію цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; агар - 15,0 розчиняють у 1 куб. дм дистильованої води, ретельно перемішують, установлюють pH (7,0 +- 0,2) і автоклавують при (121 +- 1) град. С 15 хвилин.
До стерильної розплавленої основи середовища додають асептично розчин селективних компонентів наступного складу: акрифлавіну гідрохлорид - 0,005; циклогексамід - 0,4, колістину сульфат * - 0,02, цефатетан * - 0,002, фосфоміцин * - 0,01 мг у 10 куб. см 50% етанолу.
Готове середовище розливають у стерильні чашки Петрі.
---------------
* Допускається заміна комплексу перелічених антибіотиків на поліміксин у кількості 500 000 од. на 1 куб. дм.
4.2.6. Кров'яний агар. До розтопленого й охолодженого до 45-50 град. С поживного агару з 1% глюкози (п. 7.2.1) додають 5% об'єму дефібринованої крові тварин. Розливають по 15 куб. см у чашки Петрі діаметром 90 мм і підсушують при (37 +- 1) град. С.
Посів роблять у теплі чашки.
7.2.7. Поживний агар з еритроцитами барана. Дефібриновану або стабілізовану цитратом кров барана центрифугують в асептичних умовах 30 хв. при 900 об/хв. Надосадову рідину зливають. Осад суспендують у стерильному фізіологічному розчині до первісного об'єму, додають у кількості 5% об'єму до розтопленого й охолодженого до 45-50 град. С поживного агару (п. 7.2.1). Розливають у чашки Петрі діаметром 90 мм по 15 куб. см, підсушують при (37 +- 1) град. С. Чашки використовують для посіву теплими.
7.2.8. Середовище для визначення рухливості: 20 г гідролізату казеїну ферментативного, 6 г пептону м'ясного ферментативного і 5 г агару розчиняють у 1 куб. дм дистильованої води, установлюють pH (7,3 +- 0,2), розливають у пробірки по 5-7 куб. см і автоклавують при (121 +- 1) град. С 15 хвилин.
7.2.9. Середовища Гіса за ГОСТ 10444.1 з манітом, рамнозою, ксилозою. 10 г пептону ферментативного і 5 г натрію хлористого розчиняють у 1 куб. дм дистильованої води і додають 10 г відповідного вуглеводу. Встановлюють pH (7,1 +- 0,1), вносять 10 куб. см індикатора Андреде (можливе використання індикатора бромкрезолового пурпурного, "ВР" і ін.), розливають у пробірки і стерилізують при (112 +- 1) град. С 20 хвилин.
7.2.10. Середовище для визначення лецитиназної активності лістерій. До поживного агару (п. 7.2.1) перед стерилізацією додають активоване вугілля, розтерте до порошкоподібного стану, до концентрації 0,5% (вага/об'єм). Жовток курячого яйця змішують з 150 куб. см фізіологічного розчину і додають 5% цієї суміші за об'ємом до стерилізованого й охолодженого до 40-50 град. С поживного агару. Розливають у чашки Петрі по 20 куб. см і підсушують при (37 +- 1) град. С. Аналогічно готують середовище з жовтком, але без активованого вугілля.
8. Відбір і підготовка проб харчових продуктів для дослідження
8.1. Загальні положення по відбору і підготовці проб
Відбір і підготовку проб продукції здійснюють відповідно до ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", СаНПиН "Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов", затверджені заступником Головного державного санітарного лікаря СРСР 21.12.1988 р. N 42-123-4940-88, СанПиН "Нормативы и методы микробиологического контроля продуктов детского питания, изготовленных на молочных кухнях системы здравоохранения", затверджені заступником Головного державного санітарного лікаря СРСР 31.08.1987 г. N 42-123-4423-87, а також відповідно до діючих ГОСТ і НД на конкретні види продуктів.
Маса та об'єм проб, що відбираються, повинні бути достатніми для проведення дослідження і мінімум вдвічі перевищувати аналітичний зразок. З об'єднаної проби беруть наважку масою (25 +- 0,1) г (50-100 г - для продуктів дитячого, лікувального і спеціалізованого харчування).
