Про організацію лабораторної діагностики сифілісу в Україні

З метою подальшого удосконалення лабораторної діагностики сифілісу в Україні, підвищення якості та рівня діяльності серологічних лабораторій, які здійснюють ці дослідження

1. Положення про централізовану серологічну лабораторію (додаток 1).

2. Розрахункові норми часу на імунологічні дослідження для діагностики сифілісу (додаток 2).

3. Інструкцію про порядок лабораторних досліджень на сифіліс (додаток 3).

1. Завідуючому відділом охорони здоров'я Ради Міністрів Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних та Севастопольської міської державної адміністрації, голові Департаменту охорони здоров'я та соціального захисту Київської міської державної адміністрації ввести в дію з 01.02.1993 р. "Положення про централізовану серологічну лабораторію, розрахункові норми часу на лабораторні дослідження для діагностики сифілісу, Інструкцію з постановки лабораторних досліджень на сифіліс".

2. Накази Міністра охорони здоров'я СРСР від 27 лютого 1963 р. N 86 та від 2 вересня 1985 р. N 1161 вважати такими, що втратили чинність на території України.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника Міністра охорони здоров'я України Мальцева В.І.

1. Загальні положення

Централізовану серологічну лабораторію організовують тільки у складі шкірно-венерологічного диспансеру (республіканського, обласного, міського, в м. Києві, м. Харкові та ін.) на правах відділення.

Централізовану серологічну лабораторію організовують за наказом органу охорони здоров'я, якому підпорядковується шкірно-венерологічний диспансер.

Централізована серологічна лабораторія обслуговує лікувально-профілактичні установи, які прикріплені до неї для проведення серологічних досліджень на венеричні захворювання.

При постановці серологічних реакцій на венеричні захворювання лабораторія керується відповідними методичними вказівками і інструкціями, затвердженими Міністерством охорони здоров'я України.

Керівництво централізованою серологічною лабораторією здійснює завідуючий, призначений головним лікарем шкірно-венерологічного диспансеру.

2. Завдання централізованої серологічної лабораторії.

2.1. Проведення серологічних досліджень крові та ліквору на сифіліс: реакція зв'язування комплементу (РЗК) - Васермана з кардіоліпіновим і трепонемним антигенами плюс реакція мікропреципітації з кардіоліпіновим антигеном з інактивованою сироваткою, реакція іммобілізації блідих трепонем (тест Нельсона), реакція імунофлуоресценції (РІФ), реакція імунофлуоресценції з абсорбцією (РІФ - АБС, імуноферментний аналіз (ІФА), реакція мікропреципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з плазмою або інактивованою сироваткою ізольовано та ін.

2.2. Систематичний контроль за якістю серологічних реакцій на венеричні хвороби в процесі досліджень, що проводять в лабораторіях шкірно-венерологічних диспансерів та інших лікувально-профілактичних закладів, які перебувають в районі діяльності шкірно-венерологічного диспансеру, до складу якого входить Централізована серологічна лабораторія.

2.3. Підготовка та підвищення кваліфікації лабораторних працівників з серологічної діагностики сифілісу.

2.4. Надання методичної та консультативної допомоги медичним працівникам лікувально-профілактичних закладів у здобутті, збереженні, пересиланні матеріалу для дослідження та проведення досліджень.

2.5. Участь у науковій розробці питань з серології.

2.6. Проведення облікової та звітної документації і представлення її керівникові шкірно-венерологічного диспансеру, до складу якого входить серологічна лабораторія.

3. Контингенти, що підлягають обов'язковому відбірковому обстеженню на сифіліс:

3.1. Методами реакції зв'язування комплементу (РЗК) і (або) імуноферментного аналізу (ІФА):

- донори крові, кісткового мозку, внутрішніх органів, шкіри, сперми;

- вагітні за час вагітності у першу та другу половину вагітності, крім ІФА, підлягають обов'язковому обстеженню в РЗК;

- особи, що направляються для штучного переривання вагітності;

- хворі гінекологічних, урологічних, неврологічних, проктологічних, психіатричних, онкологічних стаціонарів.

3.2. Контингенти, що підлягають обстеженню на мікрореакцію преципітації з кардіоліпіновим антигеном (МР) і (або) ІФА:

- хворі, що одержаують стаціонарну медичну допомогу, за винятком контингенту, передбаченого п. 3.1;

- всі хворі, що вперше звернулись по амбулаторну допомогу в поточному році;

- особи, що доставлені органами МВС.

3.3. Особи, котрі підлягають періодичним медичним оглядам на венеричні захворювання (декретовані контингенти) метод обстеження на сифіліс встановлює територіальний орган охорони здоров'я (РЗК, мікрореакція преципітації), відповідним наказом в залежності від епідеміологічного стану.

4. Штати, обладнання, постачання.

