Про організацію лабораторної діагностики сифілісу в Україні

Розливання інгредієнтів під час постановки реакції проводять у боксі, попередньо опроміненим бактерицидною кварцовою лампою протягом 45-60 хвилин.

Оцінку одержаних результатів проводять через 18-20 годин. Пробірки виймають з термостату і мікроанаеростату і розставляють у штативі попарно (дослідна і контрольна). З кожної пари пробірок пастерівською піпеткою наносять краплі на про нумероване відповідно дослідним пробіркам предметне скло, накривають накривним склом 20 х 20 мм і досліджують у темному полі мікроскопа при збільшенні: об'єктив 40х, окуляр 10х. Переглядають кілька полів зору в різних ділянках препарату, підраховуючи у кожній число рухливих і нерухливих блідих трепонем. Підрахунок подають з препарату з контрольної, а потім з дослідної пробірок. У препараті підраховують не менше 25 трепонем і відмічають скільки з них рухливих і скільки нерухливих.

Якщо у дослідному препараті міститься 13-19 рухливих блідих трепонем, то для одержання більш достовірного результату необхідно полічити не 25, а 50 мікроорганізмів, також відмічено серед них число рухливих і нерухливих.

При підрахунку 50 блідих трепонем одержане число рухливих мікроорганізмів ділять на 2.

Якщо в контрольному препараті міститься менш 17 рухливих трепонем з 25 полічених, то такий дослід не придатний, і дослідження даної сироватки слід повторити. У контрольних пробірках з інактивованим комплементом відсутність рухливих трепонем пояснюється токсичністю досліджуваної сироватки крові частіше за все внаслідок домішок медикаментів, іноді бактеріальним забрудненням і ін.

При визначенні рухливості блідих трепонем слід звертати увагу на інтенсивність рухів, здійснюваних блідими трепонемами. У блідої трепонеми не завжди можна спостерігати згинальні і контрактильні рухи, іноді лише обертальні. Слід також уміти відрізняти активні рухи трепонем від руху з струмом рідини.

Розрахунок проценту специфічної іммобілізації блідих трепонем проводять за такою формулою:

В - число рухливих блідих трепонем у дослідній пробірці,

Х - процент іммобілізації.

У практичній роботі процент іммобілізації визначають заздалегідь складеній таблиці з застосуванням вищенаведеної формули. Реакція іммобілізації вважається негативною, коли процент іммобілізації коливається у межах 0-20, сумнівною від 21 до 30, слабопозитивною - від 31 до 50 і позитивною - вище 50. Сироватки з сумнівними і слабопозитивними реакціями потребують у повторному дослідженні для одержання більш достовірних результатів. Доцільно також повторювати Дослідження всіх сироваток, які дали повне розходження результатів з результатами стандартних серологічних реакцій. Ці сироватки заслуговують особливої уваги, оскільки в цих випадках результати реакції іммобілізації блідих трепонем дають можливість судити про наявність або відсутність сифілісу у обстежуваної особи.

ПРИМІТКА: Відповідь знаходять у точці перетину горизонтального рядка з вертикальним стовпчиком, наприклад: 23 рухливі трепонеми у контрольній пробірці і 10 рухливих трепонем у дослідній пробірці відповідають 54% іммобілізації блідих трепонем.

Встановлення залишкового комплементу необхідно для визначення чи достатня була кількість комплементу у дослідних пробірках, чи не була рухливість блідих трепонем обумовлена відсутністю комплементу, внаслідок чого іммобілізації не могли проявити свою активність.

Після реєстрації результатів реакції іммобілізації блідих трепонем у вмісті пробірок визначають залишковий комплемент, додаванням до кожної пробірки гемолітичної системи в об'ємі 0,1 мл.

ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК

1. Токсичність досліджуваної сироватки.

2. Бактеріальне забруднення досліджуваної сироватки або комплементу.

3. Недостатня кількість комплементу у досліді.

4. Порушення герметичності мікроанаеростату, проникнення до нього кисню атмосферного повітря.

5. Підвищення або зниження температури у термостаті протягом реакції.

6. Кислотність або лужність лабораторного посуду, яким користуються під час реакції.

7. Використання медикаментів, що бактерицидно впливають на рухливість блідих трепонем.

1. Диференціювання позитивних результатів стандартних серологічних реакцій на сифіліс. Стандартні серологічні реакції дають деяку кількість позитивних результатів при захворюваннях, які не мають відношення до сифілісу. Це так звані хибнопозитивні і неспецифічні позитивні результати. Наявність позитивних результатів стандартних серологічних реакцій у осіб без клінічних і анамнестичних ознак сифілісу є головним показником до постановки реакції іммобілізації блідих трепонем. У осіб, вільних від сифілитичної інфекції, результати реакції іммобілізації блідих трепонем будуть негативними, тобто у сироватці таких осіб бліді трепонеми залишаються рухливими. Реакція іммобілізації блідих трепонем є цінним методом для розпізнавання хибнопозитивних реакцій, особливо у вагітних і соматичних хворих. Діагноз прихованого і невідомого сифілісу у таких осіб вимагає обов'язкового підтвердження результатами реакції іммобілізації блідих трепонем і реакції імунофлуоресценції (РІФ). Реакцію іммобілізації блідих трепонем застосовують також для підтвердження діагнозу пізніх форм сифілітичної інфекції.