Від продукції в споживчій тарі в дрібній фасовці проби відбирають у кількості однієї або декількох одиниць в залежності від маси або об'єму споживчої тари. Кількість їх повинна бути достатньою для проведення дослідження.
Від продукції в транспортній або споживчій тарі великих розмірів або не упакованій проби відбирають з різних місць з різної глибини, включаючи поверхню.
Для бактеріологічного дослідження проби відбирають до узяття проб на фізико-хімічні й органолептичні дослідження стерильним інструментом у стерильний посуд. При цьому від зразка відбирають кілька проб з різних місць, подрібнюють, перемішують і з них складають наважку необхідної маси.
Заморожені продукти попередньо розморожують до температури усередині продукту 0-(-1) град. С; продукти, що містять жири (вершкове масло, морозиво тощо) нагрівають до температури (40-45) град. С і перемішують.
Відібрані зразки перемішують і подрібнюють або доводять до однорідної консистенції за ГОСТ 26669, із подрібненої суспензії складають наважку необхідної маси.
При посівах висококислотних чи лужних (із pH < 6 чи > 7,5) рідких і твердих продуктів для запобігання зниження pH поживних середовищ, pH продукту перед посівом доводять до (7,0 +- 0,2).
8.2. Відбір і підготовка проб молока, молочних продуктів, сирів, морозива
Відбір і підготовку проб продуктів проводять відповідно ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа".
Кисломолочні продукти, сир, сирні вироби і пастоподібні продукти ретельно подрібнюють за допомогою гомогенізаторів і піддають нейтралізації, масло вершкове і морозиво розтоплюють до сметаноподібної консистенції.
8.3. Відбір і підготовка проб м'яса, м'ясних напівфабрикатів, м'яса птахів і птахопродуктів, ковбасних виробів і інших м'ясопродуктів
Відбір і підготовку проб м'яса, субпродуктів, м'ясних напівфабрикатів, ковбасних виробів і інших м'ясних продуктів проводять за ГОСТ 21237 "Мясо. Методы бактериологического анализа", ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов". Масу наважки відбирають відповідно до п. 9.1.
8.4. Відбір і підготовка проб плодоовочевої продукції
Відбір і підготовку до дослідження проб плодоовочевої продукції (крім проб поверхнево контамінованих і пюреподібних продуктів) проводять відповідно до ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26313 "Продукты переработки плодов і овощей. Правила приемки, методи отбора проб". Для дослідження поверхнево контамінованої продукції та швидкозамороженої продукції готують суспензію додаванням до наважки масою (100 +- 30) г, відібраної з трьох одиниць тари або фасовки, 0,1%-ного пептонно-сольового розчину в кількості, рівній масі наважки. При цьому 1 куб. см отриманої суспензії оцінюють як 1 г (куб. см) продукту.
Із подрібнених плодів, овочів, напівфабрикатів, пюреподібних і рідких продуктів відбирають окремо наважку масою по (100 +- 30) г із трьох одиниць тари або фасовки і готують об'єднану пробу масою відповідно до п. 9.1.
8.5. Відбір і підготовка проб риби, нерибних об'єктів промислу і продуктів, що з них вироблені
Відбір і підготовку проб проводять згідно з "Инструкцией по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских безпозвоночных", затверджена заступником Головного державного санітарного лікаря СРСР 22.02.91 N 5319-91.
Відбір проб свіжої, охолодженої і мороженої риби проводять від 2 зразків, м'язова тканина в яких складає не менш 100 г за ГОСТ 7631-85. З кожної проби стерильним інструментом вирізують спинні м'язи зі шкірою, перемішують і відважують 25 г, подрібнюють за допомогою гомогенізатору і гомогенізують у 225 куб. см середовища збагачення.
8.6. Відбір і підготовка проб продуктів дитячого, лікувального харчування і їх компонентів
Відбір і підготовку проб продуктів дитячого, лікувального харчування і їх компонентів проводять згідно СаНПиН "Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов", затверджені заступником Головного державного санітарного лікаря СРСР 21.12.1988 р. N 42-123-4940-88.