В кожній централізованій серологічній лабораторії вводять посаду завідуючого лабораторією. Посади лікарів-лаборантів та середніх лаборантів встановлюють у відповідності з "Розрахунковими нормами часу на імунологічні дослідження для діагностики сифілісу", затвердженими Міністерством охорони здоров'я України (додаток 2 до наказу МОЗ України від 29.12.92 р. N 204).

Централізована серологічна лабораторія може мати віварій для утримання тварин, які необхідні для забезпечення нормальної роботи лабораторії.

РОЗРАХУНКОВІ НОРМИ ЧАСУ ВИКОРИСТОВУЮТЬ ДЛЯ:

- вирішення питань удосконалення організації діяльності серологічних лабораторій;

- планування та організації праці лікарів-лаборантів і лаборантів;

- аналізу працевитрат персоналу лабораторії;

- формування штату лабораторій;

- визначення розцінок дослідження під час переходу бюджетних закладів охорони здоров'я на нові умови господарювання.

Розрахункові норми часу розроблено в основному для ручних уніфікованих методів дослідження.

При використанні засобів механізації та автоматизації час аналізу скорочується, а норми можуть бути змінені на основі хронометражних вимірів.

РОЗРАХУНКОВІ НОРМИ ЧАСУ ВКЛЮЧАЮТЬ:

- витрати часу лікарів-лаборантів на розрахунок необхідної кількості інгредієнтів та їх розведення, приготування реактивів, титрацію комплементу, постановку контролю інгредієнтів у кожному досліді, безпосереднє проведення досліджень, облік результатів і запис їх у робочі журнали, бланки аналізів та картотеку;

- витрати часу лаборантів з середньою освітою на безпосереднє проведення певних етапів досліджень і трудових операцій, приготування реактивів і дезрочинів, запис результатів у робочі журнали.

Питома вага роботи медперсоналу для безпосереднього проведення досліджень (основна і допоміжна діяльність) становить у лікарів-лаборантів і середніх лаборантів 90 % робочого часу.

Цей час і включено до розрахункових норм. Решту робочого часу використають: лікарі-лаборанти - на освоєння нових методів та апаратури, проведення досліджень з контролю якості, попереднє приготування реактивів, навчання і контроль за роботою персоналу, участь у конференціях та нарадах, короткочасний передпочинок під час роботи з мікроскопом і іншими оптичними приладами, для передавання необхідної інформації в лікпрофустанови, виходів (виїздів) для перевірки якості постановки досліджень на сифіліс та наданню організаційно-методичної допомоги; лаборанти - на всю підготовчу роботу на початку робочого дня, видання результатів аналізів, догляд за апаратурою, стерилізацію інструментарію і лабораторного посуду, попереднього приготування реактивів, приведення робочого місця в порядок в кінці робочого дня.

Час переходів (переїздів) для взяття лаборантом матеріалу для дослідження враховують по фактичним затратам.

У розрахункових нормах вказано виконавця роботи - лікаря-лаборанта або лаборанта, в залежності від розподілу роботи, яка пропонується в розрахункових нормах.

Перелік функціональних обов'язків визначено в посадових інструкціях.

Оптимальне співвідношення посад фельдшерів-лаборантів і лаборантів установлюють у кожній установі на розсуд адміністрації.

Для завідуючих лабораторіями, в штаті яких 5-10 посад лікарів-лаборантів, обсяг роботи становить 50 %. При наявності більше 10 посад лікарів-лаборантів завідуючий лабораторією звільняється від безпосереднього проведення досліджень.

Загальнорічний бюджет робочого часу посади лікаря-лаборанта або лаборанта при 282 робочих днях (з 365 вираховують 59 вихідних і святкових, 24 дні відпустки і по 0,5 години перед вихідними днями при 6,5 годинному робочому дні) становить:

при 6-годинному робочому дні 101520 хвилин (282 х 6,0 х 60 хвилин), при 6,5-год. робочому дні медреєстратора - 108210 хвилин (282 х 6,5 х 60 хвилин - 59 х 30 хвилин).

Річний бюджет робочого часу (РБ) на проведення досліджень становить у лікаря-лаборанта і лаборанта 91368 хв. (90 % від загальнорічного бюджету робочого часу), у медреєстратора - 97389 хв. (90 % від загальнорічного бюджету робочого часу).

Для розрахунку числа посад лікарів-лаборантів або лаборантів необхідно визначити річний обсяг діяльності посади (РО) у хвилинах на основі розрахункових норм часу і даних про кількість досліджень і трудових операцій, проведених за рік.

Попередньо необхідно визначити час, витрачений лікарем-лаборантом на постановку кожного виду досліджень за рік (час у хвилинах на 1 дослідження помножити на кількість даного виду досліджень), а також час, витрачений лікарем-лаборантом або лаборантом на проведення кожної трудової операції за рік (час у хвилинах на трудову операцію з 1-м зразком крові помножити на кількість даних трудових операцій).

Сума одержаних результатів - це річний обсяг діяльності (РО) даної посади у хвилинах.

де РО - річний обсяг роботи посади в хвилинах,

РБ - річний бюджет робочого часу посади у хв.