Відомо, що іммобілізини з'являються у сироватці пізніше антиліпідних і флуоресціюючих антитіл. Тому для ранньої діагностики первинного сифілісу реакція іммобілізації блідих трепонем непридатна. Коли є підозра на первинний сифіліс, найбільш діагностичне цінною є реакція імунофлуоресценції.

ПРИНЦИП. Реакція основана на феномені втрати рухливості блідими трепонемами у присутності іммобілізинів досліджуваної сироватки і комплементу. Анаеробні умови досліду створюються переміщенням реагуючої суміші в меланжер (лейкоцетарний змішувач), обидва кінці якого вкриті гумовим кільцем. Меланжерна методика реакції дозволяє обходитись без складного обладнання та апаратури. При порівняльному вивченні на великому клінічному матеріалі одержано результати, які не поступаються класичній анаеростатній методиці.

Постановці основного досліду передбачає підготовча робота, яка складається з таких етапів:

1. Одержання і обробка досліджувані сироватки. Проводиться так само, як і для мікроанаеростатної методики.

2. Приготування середовища для блідих трепонем. Меланжерна методика реакції виконується з тим само середовищем що й мікроанеростатна.

3. Комплемент. Готується і зберігається так само, як і при мікроанаеростатній методиці.

4. Антиген. Застосовується той самий штам блідої трепонеми і методика його приготування така ж, як і для мікроанаеростатної методики.

5. Приготування суміші антигена з комплементом "коктейлю". Попередньо в двох стерильних флаконах або колбах з'єднуються комплемент з антигеном, взятих у рівних об'ємах. Кількість комплементу і антигена залежить від загальної кількості досліджуваних сироваток. На одну сироватку витрачають 0,15 мл комплементу і стільки і антигену. Антиген розливають рівними частинами в два стерильні флакони і додають до одного флакону активний комплемент, а до другого - інактивовану сироватку морської свинки.

6. Гемолітичну сироватку розводять так само, як для мікроанаеростатного методу.

7. Приготування солевого розчину. Розчиняють 9.0 г хлористого натрію хімічно чистого в 1-ому літрі дистильованої води. Розчин фільтрують через паперовий Фільтр і стерилізують автоклавуванням протягом 30 хв. при 2 атмосферах.

Розрахунок кількості інгредіентів для постановки реакції іммобілізації блідих трепонем меланжерним методом.

8. Весь лабораторний посуд промивають і стерилізують так само, як при постановці мікроанаеростатного методу. Меланжери промивають (у рукавичках) за допомогою груші, засмоктуючи в меланжер і вилучаючи з нього дистильовану воду двічі. Промивання послідовне у трьох банках. Потім меланжери складають у стерилізатор і кип'ятять протягом 30 хвилин. Воду зливають, а меланжери переносять у сушильну шафу. Після висушування складають у картонну коробку, загортують у папір і автоклавують так само, як і інший скляний посуд. Після стерилізації знову висушують у сушильній шафі і зберігають у шафі в боксі разом з іншим посудом не більше 7 днів.

Кожну сироватку досліджують у двох меланжерах. У перший меланжер набирають досліджувану сироватку до помітки "I". З кінця меланжера стерильним ватним тампоном знімають залишки сироватки. Після цього до помітки "II" набирають "коктейль" з першого флакону. У другий меланжер набирають до помітки "I" ту саму сироватку, а до помітки "II" - "коктейль" з другого флакону. Після надягання кільця вміст меланжерів змішують, меланжери мітять і укладають у спеціальний штатив або коробку з вирізами, штативи вміщують у термостат на 18-20 годин.

При постановці меланжерного методу застосовують ті ж самі контрольні дослідження, які використовують при мікроанаеростатному методі.

Через 18-20 годин меланжери виймають з термостату попарно дослідний і контрольний, і вміст їх переносять у наперед підготовлені і пронумеровані відповідно номерам меланжерів пробірки. Для цього після зняття кільця з поміткою меланжер опускають у відповідну пробірку. Вміст меланжера або вільно стікає на дно пробірки, або виштовхується з нього за допомогою гумової піпетки, натягнутої на верхній кінець меланжера. За допомогою цієї піпетки змішують у пробірці рідину і, не знімаючи піпетки з верхнього кінця меланжера, нижнім його кінцем наносять краплю рідини з дослідного меланжера на лівий бік предметного скла, а на правий бік - краплю рідини з контрольного меланжера. Скло попередньо нумерують відповідно до нумерації дослідних меланжерів. Краплі накривають покривним склом, розміром 20 х 20 мм. Реєстрацію результатів і визначення залишкового комплементу проводять так само, як і при мікроанаеростатному методі.

Джерела помилок ті самі, що і під час застосування мікроанаеростатної методики реакції іммобілізації блідих трепонем.

В останнє десятиліття велике значення для серодіагностики прихованного сифілісу і розпізнавання неспецифічних результатів стандартних результатів серологічних реакцій на сифіліс набрали специфічні реакції, зокрема реакція імунофлуоресценції-РІФ (РІФ-10, РІФ-200, РІФ-АБС). Перевагою РІФ є її більш висока чутливість, що дозволяє використати цю модифікацію реакції для діагностики всіх форм сифілісу, особливо розпізнавання ранніх форм. За специфікою РІФ-АБС і РІФ-200 близькі до реакції іммобілізації блідих трепонем. РІФ-200 і РІФ-АБС ставляться одномоментно з однією порцією крові. РІФ-10 - при підозрі на первинний серонегативний, уроджений, пізні форми сифілісу, під час встановлення ретроспективне діагнозу сифілісу, після лікування.