Відібрані проби продуктів перед дослідженням ретельно перемішують, кисломолочні продукти нейтралізують (на 10 куб. см/г досліджуваного продукту або його першого розведення для сухих кисломолочних продуктів, напою або закваски додають 1,0 куб. см стерильного розчину двовуглекислого натрію з масовою концентрацією 100 г/куб. см). Сир, сирні вироби і пастоподібні продукти ретельно подрібнюють і нейтралізують. Вершкове масло або молочний жир розплавляють при температурі 40-45 град. С і перемішують до одержання однорідної емульсії.
9. Порядок проведення дослідження
9.1. Підготовлену відповідно до п 8. наважку досліджуваного продукту (гомогенату, змиву з поверхні) у кількості 25 г (куб. см) вносять в одне із середовищ для первинного збагачення в кількості 225 куб. см (за п.п. 6.3.2.2, 7.2.3.). При необхідності дослідження інших мас продукту їх посів проводять у середовище також у співвідношенні 1:9 за об'ємом.
Посіви інкубують при (37 +- 1) град. С протягом (24 +- 2) годин. (При використанні комерційних поживних середовищ термін та температура інкубації згідно інструкції до застосування). При рості лістерій на середовищах попереднього збагачення, які містять ескулін і цитрат заліза амонійного, спостерігається почорніння середовища за рахунок гідролізу глікозиду ескуліну до глюкози і ескулетину. Ескулетин реагує з іонами заліза, утворює комплекс чорного або маслинового кольору. На інших середовищах почорніння не відзначається.
9.2. Після термостатування продукту в середовищі для первинного збагачення 0,1 куб. см суспензії пересівають у 10 куб. см одного з рідких середовищ для вторинного збагачення за п.п. 6.3.2.2, 7.2.3. Посіви інкубують в термостаті при температурі (37 +- 1) град. С протягом (48 +- 2) год. (При використанні комерційних поживних середовищ термін та температура інкубації згідно інструкції до застосування.) У середовищах з ескуліном відзначають почорніння як ознаку можливої присутності бактерій роду Listeria.
9.3. Із пробірок після термостатування, незалежно від наявності або відсутності ознак росту, і в т.ч. почорніння, роблять пересіви по 0,1 куб. см на поверхню двох чашок Петрі з однієї з агаризованих диференційно-діагностичних середовищ за п.п. 6.3.2.3, 7.2.4, 7.2.5. Посівний матеріал розтирають стерильним шпателем. Допускається проводити пересівання петлею штрихом. Чашки із середовищами попередньо підсушують.
Посіви інкубують при температурі (37 +- 1) град. С протягом 24-48годин. (При використанні комерційних поживних середовищ термін та температура інкубації згідно інструкції до застосування.) Чашки з PALCAM-агаром краще інкубувати мікроаеробних умовах.
9.4. Проведення дослідження без етапу вторинного збагачення. При посіві продуктів з низьким вихідним рівнем мікробної контамінації і при відсутності ознак росту в рідкому середовищі (помутніння, почорніння й ін.) допускається проводити пересів на чашки з агаризованими диференційно-діагностичними середовищами відразу після етапу первинного збагачення за п. 9.1.
9.5. При відсутності росту на чашках з диференційно-діагностичними середовищами типу Оксфордського агару (Oxford agar) і PALCAM-агару дослідження припиняють і дають висновок про відсутність L. monocytogenes у дослідженій пробі продукту.
9.6. При виявленні характерного росту на чашках відбирають 3-5 колоній для їх подальшого вивчення.
На середовищах типу PALCAM-агару через 24 год. інкубації лістерії формують дрібні, сірувато-зелені або маслиново-зелені колонії з чорним ореолом, діаметром 0,5-1,0 мм, іноді з чорним центром. (Чашки, що інкубувалися в мікроаеробних умовах, необхідно витримати на повітрі протягом 1 години для відновлення кольору середовища). Через 48 год. колонії діаметром 1,0-2,0 мм набувають зеленого забарвлення з заглибленими центрами, оточеними чорним ореолом. Кокова мікрофлора (бактерії родів Staphylococcus, Enterococcus) утворює кольорові колонії (від жовтого до червоного) за рахунок ферментації маніту.