ПРИКЛАД:

За рік лікар-лаборант проводить:

МР з інактивованою сироваткою, якісна методика -

При цьому проведено трудові операції - оформлення результатів на бланку і внесення результатів на бланку і внесення результатів у картотеку - 40000+2000+1000=43000.

Річний обсяг діяльності (РО) даного лікаря - 136250 хвилин (0.75 хв х 40000 + 0.75 хв х 40000 + 6 хв х 500 + 0,75 хв х 40000 + 0,75 хв х 2000 + 0,75 хв х 1000 + 1 хв х 43000).

Річний бюджет (РБ) робочого часу посади лікаря-лаборанта - 91368 хв. Необхідне число посад (П) лікарів-лаборантів - 1,5 (138250 хв : 91368 хв = 1,51).

Посади санітарок установлюють з розрахунку 0.5 посади санітарки на кожну 1-у посаду лікаря-лаборанта.

Ця Інструкція передбачає застосування таких досліджень:

1. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з кардіоліпіновим антигеном, якісна методика (у тому числі РЗК на холоді).

2. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з трепонемним антигеном, якісна методика (у тому числі РЗК на холоді).

3. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з кардіоліпіновим антигеном, кількісна методика.

4. Мікрореакція преципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з інактивованною сироваткою, якісна методика.

Примітка: Під час дослідження сироватки на сифіліс всі вказані вище реакції ставляться одночасно і обов'язково (п.1-4).

5. Мікрореакція преципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з плазмою крові, якісна методика.

6. Мікрореакція преципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з плазмою або інактивованою сироваткою крові, кількісна методика.

7. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з спинномозковою рідиною з кардіоліпіновим антигеном (у дозах 0,5-0,25-0.1).

8. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з трепонемним антигеном (у дозах 0,5-0,25-0,1).

Примітка: Під час дослідження спинномозкової рідини реакції, зазначені в п. 7 і 8, ставляться одночасно і обов'язково.

9. Реакція імунофлуоресценції РІФ-10, непрямий метод, якісна методика.

10. Реакція імунофлуорісценції РІФ-200, непрямий метод, якісна методика.

11. Реакція імунофлуоресценції з абсорбцією (РІФ-АБС), непрямий метод, якісна методика.

12. Реакція імунофлуоресценції РІФ, кількісна методика.

Примітка: Реакції, зазначені в п.10 і 11, ставляться одночасно і обов'язково. Реакції, зазначені в п.9 і 11, ставляться по показникам, п.9 (інкубаційний період), первинний серонегативний сифіліс, пізні форми сифілісу, уроджений сифіліс, при підозрі на перенесену в минулому сифілітичну інфекцію, п.12 діагностика різноманітних форм сифілісу, якості проведеної терапії. критерій виліковності сифілісу.

13. Реакція імунофлуоресценції з спинномозковою рідиною, якісна методика (РІФ-н).

14. Реакція імунофлуоресценції з спинномозковою рідиною, якісна методика (РІФ-10, РІФ-200).

15. Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІТ), класичний або меланжерний метод, якісна методика.

16. Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІТ), класичний або меланжерний метод зі збільшенням об'єму досліджуваної сироватки.

17. Імуноферментний аналіз (ІФА), якісна методика.

Ця Інструкція від раніше затвердженої Міністерством охорони здоров'я СРСР у 1963 р. (наказ від 27 лютого N 86), відрізняється тим, що рекомендує вважати в реакції зв'язування комплементу РЗК (реакція Вассермана) лише кардіоліпіновий і трепонемний антигени.

Менш чутливі реакції (РЗК з ліпоідним антигеном), осадові реакції Закс-Вітебського і Кана виключені з постановки. Не використовуються і активні модифікації.

Паралельно з РЗК з кардіоліпіновим і РЗК з трепонемним антигенами обов'язково використовують і мікрореакцію преципітації з кардіоліпіновим антигеном з інактивованою сироваткою. Спільне одначасне використання РЗК з кардіоліпіновим РЗК з трепонемним антигенами і мікрореакції (МР) з інактивованою сироваткою обумовлюється тим, що в сироватці хворих на сифіліс виявляють різні антитіла, МР з кардіоліпіновим антигеном приєднана до РЗК, що підвищує надійність під час виявлення сифілісу. З метою підвищення чутливості РЗК можна застосовувати методику постановки її на холоді.

Постановка РЗК і специфічних реакцій на сифіліс провадиться в централізованих серологічних лабораторіях, а також в лабораторіях лікувально-профілактичних установ дермато-венерологічного профілю.

Одержавши позитивний результат (4+, 3+) в РЗК з кардіоліпіновим антигеном, застосовують кількісну методику постановки для визначення титру антитіл у сироватці крові.

Зниження концентрації антитіл у сироватці крові. Зниження концентрації антитіл, негативація серологічних реакцій є одним з критеріїв ефективності лікування хворих на сифіліс.