1. Досліджування сироватка крові.

Кров для одержання сироватки беруть з ліктьової вени, шкіру над якою обробляють ефіром, в чисту і суху пробірку в об'ємі 10 мл і обробляють так само, як для постановки реакції Вассермана. Інактивують сироватки крові одноразово при температурі 56 град. С. У зв'язку з тим, що РІФ ставиться не стерильно, використання стерильного посуду і дотримання умов стерильності при зберіганні сироваток не обов'язкове. Воно має значення лише для більш тривалого зберігання сироваток крові до дослідження.

2. Антиген.

Як антиген використовують завись патогенних блідих трепонем штаму Нікольса 7-добового орхіту кролика. Здорових кроликів-самців з негативними результатами реакції Вассермана і РІТ заражають інтратестикулярно 0,75 - 1,0 мл зависі, густота якої відповідає 40-60 трепонемам у темному полі зору. На 7 добу після зараження кроликів знекровлюють, забивають повітряною емболією і вилучають у них обидва яєчка. Яєчка очищають від жиру, від оболонок, придатків, розрізують на 10-15 кусочків, заливають у колбі 5-10-15 мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду (РН-7,2 - 7,4) і струшують 50-60 хв. Одержану завись блідих трепонем зливають з кусочків яєчок у стерильні пробірки з ватними пробками і залишають у холодильнику при 4-8 град. С на добу, після чого відокремлюють від осаду і при тих самих умовах зберігають весь період використання.

Одержання і зберігання антигену вимагає дотримання умов стерильності, оскільки з одним і тим самим антигеном реакція може ставитися протягом 2-4 місяців. Для антигена слід вибирати ту завись, в якій не спостерігається аглютинації трепонем і є достатня їх кількість. Антиген може бути одержаний в ампулах з інших лабораторій. Перед кожною постановою реакції завись добре перемішують і досліджують у темному полі зору для визначення її густоти.

При вживанні сухого трепонемного антигена - в ампулу з сухим антигеном добавляють 0,5 мл або 1,0 мл фосфатного буферу (РН 7,2-7,4) і розчиняють 15-20 хвилин. Використовують також, як і нативний антиген.

3. РІФ-АБС. Сорбент.

Як сорбент для РІФ-АБС може бути використаний ультразвуковий трепонемний антиген для РЗК, який випускає Каунаське підприємство по виробництву бактерійних препаратів Міністерства охорони здоров'я Литви. Він є сонікатом, оскільки являє собою розріджену ультразвуком завись суміші культуральних блідих трепонем V, VII, VIII, IX і Рейтера штамів.

Кожна серія сорбенту перед використанням у РІФ-АБС з діагностичною метою має бути відтитрованою.

Сорбенти титрують на сироватках крові хворих на сифіліс, які дають у РІФ позитивний (4+, 3+), слабопозитивний (2+) результат у розведенні 1:5, на сироватках крові, які дають у РІФ-5 неспецифічну позитивність (2+ і більше), а також на сироватках крові вільних від сифілітичної інфекції.

Нерозведений сорбент розчиняють фосфатним буфером (РН 7,2-7,4) в 2,3,4, рази і більше. Беруть три сироватки крові хворих на сифіліс, одна з яких дає в РІФ позитивний (4+) результат, 2-слабопозитивний (2+) результат і 5 сироваток крові від людей, вільних від сифілітичної інфекції, які в тому числі які дають неспецифічні результати (2+ і більше). Сироватки крові розводять сорбентом, розведеденим у 2, 3, 4 - і більше разів і випробовують у РІФ. Контролем у даному досліді є ті самі сироватки крові, розведені у 5 разів не сорбентом, а фосфатним буфером.

Титром сорбенту в даному випадку було розведення 1:3, під час якого всі сироватки крові хворих на сифіліс зберігали ступінь позитивності, одержаний у контролі, і в той же час надійно знімалась неспецифічна позитивність несифілітичних сироваток крові.

4. Антивидова люмінесціююча сироватка

Для дослідження у РІФ-АБС сироваток крові людей необхідна мічена флуорохромом сироватка крові тварин, імунізованих сироватковим білком людини. Люмінесціюючу імунну сироватку проти глобулінів людини випускає Інститут епідеміології і мікробіології АМН Росії ім. М.Ф.Гамалії. Ліофільно висушену люмінесціюючу сироватку розчиняють, дотримуючись умов стерильності, у дистильованій воді в тому об'ємі, який вказано на етикетці ампул, переливають у стерильну пробірку з гумовою пробкою і в процесі використання зберігають при 4 град. С. У день постановки реакції потрібну кількість цієї сироватки розводять за титром дистильованою водою. Вказане на етикетці робоче розведення сироватки не годиться для постановки реакції з метою серодіагностики сифілісу, тому титр кожні серії необхідно визначати заново.