На Оксфордському агарі лістерії, вирощені протягом 24 год., дрібні (1 мм), сіруваті, оточені чорним ореолом. Через 48 год. - більш темні, можливо зеленуватий відтінок, близько 2 мм у діаметрі, з чорним ореолом і заглибленим центром.
При появі суцільного росту лістерій роблять пересів бактеріологічною петлею з зон найбільшого почорніння середовища штрихами на 2-3 чашки Петрі із селективним диференційно-діагностичним ПС (Оксфордський або PALKAM-агар) для одержання ізольованих колоній. Посіви термостатують аналогічно п. 9.3.
9.7. Відібрані характерні колонії (не менше 5, а у випадку якщо на чашці виросло менше 5 колоній то всі), підозрілі на приналежність до Listeria monocytogenes, пересівають на середовища: МПА з 1% глюкози (п. 7.2.1), триптон-соєвий агар із дріжджовим екстрактом (TSYEA) за п. 6.3.2.1 або 7.2.2 для одержання ізольованих колоній, які піддають подальшому вивченню.
Посіви інкубують в термостаті при температурі 30 град. С протягом 24 годин.
9.8. Ідентифікація виділених культур. Для визначення належності виділених мікроорганізмів до роду Listeria отримані чисті культури фарбують за Грамом, мікроскопують, визначають наявність у них каталази, рухливості при двох температурах інкубації - 25 град. С і 37 град. С, здатності до ферментації маніту і ставлять реакцію редукції нітратів.
9.8.1. Фарбування за Грамом. Бактерії роду Listeria є грампозитивними тонкими короткими паличками, спор не утворюють.
9.8.2. Каталазну активність культур визначають відповідно до ГОСТ 30425 за здатністю каталази розкладати перекис водню з виділенням пухирців газу. Реакцію ставлять з охолодженою до кімнатної температури добовою культурою на стерильному предметному склі. Ізольовану колонію, узяту з поверхні ПС скляною паличкою або платиновою петлею розтирають на склі і піпеткою наносять краплю 3% розчину перекису водню. При позитивній реакції через 30-60 сек. на склі з'являються пухирці газу. Паралельно ставлять контрольну пробу.
Бактерії роду Listeria є каталазопозитивними.
9.8.3. Рухливість культур визначають посівом уколом у середовища за п. 7.2.8 і інкубації при двох температурах - (25 +- 1) град. С і (37 +- 1) град. С протягом 48-72 год.
Бактерії роду Listeria рухливі при 25 град. С (утворюють характерний, схожий на парасольку, ріст навколо лінії уколу) і нерухомі або слабко рухомі при (35-37) град. С.
9.8.4. Для визначення здатності зброджувати вуглеводи, культури пересівають на середовища Гіса за п.п. 6.3.2.3 або 7.2.9. Посіви інкубують 7 діб при (37 +- 1) град. С, наявність ферментативної активності у відношенні вуглеводів виявляють за зміною кольору середовищ за рахунок утворення кислоти.
Більшість бактерій роду Listeria не утилізують маніт (за винятком L. grayi та L. grayi subsp. murrayi).
9.8.5. Постановку реакції нітратредукції проводять за ГОСТ 10444.8-88. Бактерії роду Listeria не відновлюють нітрати до нітритів (за винятком L. grayi і L. grayi subsp. murrayi).
Виявлення в посівах грампозитивних коротких тонких паличок, каталазопозитивних, що не відновлюють нітрати до нітритів, не утилізують маніт, рухливі при 25 град. С и нерухомі при 37 град. С, вказує на належність виділених культур з до роду Listeria.