Спільне використання РЗК з кардіоліпіновим і РЗК з трепонемним антигенами, МР з інактивованою сироваткою, а також ІФА повинні застосовуватися для діагностики усіх форм сифілісу, контролю ефективності лікування, обстеження осіб, що були у контакті із хворими на сифіліс, донорів, осіб, що направлені на переривання вагітності, у т.ч. у ранні строки (вакуум-екстракція), хворих гінекологічного, неврологічного, психіатричного, урологічного, проктологічного, онкологічного профілей, вагітних (не допускається заміни РЗК на ІФА або інші відбіркові реакції під час обстеження вагітних).

Постановка РЗК і специфічних реакцій на сифіліс провадиться в централізованих серологічних лабораторіях, а також в лабораторіях лікувально-профілактичних установ, які здійснюють діагностику сифілісу. Необхідність спільного одночасного використання реакції зв'язування комплементу (РЗК) з трепонемними і кардіоліпіновим антигеном з інактивованою сироваткою крові, обумовлюється тим, що у сироватці крові хворих на сифіліс виявляють різні антитіла. МР з кардіоліпіновим антигеном приєднана до РЗК у зв'язку з її більшою чутливістю у порівнянні з РЗК, що забезпечується високою концентрацією кардіоліпінового антигена, необхідною для одержання преципітату, що підвищує надійність виявлення сифілісу. З метою підвищення чутливості РЗК можна застосовувати методику постановки її на холоді.

Постановка відбіркових реакцій повинна провадитися в серологічних лабораторіях, а при відсутності їх - в діагностичних лабораторіях дермато-венерологічного профілю.

Для постановки відбіркових реакцій повинні бути виділені лаборанти з вищою та середньою освітою, медичні сестри. Навчання брати кров з пальця і з вени, методику постановки і обліку результатів реакції повинне здійснюватися в серологічних лабораторіях НДІ, обласних і тих міських КВД, на які покладено функції організаційно-методичних центрів.

Взяття крові з пальця і постановку МР повинні проводити особи з середньою освітою. При їх відсутності облік результатів проводить лікар будь-якої спеціальності, який пройшов відповідну підготовку.

Організаційні питання, пов'язані з застосуванням відбіркових реакцій на сифіліс (взяття крові з вени або пальця, місце її дослідження та ін.), повинні вирішуватися органами охорони здоров'я на місцях, залежно від місцевих умов та можливостей.

За допомогою відбіркових реакцій обстежуються особи, що підлягають періодичним медичним оглядам на венеричні захворювання, хворі, що поступають на обстеження і лікування в лікувальні установи для дорослого населення, особи, яких помістили до медичних витверезників, спецприйомників, прийомників-розподільників, ізоляторів для тимчасового утримання під охороною, умовно достроково звільнених і направлених на будівництво народного господарства, а також умовно засуджених, які стоять на обліку в спецкомендатурах.

На основі позитивних результатів відбіркових реакцій діагноз сифілісу не встановлюють, обстежених направляють до дерматовенеролога і їхню кров досліджують в КЗР, РІФ, РІТ, ІФА, тобто під час профілактичних обстежень мікрореакції (МР) використовують як відбіркові, а не діагностичні.

Специфічні серологічні реакції (РІТ і РІФ) використовують для діагностики прихованих і пізніх форм сифілісу, розпізнання, хибно-позитивних результатів РЗК і МР, при клінічній, епідеміологічній і анамнестичній підозрі на сифіліс, для встановлення ретроспективного діагнозу сифілісу, а також під час контролю ефективності лікування серорезистентного сифілісу і встановлення вилікування сифілісу. Під час обстеження статевих контактів хворого на сифіліс і діагностиці первинного серонегативного сифілісу застосовують РІФ (РІФ-10, РІФ-200, РІФ-АВС), оскільки при ранніх формах захворювання реагіни і іммобілізини ще не виявляються. Відсутність тих або інших антитіл може спостерігатися і при інших формах сифілісу, головним чином у пізній стадії захворювання, у зв'язку з чим паралельна постановка кількох специфічних серологічних тестів підвищує число виявлених хворих на сифіліс.

Використання різноманітних модифікацій постановки специфічних серологічних реакцій на сифіліс визначається метою дослідження. Так, на РІФ, РІФ-10, РІФ-200, РІФ-АВС доцільно орієнтуватися при діагностиці ранніх форм сифілісу.

При серологічному обстеженні новонароджених дітей, при неможливості одержання крові з вени у дорослих слід використати методику постановки РІФ-АВС з капілярною кров'ю.

З метою ліквордіагностики сифілісу слід застосовувати РІФ-н і РІФ-10, при неможливості її постановки РЗК з кардіоліпіновим антигеном на холоді.

Серологічні лабораторії НДІ, обласних і міських КВД повинні здійснювати контроль якості серологічних реакцій, які застосовують у лабораторіях підвідомчих територій.