Беруть 5 сироваток крові хворих на сифіліс і 5 сироваток крові здорових людей, розводять їх у 5 разів сорбентом (з врахуванням його титру) і ставлять реакцію з використанням в другій фазі різних розведень люмінесціюючої сироватки проти сироваткових глобулінів людини тієї серії, титр якої визначається. Слід врахувати, що титр люмінесціюючих сироваток, які випускає зараз ІЕМ ім. М.Ф.Гамалії, коливається при постановці РІФ-АБС від 1:100 до 1:140. Враховуючи реакції попереднім титром люмінесціюючої сироватки, слід вважати те розведення, при використанні якого з позитивними сироватками крові одержано краще світіння трепонем, а з негативним світіння антигену не одержано. Більш розведені люмінесціюючі сироватки, ніж титр, приводить до зниження чутливості реакції, а менше - до зниження специфічності. Після визначення попереднього титру слід його уточнити на більшій кількості позитивних і негативних сироваток крові. Остаточним титром можна вважати той, який перевірений на 100 сироватках крові, до того ж, з них не менше 20 має бути від хворих на сифіліс.

Для запобігання проросту після розведення сухої люмінесціюючої сироватки дистильованою водою до неї необхідно добавити мертіолат з розрахунку 1 об'єм його розчину 1:1000 до 9 об'ємів люмінесціюючої сироватки. Під час взяття нових ампул тієї самої серії титр слід лише перевірити і уточнити на 10 явно позитивних і негативних сироватках крові.

Готують 60 препаратів, нумерують їх від 1 до 60. Беруть 10 сироваток крові - 5 від хворих на сифіліс, 5 від здорових людей. Всі сироватки крові розводять у 5 разів розведеним за титром сорбентом. На 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60 препарати наносять у 1 фазі реакції одні й ті ж 10 сироваток крові, розведених у 5 разів сорбентом. У 2-й фазі реакції на 1-10 препарати наносять люмінесціюючу сироватку, розведену 1:100, на 11-20 - 1:100, на 21-30 - 1:120, на 31-40 - 1:130, на 41-50 - 1:140, на 51-60 - 1:150. Оптимальним слід вважати розведення, при якому світіння антигена буде хорошим при постановці реакції з позитивними сироватками крові і не буде спостерігатися з негативними.

З антигена готують препарати на тонкому, добре знежиреному предметному склі, на зворотному боці яких склорізом позначені кружечки діаметром 0,7 см по 10 кружечків на 1 предметному склі). У межах кружечка на скло наносять антиген - завись блідих трепонем. Запаяним кінцем пастерівської піпетки круговими рухами завись розподіляють у межах кружечка, висушують на повітрі і фіксують над полум'ям спиртівки, 10 хвилин у хімічно чистому ацетоні. Потім препарати нумерують восковим олівцем. Інактивовані досліджувані сироватки крові розводять у 5 разів сорбентом, розведеним за титром буферним розчином. У штативі вміщують ряд пробірок, кількість і номер яких відповідає кількості і номеру досліджуваних сироваток крові. У пробірки піпеткою розливають сорбент по 0,2 мл, потім додають по 0,05 мл досліджуваної сироватки крові і добре перемішують. Розведення сироватки крові можна здійснювати апаратом Флоринського. Розведені сироватки крові наносять на антиген так, щоб рівномірно покрити мазок, і препарати вміщують у вологу камеру, яку закривають кришкою і ставлять на 30 хвилин у термостат при температурі 37 град. С (I фаза реакції). Після I фази препарати обережно промивають у 2 порціях фосфатного буферу, причому у другу порцій препарати вміщують на 10 хвилин після чого їх висушують, знову вміщують у вологу камеру, наносять розведену за титром люмінесцентну сироватку і залишають при кімнатній температурі на 30 хвилин (II фаза реакції). Після закінчення II фази препарати промивають фосфатним буфером, як описано вище, висушують і наносять на поверхню мазків по краплі нелюмінесціюючого імерсійного масла (диметилфталату).

Дослідження препаратів проводять у люмінесцентному мікроскопі з ртутно-кварцевою лампою ДРШ-250, з імерсійною системою, окуляром 4 або 5, фільтрами СЕС-7 або 14, ФС-1, БС-8 і ЖС-18 або Т-2Н. Облік реакції здійснюють шляхом оцінки світіння блідих трепонем. Позитивними в РІФ - АБС вважають сироватки крові, які дають світіння 2+ і більше, негативними - які дають світіння на 1+ або не дають його.

В кожній постановці РІФ - АБС необхідно використати такі види контролю:

Позитивний контроль. Сироватка крові хворого на сифіліс, яка дає виражену флуоресценцію (4+) при розведені буфером у 5 разів. При розведенні у 5 разів сорбентом сироватка крові не повинна втрачати ступінь позитивності більш ніж на 1+.

Слабопозитивний контроль. Ціла або розведена сироватка крові хворого на сифіліс, яка дає слабку ступінь світіння антигена (2+) при розведенні буфером у 5 разів. При розведенні сорбентом позитивність її повинна зберігатися.

Неспецифічний контроль. Несифілітична сироватка крові, яка дає при розведенні буфером флуоресценцію не менше 2+. При розведені сорбентом позитивність повинна бути ліквідована.

Контроль антигена, сорбента, люмінесціюючої сироватки може ставитися лише при використанні нових серій цих інгредієнтів.

Постановка РІФ - АБС можлива не лише з сироваткою крові, але і кров'ю, взятою з пальця. Цю модифікацію РІФ-АБС можна використати при обстеженні на сифіліс дітей, при труднощах одержання крові з вени у дорослих, при масовому обстеженні різних контингентів на сифіліс.