Для підтвердження належності виділених лістерій до виду L. monocytogenes визначають здатність до ферментації рамнози, ксилози, наявність лецитиназної і бета-гемолітичної активності і проводять постановку CAMP-тесту. Диференційні ознаки видів роду Listeria наведені в табл. 1.
Для видової диференціації виділених культур лістерій рекомендується використовувати біохімічні тест-системи API Listeria фірми "BioMerieux". При їх застосуванні варто керуватися рекомендаціями виробника.
Таблиця 1
9.8.6. Здатність ферментувати рамнозу і ксилозу - визначають аналогічно п. 9.8.4. Бактерії L. monocytogenes утилізують рамнозу з утворенням кислоти і не утилізують ксилозу.
9.8.7. бета-гемолітичну активність досліджуваних культур визначають за утворенням зон просвітління за рахунок розчинення еритроцитів навколо колоній, що виросли на поверхні кров'яного агару з дефібринованою кров'ю барана або кроля (п.п. 6.3.2.3, 7.2.6). Посіви інкубують при (37 +- 1) град. С протягом 24 год.
Listeria monocytogenes володіють гемолітичною активністю (утворюють вузькі чіткі зони просвітління навколо колоній).
9.8.8. Постановку САМР-тесту проводять для диференціації L. monocytogenes від інших видів лістерій, що мають бета-гемолітичну активність.
1 варіант. Для проведення тесту 2-3-добові культури гемолітичних штамів S. aureus і R. equi засівають на кров'яний агар з еритроцитами барана двома паралельними штрихами на відстані 5,0-5,5 см, як показано на мал. 1.
Між вертикальними штрихами S. aureus і R. equi засівають паралельними штрихами досліджувані культури лістерій на відстані один від одного не менше 1 см і від вертикальних штрихів - 0,5 см. У якості контролю використовують тест-штами L. monocytogenes і L. ivanovii. Інкубують 18-24 години при (37 +- 1) град. С. Відзначають форму і розміри зон гемолізу біля вертикальних штрихів росту стафілокока і родокока.
Listeria monocytogenes дають невелике розширення зони гемолізу (до 2 мм) біля штриха S. aureus (позитивний САМР-тест) і має відсутність змін зони гемолізу поруч зі штрихом R. equi (негативний САМР-тест).
Listeria ivanovii дають широку (5-10 мм) смугу "стрілкоподібного" бета-гемолізу біля штаму R. equi.
За відсутності тест-штаму R. equi, як виключення, дозволяється постановка САМР-тесту в наступній модифікації.
2-3-добову культуру гемолітичного штаму S. aureus засівають на кров'яний агар з еритроцитами барана вертикальним штрихом. Перпендикулярними до нього штрихами засівають досліджувані культури лістерій на відстані один від одного не менше 1 см і від вертикального штриха - 0,5 см. У якості контролю використовують тест-штами L. monocytogenes і L. ivanovii. Інкубують 24 години при (37 +- 1) град. С. Відзначають форму і розміри зон гемолізу біля вертикального штриха росту стафілокока.
L. monocytogenes дають розширення зони гемолізу біля штриха S. aureus (позитивний САМР-тест), L. ivanovii не дає такого розширення (негативний САМР-тест)
9.8.9. Для визначення лецитиназної активності дно двох чашок Петрі з поживним агаром з глюкозою, що містять: 1 чашка - жовток курячого яйця й активоване вугілля, 2 чашка - жовток курячого яйця без активованого вугілля - поділяють на кілька секторів або квадратів, досліджувані культури і контрольні штами лістерій пересівають паралельно короткими штрихами на відповідні сектори чашок, з вугіллям і без нього. Інкубують 48 год. при (37+-1) град. С. Чашки переглядають у проходячому світлі і визначають наявність активності в присутності й без активованого вугілля, порівнюючи з контрольними висівами музейних штамів. L. ivanovii дає щільну зону помутніння шириною 3-6 мм незалежно від наявності активованого вугілля. L. monocytogenes дає аналогічну зону помутніння в присутності активованого вугілля і не дає її на середовищі без вугілля. Інші види лістерій не дають зони помутніння.