Підготовка лікарів лаборантів з методики серологічного дослідження і підвищення їхньої кваліфікації повинні здійснюватися в шкірно-венерологічних установах НДІ, обласних і міських КВД, на які покладено функції організаційно-методичних Центрів, на кафедрі венерології і лабораторної справи інститутів удосконалення лікарів.

Принцип: при додаванні до плазми або сироватки крові хворого на сифіліс емульсії кардіоліпінового антигену утворюється преципітат (комплекс - антиген-антитіло), який осідає у вигляді пластівців білого кольору.

Устаткування, необхідне для взяття крові з пальця і вени та постановки реакції:

1. Капілярні піпетки апарату Панченкова.

2. Градуйовані піпетки 1,2,5 і 10 мл. Пастерівські піпетки.

3. Пробірки завдовжки 8-10 см і 14-15 см., діаметром 1-1,5 см або центрифугальні.

4. Пластинки з прозорого матеріалу з лунками діаметром 1-1,2 см., завглибшки не менше 0,5 см.

5. Голки для взяття крові з пальця або вени.

6. Гумова груда.

7. Центрифуга, яка робить не менше 1000 об/хв.

8. Апарат для струшування.

9. Ваги аналітичні Т-200 4-го кл.

10. Важки аналітичні ГОСТ-7328-61 4-го кл.

1. Антиген кардіоліпіновий для мікрореакції.

2. Холін-хлорид (включається в упаковку з антигеном).

3. Хлорид натрію х.ч. (цитрат натрію).

4. Натрій лимонно-кислий (Na C H O х 5 H2O) тризаміщений.

5. Мертиолат (С Н О NaH).

1. Ізотонічний розчин хлориду натрію 1,9 %.

2. 10 % розчин холін-хлориду. Готують так: до 29.65 мл ізотонічного розчину натрію хлориду додають 0,35 мл 0,01 % розчину мертіолату і 5 мл 70 % розчину холін-хлориду.

Суміш старанно перемішують. При відсутності мертіолату для приготування 10% Розчину натрію хлориду додати 5 мл 70 % розчину холін-хлориду.

3. 5 % розчин тризамішеного цитрату натрію готують на дистильованій воді і фільтрують. Розчин не стійкий. Під час помутніння його треба замінювати свіжим.

4. Контрольні ліофілізовані сироватки крові для встановлення їхньої придатності емульсії антигена випускає Каунаське підприємство по виробництву бактерійних препаратів. Негативну і позитивну сироватки крові використовують нерозведеними, слабопозитивну одержують з позитивної шляхом її розведення.

При відсутності ліофілізованих сироваток крові використовують нативну позитивних у РЗК з кардіоліпіновим антигеном або мікрореакції інактивованих сироваток крові, які з метою економії розливають по 0,5 мл у пробірки з щільно закритими пробками і зберігають у морозильному відділені холодильника. В день постановки реакції свіжу або розморожену в одній пробірці сироватку крові титрують на пластинці для контролю якості емульсії і одержання слабопозитивного результату, який використовують потім протягом робочого дня як контроль.

Титрування сироватки крові проводять таким чином: в 9 лунок пластинки, починаючи з другої лунки, вносять по три краплі ізотонічного розчину натрію хлориду і добавляють до першої і другої лунки по три краплі позитивної сироватки крові. Вміст другої лунки перемішують Пастерівською піпеткою, насмоктуючи і випускаючи з неї в лунку 5-6 разів. Потім набирають частину вмісту другої лунки в Пастерівську піпетку і три краплі переносять до третьої лунки, а сироватку крові, що залишилася у піпетці, повертають до другої лунки. Вміст третьої лунки змішують так само і три краплі переносять до четвертої лунки. З останньої лунки три краплі вилучають. У всі лунки додають по одній краплі емульсії кардіоліпінового антигену. Пластинку струшують ручним способом або в апараті для струшування протягом 5 хвилин, додають по три краплі ізотонічного розчину натрій хлориду і залишають при кімнатній температурі на 5 хв., після цього реєструють результат. Розведення сироватки крові, що дало слабопозитивний результат (2+), використовують як слабопозитивний контроль. Для одержання його роблять відповідне розведення. Наприклад, якщо слабопозитивний результат одержано з розведенням сироватки крові 158, то для одержання контрольного розведення в пробірку вносять 0,7 мл ізотонічного розчину натрію хлориду і 0,1 мл позитивної сироватки крові і перемішують, при правильно проведеному титруванні, у позитивної сироватки крові, в міру її розведення, спостерігають рівномірне зменшення величини пластівців преципітату

Під час зниження реактивності контрольної сироватки крові яка зберігається, використовують розведення, що дає слабопозитивний результат при повторному титруванні. Контрольну сироватку крові можна використовувати доти, доки вона дає позитивний результат (4+) у розведенні не нижче, ніж 1:2, і слабопозитивний результат (2+) у розведенні не менше, ніж 1:4. Під час подальшого зниження реактивності позитивну контрольну сироватку крові, що використовують, замінюють новою.