При постановці РІФ-АБС застосовують ті самі інгредієнти реакції, що й при постановці РІФ-АБС - з сироваткою крові (антиген, сорбент, люмінесціююча сироватка). Проте титр люмінесціюючої сироватки визначають за вищевикладеною схемою, але при постановці реакції з кров'ю, а не сироваткою крові. Кров для дослідження після проколу пальця пацієнта голкою набирають мікропіпеткою до помітки 0,1 мл, швидко видувають у пробірку, що містить 0,3 мл дистильованої води, старанно перемішують піпеткою, фільтрують через паперовий фільтр, змочений дистильованою водою.

Постановка реакції з розведеною кров'ю можлива як у день взяття її, так і через 1-2 дні при умові зберігання при 4 град. С.

Безпосередньо перед постановкою реакції до всіх зразків крові, включених в постановку реакції, добавляють по 0,1 мл цільного сорбенту, переміщують піпеткою і струшують, вміщують на 30 хв. у термостат при 37 град. С. Потім кров, оброблену сорбентом, наносять на мазки антигена і вміщують у вологу камеру при 37 град. С (I фаза реакції). Після закінчення строку експозиції кров промивають у першій порції фосфатного буферу так. щоб на склі не залишилося слідів крові і вміщують препарати на 10 хв. у другу порцію буфера. Після висушування препаратів проводять II фазу реакції. При цьому на препарати наносять розведену за титром, установленому для даної модифікації РІФ, люмінесціюючу сироватку проти глобулінів людини. Скло у вологій камері знову вміщують у термостат при 37 град. С.

Через 30 хв. препарати знову промивають у 2 порціях фосфатного буферу протягом 10 хв., висушують і монтують для люмінесцентної мікроскопії. Дослідження препаратів і облік результатів реакції проводять так само, як і при постановці РІФ-АБС з сироваткою крові.

Методика постановки РІФ-АБС і РІФ - 200 близькі. При постановці РІФ - 200 обробка досліджуваних сироваток крові, приготування антигена, підготовка антивидової люмінесціючої сироватки та її титрування проводяться так само, як і при підготовці РІФ-АБС. Слід врахувати тільки, що титри люмінесціюючої сироватки, яку випускають зараз, у РІФ-200 коливаються від 1:10 до 1:50.

Досліджувані сироватки крові розводять у 200 разів фосфатним буфером. Для цього в штатив вміщують 3 ряди пробірок, число і нумерація яких у кожному ряду відповідає кількості і нумерації досліджуваних сироваток крові у робочому журналі. У першому ряду налито нерозведені досліджувані сироватки крові, у другому ряду у пробірку наливають по 0,45 мл буфера, у третьому - по 0,95 мл буфера. У другому ряду готують розведення сироваток крові в 10 разів, для чого з кожної пробірки першого ряду окремою 1 мл градуйованою піпеткою беруть 0,05 мл досліджуваної сироватки крові, переносять у відповідну пробірку другого ряду і змішують з буфером, що там є. З кожної пробірки другого ряду тією самою піпеткою переносять по 0,05 мл розведеної уже в 10 разів досліджуваної сироватки крові у відповідну пробірку третього ряду і одержують розведення в 200 разів.

Для проведення I фази на вміщені у вологу камеру препарати наносять розведені в 200 разів досліджуваної сироватки крові так, щоб їх номери, позначені на пробірках, відповідали номерам на предметних скельцях. Після нанесення на препарати сироватки крові вологу камеру вміщують на 30 хв. у термостат з температурою 37 град. С (I фаза реакції). Потім препарати промивають 10 хвилин у 2 порціях буфера і висушують. Після цього препарати знову вміщують у вологу камеру 1 на все наносять розведену за титром люмінесціюючу сироватку (II фаза реакції). Другу фазу проводять 30 хв. при кімнатній температурі. Після чого препарати 10 хв. промивають, висушують і монтують для люмінесцентної мікроскопії. Облік результатів РІФ - 200 проводять так само, як РІФ-АБС. У тому випадку, коли клініцистів цікавить титр флуоресціюючих антитіл у сироватці крові хворого, РІФ-АБС і РІФ - 200 слід ставити з послідовним розведенням досліджуваних сироваток крові, яке ще дає слабопозитивний результат реакції (2+). Позначати титр прийнято числом, що характеризує ступінь розведення досліджуваної сироватки крові, наприклад: 5, 10, 20, 40 і т.д. (РІФ - АБС або 200, 400, 800 і т.д. (РІФ-200).

При постановці обох модифікацій реакції для розведення досліджуваних сироваток крові і для промивання препаратів після I і II фази слід використати фосфатний буфер такого складу: 1 л дистильованої води, 6,8 г хлористого натрію, 1,48 г двозаміщеного фосфорнокислого натрію, 0.43 г однозаміщеного фосфорнокислого калію (РН = 7,2).

У зв'язку з можливою негативацією результатів реакції не варто досліджувати кров і сироватку крові в РІФ-АБС і РІФ-200 під час лікування хворих пеніциліном.

Рання діагностика уражень нервової системи при сифілісі є актуальним питанням у справі боротьби з цим захворюванням. У зв'язку з тим, що РІФ-Ц має більшу чутливість, ніж всі інші тести, які використовують для ліквордіагностики сифілісу, ця модифікація РІФ може бути рекомендована для діагностики сифілітичних уражень центральної нервової системи при всіх формах сифілісу.

Для постановки РІФ-Ц використовують той самий антиген, люмінесціюючу сироватку, що і для постановки РІФ-АБС і РІФ-200 з сироваткою крові. Аналогічні також визначення флюоресціуючих антитіл у лікворі і сироватці крові і облік реакції.

Спиномозкова рідина вводиться у реакцію неінактивованою і нерозведеною. До постановки реакції її зберігають у морозильному відділені холодильника у пробірках під гумовими пробками. Відтанення проводять при кімнатній температурі.

9 1-й фазі реакції на антиген наносять 0,05 мл нерозведеної досліджуваної спинномозкової рідини, препарати вміщують у вологу камеру на 30 хв. при кімнатній температурі. Потім їх промивають фосфатним буфером, РН=7,2-7,4 протягом 10 хв., висушують. У II фазі на препарати наносять розведену за титром люмінесціюючу сироватку, яку титрують при постановці реакції з спинномозковою рідиною. Витримують препарати при кімнатній температурі 30 хв. у вологій камері, промивають, висушують, монтують для люмінесцентної мікроскопії.

Принцип непрямої методики ІФА при використанні пластин з лунками.

До поверхні носія, відштампованого у вигляді пластин з лунками, приєднується антиген, який міцно на ній фіксується.

I фаза. Заповнення лунок пластин досліджуваної сироваткою. (При наявності протитрепонемних антитіл утворюється комплекс антиген-антитіло).

II фаза. Заповненя лунок пластин кон'югатами, що містять противидові антитіла, пов'язані з ферментом. Кон'югат міцно приєднується до комплексу антиген-антитіло.

III фаза. Заповнення лунок пластин субстратною сумішшю, складеною з речовин, які в присутності ферменту змінюють забарвлення (коричневе, світлокоричневе). Рахують візуально або при використанні фотометру.

1. Сенсабілізація лунок плати антигеном, інкубація 18 годин у темному місці при кімнатній температурі (по 0,2 мл в кожну лунку).

2. Промивання лунок плати фіз. розчином з ТВ-20.

3. Розведення досліджуваних і контрольних сироваток. Інкубація 60 хв. при 37 град. С (0,2 мл). Сорбція.

4. Нанесення розведених сироваток у лунки плати. Інкубація 30 хв. при температурі 37 град. С (по 0,2 мл). Вилучати струшуванням.

5. Промивання лунок плати 3 рази фіз. розчином з ТВ-20.

6. Розведення кон'югата (антивидові антитіла).

7. Нанесення кон'югата в лунки плати. Інкубація 30 хв. при температурі 37 град. С (по 0,2 мл) у кожну лунку, крім 1-го контролю).

8. Промивання лунок плати 3 рази фіз. розчином з ТВ-20.

9. Приготування розчину субстрату.

1. Приготувати карбонатно-бікарбонатний буфер 0,1 мл (РН = 9,6 + 0,1).

Зберігається у холодильнику 1-н тиждень.

3. Для промивання планшетів у фіз. розчині перед використанням добавляють ТВ-20 (на 1 літр фіз. розчину 0,5 мл ТВ-20).

4. Антиген для нанесення на плати:

вміст флакону розводять фіз. розчином без ТВ-20 (в 5 мл).

5. Робочий розчин ультраозвученого антигена готують, використовуючи карбонатно-бікарбонатний буфер, у розведенні, вказаному на етикетці.

Якщо титр 1:40, то 0,25 мл розчину антигена + 9,75 мл буфера. Вихідний антиген, що залишився, зберігати (-18 +- 2 град. С. На 1 плату потрібно 20 мл робочого розчину, на 4 плати - 80 мл. 2 мл вихідного антигена + 78 мл буферного розчину. 2,5 мл вихідного антигена + 97,5 мл буферного розчину з запасом). Промити планшети фіз. розчином без детергента - 3 рази.

6. Наливати по 0,2 мл антигена в кожну лунку плати, закрити кришкою і помістити у темне місце при кімнатній температурі на 18 годин.

7. Промивання лунок плати:

різким рухом виділити вміст лунок плати. Плату заливають приготовленим розчином (фіз. розчин + ТВ-20).

Різким рухом виділяють знову залитий фіз. розчин + ТВ-20 (всього три рази).

Потім плати тричі за 5 хвилин заливають фіз. розчином з ТВ-20 після останнього виділення розчину, вилучають рештки ударом об фільтрувальний папір.

8. Розведення контрольних і досліджуваних сироваток.

Контрольні позитивні і негативні сироватки розводять у 0,5 мл стерильної дистильованої води для ін'єкцій.

Сорбент розчиняють, вміст флакону з етикеткою "Пептон ферментативний сухий" розчиняють в 150 мл дистильованої води. До 150 мл розчину додають вміст флакону з етикеткою "Препарат сироватки молока, сухий" і 0,75 мл твина (детергента). Старанно перемішують. Розчин готують перед використанням і не зберігають. Цієї кількості вистачає на 1-у плату.

1-й ряд 0,45 мл сорбента + 0,05 мл сироватки, розведеної 1:10;

2-й ряд 1,9 мл сорбента + 0,1 мл сироватки, розведеної 1:200.

Слабопозитивну сироватку роблять з позитивної сироватки з розведення 1:10, взявши 0,02 мл сироватки + 1,98 сорбента (1:1000).

Інкубація у термостаті 60 хв. при температурі 37 град. С.