Під час зберігання контрольних сироваток крові не допускають повторні заморожування і їхнє відтанення, оскільки в цьому випадку реактивність їх знижується.

Серологічні лабораторії шкірно-венерологічних диспансерів повинні постачатися контрольними сироватками крові через аптекоуправління. При відсутності контрольних сироваток крові реакцію ставити не можна.

5. Емульсію кардіоліпінового антигена готують з спеціального кардіоліпінового антигена для мікрореакціі преципітації, що випускає Харьківське підприємство по виробництву бактерійних препаратів Міністерства охорни здоров'я України (Харків, Померки, 84).

Не можна використовувати у мікрореакції кардіоліпіновий антиген, який застосовують - реакції зв'язування комплементу.

Перед приготуванням емульсії звертають увагу на прозорість ампульованого антигену. З випадінням кристалів холестерину, їх розчиняють нагріванням ампул у термостаті при 37 град. або 56 град. С.

Перш ніж приготувати емульсію, розраховують необхідну кількість її на робочий день або рабочий тиждень (на 500 досліджень потрібно 1 мл. кардіоліпінового антигену). До пробірки вносять сухою піпеткою не більше 2 мл. антигену, додаючи його до рівного об'єму 0,9% ізотонічного розчину натрію хлориду, змішують, залишають при кімнатній температурі на 30 хв., потім центрифугують при 1000 об/хв. до одержання прозорої надосадової рідини, яку відокремлюють, а до осаду додають 3,5 об'єму (по відношенню до взяття антигена) 10% розчину холін-хлориду. Наприклад, якщо потрібний об'єм антигену дорівнює 0,5 мл., то для вирахування кількості холін-хлориду 0,5 мл. множать на 3,5 і одержують 1,75 мл., тобто необхідний об'єм холін-хлориду. Пробірку щільно закривають пробкою і вміст її збовтують, перекидаючи пробірку, до повного ресуспензування. Одержана емульсія готова до використання. При необхідності виготовлення великої кількості емульсії її готують не в одному флаконі великої місткості, а в кількох пробірках, вносячи до кожної з них по 2 мл. антигену. Такі об'єми забезпечують краще змішування антигену, запобігають його забрудненню під час повторного взяття для постановки реакції, а також від нагрівання і дії сонячного проміння.

Емульсію антигену зберігають у холодильнику при 4 град. С не більше тижня, а з додаванням розчину мертиолату - протягом 2-х тижнів. У день постановки реакції потрібну для даного робочого дня кількість емульсії беруть з холодильника залишають для зігрівання при кімнатній температурі на 30 хв. і перевіряють її придатність на контрольних сироватках крові. Емульсію, яку використовують, необхідно захищати від світла, загорнувши пробірки з нею чорним папером. Придатність кожної нової серії антигену перевіряють експрес-методом одночасно зі старою серією на явно позитивних і слабопозитивних сироватках крові. Про придатність антигену судять по величині титрів, які спостерігають під час одночасного титрування позитивних сироваток крові з новою і старою серіями антигенів. Одержання близьких результатів - тобто величин титрів реагентів, які відрізняються на +- 1 розведення, однакового виявлення пластівців преципітації, які спостерігають в одних і тих самих розведеннях позитивних сироваток крові, слабо позитивних, а також відсутність преципітації у негативній сироватці крові свідчіть про придатність серії антигена, яку досліджують. Серію антигена бракують, якщо одночасно титрування контрольної позитивної сироватки з новою серією антигена показує: а) слабовиявлений преципітат (2+, 1+) при мінімальних розведеннях сироватки крові;

б) більш низький (на 2-3-и розведення) титр преципітатів, ніж зі старої серії;

в) наявність преципітату у негативних сироватках крові.

ОДЕРЖАННЯ ПЛАЗМИ КРОВІ. Кров беруть з пальця так само, як для дослідження швидкості осаду еритроцитів (ВІОЕ). Під час взяття крові змочують капіляр апарату Панченкова 5% розчином цитрату натрію, набравши розчину до помітки "0", повертають до флакону розчин до помітки "25", а цитрат натрію, що залишився, виливають до центрифужної або вассерманівської пробірки, куди потім вносять три капіляри крові, взятої до помітки "0", змішують. Кров відстоюють при кімнатній температурі, а в зкстренних випадках центрифугують з метою одержання плазми крові (експрес-метод), яку відсмоктують пастерівською піпеткою для проведення дослідження.

ОДЕРЖАННЯ ІНАКТИВОВАНОЇ СИРОВАТКИ КРОВІ. Кров беруть з вени, одержують сироватку крові і інактивують її так само, як і для РЗК.