Нанесення сироваток на плату:

Після інкубації з сорбентом сироватки наносять по 0,2 мл (2 лунки на одну сироватку).

В останні 8 лунок вносять контролі:

I - фіз. розчин контроль субстрата.

VI - негативна сироватка, контроль негативної сироватки.

Накрити кришкою і помістити у термостат на 30 хв. при температурі 37 град. С.

Виділити струшуванням і відмити тричі по 5 хв.

Розводять як вказано на ампулі (0,5 мл стерильної дистильованої води) або в 5 мл розведення 1:10.

Робоче розведення: на розчині, що містить 50 % сорбента і 50% фіз.розчину з ТВ-20.

0,7 мл кон'югата + 10,15 мл сорбента + 10,15 мл фіз.розчину з ТВ-20.

Нерозведений кон'югат, що залишився, зберігають при температурі 18 +- 2 град. С один місяц (розлитий по 1-у мл). У кожну лунку планшета вносять по 0,2 мл кон'югата в робочому розведенні, а в контролі в 1 місце вносять фіз.розчин замість кон'югата; планшет витримують у термостаті при температурі 37 град. С 30 хв.

Вилучають рідину з лунок планшета струшуванням і відмивають тричі фіз. розчином з ТВ-20 і три рази по 5 хв.

Після останнього виведення розчину усувають рештки його ударом об фільтрувальний папір.

Готують за 30 хв. до використання 20 мг - 5-аміносаліцилової кислоти + 25 мл Н О,

На рН-метрі доводять до рН 6,0 +-0,05 розчином 0,1 NaOH (зберігають у темному місці при температурі 20+-2 град. С).

Потім до 9 частин кислоти + 1 частина 0,05 % Н О.

1. 8,75 мл дист. Н О + 0,25 мл 355 Н О.

4. Змішують.

До кожної лунки планшету вносять піпеткою по 0,2 мл субстратної суміші в усі лунки з досліджуваними сироватками і контролями (I-VI). Планшети витримують 60 хв. при температурі (20 +- 2 град. С) у захищеному від світла місці.

У лунках планшету, де пройшла реакція, з'являється забарвлення від світлокоричневого до темнокоричневого. В лунках, де проводилися дослідження негативної сироватки, колір субстрату світло- або темно-бежевий.

Спочатку субстрат вносять у I контроль і II контроль, якщо через 5 хв. немає коричневого кольору, уточняють і готують субстрат знову і заливають у П , а потім всі інші.

VI - прозоре або світло-жовте забарвлення.

Впорядкування і вміст приміщень.

Лабораторія має бути забезпечена водопроводом, гарячим водопостачанням, каналізацією, центральним водяним опаленням і газом (якщо в населеному пункті є газова мережа). В населених пунктах, де немає водопроводу та каналізації, бажано обладнати місцевій водопровід, каналізацію і очисні споруди.

У виробничих приміщеннях лабораторій мають бути обладнані дві водопровідні раковини, одна - для миття рук персоналу, друга - для миття лабораторного інвентарю і посуду.

Електроприлади: центрифуги, сушильні шафи, термостати, водяні бані, автоклав необхідно заземлити.

Під час роботи з мікроскопом слід забезпечити правильне освітлення поля зору. Під час роботи з мікроскопом рекомендовано використовувати бінокуляр, якщо його немає, то не закривати око, що не працює, працювати поперемінно то одним, то іншим оком, робити перерви у роботі при перевтомленні зору.

Під час роботи з обертальними пристроями дотримуватися правил, що гарантують безпеку обслуговуючому персоналу, а саме:

центрифугу включати лише після закриття кришки;

пробірки виймаються лише після закриття кришки;

волосся працівника має бути підібране під косинку або шапочку.

Для одержання інфекційного матеріалу від тварин має бути спеціальний стіл з набором інструментів, які використовують лише для цих цілей.

Бокси, в яких проводиться робота з блідими трепонемами, повинні мати таке устаткування:

шафа для посуду та інструментів;

стіл, покритий лінолеумом або нержавіючим залізом;

банки з дизрочином;

емальований посуд з кришками для використаного інфікованого посуду і відпрацьованого матеріалу;

бактерицидні лампи для стерилізації повітря і устаткування.

За межі даної установи інфікований матеріал виносять у пробірках, флаконах і ін., загорнутих в гігроскопічну вату і вміщених у металеву посудину, яка щільно закривається кришкою.

Бокси, в яких проводиться робота з зараженими тваринами, повинні мати таке обладнання;

шафа для посуду, інструменти;

стіл, покритий лінолеумом;

дерев'яні станки для фіксації тварин, які повинні бути пофарбовані світлою масляною або нітрофарбою;

бактерицидна лампа.

Оперативні втручання на заражених тваринах і зараження повинні проводитися у фартухах, гумових рукавичках і захисних окулярах. Після роботи фартух і рукавички; обробляють дезінфікованим розчином, рукавички кип'ятять протягом 30 хвилин.

Тушки убитих тварин, хворих на сифіліс, необхідно збирати у спеціальне сховище з наступним спалюванням. При неможливості спалювання, тушки заливають 5 % розчином хлораміну на добу, а потім закопують у землю далеко від житлових приміщень на достатню глибину (0.7-1 метр), не допускаючи викопування їх іншими тваринами (собаками, кішками та ін.).