Пастерівською піпеткою насмоктують плазму або інактивовану сироватку крові і вносять по три краплі у лунки, куди потім додають одну краплю емульсії кардіоліпінового антигена. До кожної лунки вносять плазму або інактивовану сироватку крові від одного обстежуваного і нумерують її згідно зі списком у реєстраційному журналі. Інгредієнти змішують струшуванням пластинки протягом 5 хвилин, потім до кожної лунки додають по три краплі ізотонічного розчину натрію хлориду, змішують погойдуванням пластинки і залишають при кімнатній температурі на 5 хвилин (оптимальний температурний режим реакції 23-28 град. С). Результати враховують лише після з'явлення пластівців у контрольній слабопозитивній сироватці крові, але не пізніше 7-10 хвилин від з'єднання інгредієнтів.

ОБЛІК РЕЗУЛЬТАТІВ РЕАКЦІЙ. Результати лічать неозброєним оком і над штучним джерелом освітлення. У лунках з плазмою і сироваткою крові, які взяли від хворих на сифіліс, осідають різні за розмірами пластівці. Появу великих пластівців розцінюють як позитивний результат (4+, 3+), середньої величини і дрібних - як слабопозитивний (2+, 1+).

При негативному результаті пластівці не утворюються. У сумнівному випадку необхідно орієнтуватися на контроль негативної сироватки крові. Якщо в ньому пластівці відсутні, а у зразках плазми або сироватки крові осіб, яких обстежують утворюються дрібні пластівці, результат в цьому випадку вважають сумнівним.

Кількісний метод мікрореакції дає змогу, не подовжуючи часу постановки реакції (15-30 хв.), об'єктивніше оцінити стан обстежуваних (рівень антитіл преципітантів) і використати його як критерій оцінки у динаміці лікування хворих на сифіліс.

Розведення сироватки або плазми одержують таким чином: в усі лунки плексигласової пластини розливають апаратом Флоринського по 0,15 мл (3-й краплі по 0.05 мл) сироватки або плазми. Змішують вміст лунки першого ряду і переносять апаратом Флоринського (можна і піпеткою з балончика) до наступного ряду лунок, потім змішують вміст другого ряду і переносять до 3-го ряду. Таким чином, переносять суміш ізотонічного розчину хлориду натрію і сироватки (плазми) до 4-го, 5-го, 6-го ряду лунок пластини. З останнього ряду лунок виливають по 0,15 мл і одержують розведення сироватки або плазми 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64. Реакцію вираховують по випаденню преципітату. Титром сироватки або плазми вважають те розведення, яке дає результат на 2+.

Обстеження хворих на сифіліс та осіб з псевдохибнопозитивними серореакціями паралельно РЗК і РМП з кардіоліпіновим антигеном показало, що певному титру РЗК відповідає певний титр РМП при використанні у реакції плазми або сироватці.

Так, під час дослідження сироватки крові титру РЗК 1:5 відповідає титр РМП 1:4 (від 2 до 4), титру РЗК 1:10 (від 2 до 8), титру РЗК 1:20-титр РМП 1:6 (від 2 до 4-8), титру РЗК 1:40 - титр РМП 1:8 (від 4 до 16), титру 1:80 - титр РМП 1:12 (від 8 до 16-32), титру РЗК 1::1б0 - титр РМП 1:18 (від 8 до 32), титру РЗК 1:320 - титр РМП 1:28 (від 16 до 32-64), титру РЗК 1:640 - титр РМП 1:44 (від 16-й до 64).

Слід відзначити більш високі титри РМП з плазмою, ніж з сироваткою крові.

Як у хворих на сифіліс, так і у осіб з хибнопозитивними серореакціями крові, зі збільшенням титру РЗК, відповідно, збільшується і титр РМП.

У хворих на первинний серопозитивний сифіліс позитивна мікрореакція передує РЗК, яка стає позитивною лише з початком лікування, а у хворих на сифіліс після лікування вона нерідко залишається позитивною у титрі від 2 до 4, протягом 2-3 місяців і після негативації РЗК. Мають місце випадки, коли якісна РМП була негативною у хворих на сифіліс при позитивній РЗК у титрі 1:80 і вище, а при кількісній постановці РМП вона була позитивною у тирі від 2 до 4 і вище. Це можна пояснити тим, Що при надто великих титрах преципітинів комплекс антиген-антитіло не утворився, оскільки було мало антигену на цю кількість антитіл. Показання для постановки кількісної РМП.

1. На прийомі у лікаря для встановлення титру РМП і відповідно приблизного тиру РЗК.

2. У динаміці для оцінки якості лікування хворих на сифіліс, що проводиться.

3. У тих випадках, коли РЗК неможливо поставити з технічних причин (відсутність електроенергії, реактивів).

Для виконання реакції зв'язування комплементу необхідні такі інгредієнти:

ДОСЛІДЖУВАНА СИРОВАТКА

Взяття крові проводять натщесерце або не раніше 6 годин після прийому їжі. Не можна брати кров у хворих з підвищеною температурою, після вживання спиртних напоїв раніше 24 годин, у тих, що нещодавно перенесли інфекційне захворювання, у жінок під час менструації, вагітних у останні 10 днів вагітності, породіль у перші 10 днів після пологів, новонароджених у перші 10 днів життя.

Кров з ліктьової вени у кількості 8-10 мл беруть у суху чисту пробірку. Пункцію проводять стерильною голкою, дотримуючись правил асептики. У грудних дітей кров беруть з надрізу вузьким скальпелем п'ятки.

До лабораторії кров має бути доставлена не пізніше 24 годин з моменту взяття при умові її зберігання у холодильнику при температурі 4 град. С.

Доставлену до лабораторії кров одразу після взяття вміщують у термостат на 15-30 хвилин при температурі 37 град. С. Згусток, що утворився, відділяють скляною паличкою від стінок пробірки і центрифугують 15 хвилин при 1000 об/хв. Над згустком утворюється прозора сироватка, яку за допомогою піпетки з гумовим балоном без домішки еритроцитів переносять у іншу пробірку. При наявності у сироватці крові домішки еритроцитів її центрифугують і зливають.

Кров, доставлена до лабораторії напередодні постановки реакції, обводять скляною паличкою і ставлять у холодильник при температурі 4 град. С. Перед постановкою реакції сироватку, що утворилася над згустком крові, переносять до іншої пробірки. Сироватка не повинна бути використана для постановки реакції у день взяття крові, лише через 24 години.

Зняту зі згустку сироватку інактивують у сухоповітряному інактиваторі або водяній бані протягом 30 хвилин при температурі 56 град. С для знищення природного комплементу і стабілізації глобулінових фракцій досліджуваної сироватки крові.

Інактивовані сироватки можуть зберігатися у морозилці холодильника протягом 5-6 днів. Сироватки, інактивовані напередодні, в день поставки реакції повинні бути повторно прогріті протягом 15 хвилин при температурі 56 град. С. Активні сироватки можуть зберігатися у морозилці холодильника протягом 1-го місяця (не допускаючи розморожування).

АНТИГЕНИ

Реакція Вассермана повинна ставитися з двома антигенами: ультразвуковим трепонемним і кардіоліпіновим.

Ультразвуковий трепонемний антиген готують з культур блідих трепонем, вирощених у пробірці, підданих дії ультразвуку.

Ультразвуковий трепонемний антиген випускають ліофільно висушеним у флаконі по 5-10 мл: зберігають його у холодильнику при температурі 4 град С.

Строк придатності антигену вказано на етикетці. Антиген розчинюють і розводять ізотонічним розчином натрію хлориду відповідно об'єму і титру, вказаному на етикетці флакона. Попередньо перед розведенням по титру необхідно збовтати завись протягом 30 хвилин. Цим досягають усунення парадоксальних результатів.

Кардіоліпіновий антиген для реакції Вассермана є очищеним від баластових сумішей спиртовий екстракт ліпідів з мускулів бичачого серця. Активність антигену обумовлена присутністю трьох компонентів - фосфоліпіду, лецетину і холестерину.

Кардіоліпіновий антиген випускають у ампулах по 2-а мл; зберігають його у темному місці при температурі не нижче 15-18 град С. Строк придатності антигену вказано на етикетці.

Перед вживанням антиген з ампули переносять у суху чисту пробірку, щільно закривають корковою або притертою скляною пробкою.

В разі випадання кристалів холестерину, антиген необхідно прогріти на водяній бані при температурі 56 град. С або у термостаті при температурі 37 град. С до повного розчину кристалів.

Для постановки реакції антиген розводять відповідно титру, указаному на етикетці ампули. Розведений антиген має бути злегка опалесцюючим, але не каламутним.

Титр - це кількість чистого антигену в 1-ому мл розчину. Наприклад, якщо титр ультразвукового трепонемного антигену 0,05, то для приготування 10 мл розведеного по титру антигену потрібно взяти 0.5 мл антигену і 9,5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду.

Подвійні дози антигенів не повинні володіти гемотоксичністю (гемоліз у відсутності комплементу), що установлюють відповідним контролем антигену при титруванні комплементу. Антигени не повинні бути антикомплементарними (придушення гемолізу), що також установлюють при паралельному титруванні комплементу без антигенів і в присутності антигенів, які застосовують у реакції зв'язування комплементу.

Розведені по титру антигени вводять у реакцію в кількості 0,5 мл під час роботи в об'ємі 1,25 мл.

Ця сироватка кролика або осла, імунізована еритроцитами барана.

Гемолітичну сироватку (рідна або суха) випускають в ампулах по 1 мл, вказуючи титр. Для розчинення сухого гемолізину в ампулу додають 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Гемолітичну сироватку як суху, так і розчинену зберігають у холодильнику при температурі 4 град. С. Строк придатності сухої гемолітичної сироватки вказано на етикетці.

Титр гемолітичної сироватки, яку застосовують для реакції, не повинен бути нижче 1:1200. Визначення титру проводять за такою схемою: готують основне розведення (0,1 мл гемолітичної сироватки + 9,9 мл ізотонічного розчину натрію хлориду), з якого роблять відповідні розведення (табл. N 1).