У процесі роботи і після її закінчення застосовують такі способи дезинфекції. Посуд, що стикається з блідими трепонемами або містить заражені шматочки тканин, занурюють у воду з миючими засобами типу "Лотос" кімнатної температури без застосування дезінфікуючих засобів, кип'ятять протягом 30 хв. у вказаному розчині, охолоджують і миють проточною водопровідною, спочатку теплою, потім, холодною водою, з наступним прополіскуванням дистильованою водою.

Отвір верхнього кінця, за допомогою якого насмоктують інфікований матеріал, повинен бути щільно закритий ватним тампоном.

Піпетки, забруднені блідими трепонемами вміщують у 3-5% розчин карболової кислоти на 1-у годину, потім промивають 5-6 разів водопровідною водою і один раз дистильованою. Якщо піпетки при цьому не стають прозорими, їх занурюють у розчин хромової суміші на добу, після чого промивають 9 разів водопровідною водою і один раз - дистильованою.

Кров, що поступила на дослідження, і одержану з неї сироватку після роботи зливають у каналізацію, попередньо обробивши дезінфікованим засобом.

Посуд після використання промивають під проточною водою, потім замочують гарячим (50 град. С) миючим засобом на 30 хв., повністю зануривши його у розчин і заповнивши порожнини.

Потім посуд миють йоржами або ватно-марлевими тампонами, в середньому 25-30 секунд один предмет. Вимитий посуд споліскують у проточній воді, потім у дистильованій воді і висушують при температурі 180-200 град. С протягом 45 хвилин.

Як миючий розчин застосовують 0,5% комплекс перекису водню з миючими засобами - "новость", "прогрес", сульфанол, триалотос, "астра" тощо.

Мокрі пробірки складають у спеціальні ящики, на дні яких є отвори, через які стікає вода, яка залишилася після миття у пробірках. При великій кількості пробірок мити їх зручно за допомогою пристрою до водопровідного крану, а також йоржами, запропоновано О.В.Флоринським.

Поверхню робочих столів у кінці кожного робочого дня, а також при забруднені їх кров'ю, сироваткою крові обробляють дезінфікуючим розчином (80 мл 96 град. спирту + 20 мл дистильованої води + 7 мл 33% пергідролю, розчином сулеми 1:1.000 та ін.).

У випадку забруднення рук кров'ю слід вимити їх теплою водою з господарським милом, насухо витерти і обробити тампоном, змоченим антисептиком (6% розчину перекису водню або 0,1% розчину девоксану та ін.) або вказаним вище дезинфікуючим розчином (80 мл 96 град. спирту і 20 мл дистильованої води + 7 мл 33% пергідролю).

Всі маніпуляції, при яких може статися забруднення рук кров'ю і сироваткою крові, слід проводити у гумових рукавичках.

Під час роботи з кров'ю, сироваткою крові треба користуватися гумовою грушею. Засмоктування ротом не допускається.

При аварії під час роботи з інфекційним матеріалом (биття посуду, розбризкування з шприця при зараженні тварин, а також у всіх випадках, що ведуть до забруднення заразним матеріалом оточуючих предметів, одягу і відкритих частин тіла працівників) присутній при цьому персонал зобов'язаний негайно повідомити про те, що сталося, завідуючого лабораторією і провести знезаражування приміщення, обладнання і предметів, які могли бути інфікованими, а також провести самознезаражування.

Для ліквідації наслідків аварії використовують такі методи обеззаражування:

горизонтальну поверхню, на яку попав заразний матеріал, заливають дезінфікуючим розчином (5% розчин хлораміну або 5% розчин карболової кислоти):

вертикальні поверхні (забруднення стін, поверхні меблів, приладів), протирають ватним або марлевим тампоном, добре змоченим дезінфікуючим розчином;

забруднений одяг знімають і замочують у дезінфікуючому розчині;

забруднене взуття обмивають тампоном, змоченим дезрозчином;

відкриті ділянки шкіри лиця, рук і частин тіла у випадку забруднення їх заразними матеріалами (завись блідих трепонем, сироватка з інфекційного відділення) обробляють 70% етиловим спиртом;

при забруднені слизистих оболонок рота прополіскують розчином соди або 0,5% розчином соляної кислоти, очі промивають водою і закапують свіжоприготовленим 1% розчином азотнокислого срібла або 30% альбуциду; у ніс закапують 1-2 краплі 1% розчину проторголу і проводять профілактичне лікування;

під час нещасного випадку, пов'язаного з пораненням або укусом заражених тварин, або іншими порушеннями цілісності шкірного покриву, необхідно видавити з ранки кров, змазати рану 5% настойкою йоду і провести курс профілактичного лікування. При подряпанні шкіри зараженою твариною на місце враження кладуть на 5 хвилин компрес з 5% розчином лізолу або роблять ванночку з того самого розчину.

Дозвіл на видачу заражених сифілісом кроликів дає Головне управління карантинних інфекцій Міністерства охорони здоров'я України, тому для одержання зараженої тварини необхідно попередньо звернутися за дозволом до заступника начальника Головного управління карантинних інфекцій МОЗ України, голови центральної режимної комісії.

Видавання заражених сифілісом кроликів, а також зависі блідих трепонем проводять у відповідності з положенням "Про порядок обліку, зберігання, звертання, відпускання і пересилання культур бактерій, вірусів, рикетсій, грибів найпростіших, мікоплазм, бактерійних токсидів, ядів біологічного походження", затверджених заст. міністра охорони здоров'я України.