Про затвердження методичних вказівок з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів

Гнійні бактеріальні менінгіти (ГБМ) - група важких інфекційних захворювань, що поширені всюди. Захворюваність на менінгококову інфекцію й інші види ГБМ в Україні сягає 2000 випадків на рік при летальності до 14%. Основними збудниками ГБМ є бактерії видів Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae. Відносний внесок того або іншого виду бактерій у захворюваність ГБМ залежить від багатьох факторів: епідемічної ситуації, регіону, вікової групи хворих та інших. У ході багаторічного (2000-2003 р.р.) спостереження встановлено, що близько 30% випадків ГБМ в країні були менінгококової етіології (N. meningitidis), 6% - пневмококової етіології (S. pneumoniae), 2% випадків були викликані гемофільною паличкою типу b (Haemophilus influenzae типу b або Hib) і 16% - іншими бактеріями. Біля 46% захворювань залишаються нерозшифрованими.

Згідно з результатами експрес-оцінки тягаря хвороб, що викликаються Haemophilus influenzae типу b, яка була проведена в Україні місією ВООЗ в 2003 році, показник захворюваності на Hib-обумовлений менінгіт складає від 3,7 до 17,7 на 100000 дітей у віці молодше 5 років (80-240 випадків захворювань на рік), тобто щороку не діагностується від 2 до 10% випадків цього важкого захворювання.

Бактеріологічне підтвердження клінічного діагнозу менінгококової інфекції в Україні останні роки становить від 53% до 57,4% випадків обстежених лабораторно, з коливанням в різних регіонах країни від 14,5% до 87%.

Проведення серологічного типування менінгококів є вимогою стандарту ВООЗ з епіднагляду за менінгококовою інфекцією і вкрай важливе для епідеміологічного нагляду, організації та проведення протиепідемічних заходів, короткострокового і довгострокового епідеміологічного прогнозу, а також вирішення питань застосування засобів імунопрофілактики. Результати багаторічного моніторингу показують, що в останні роки зросла роль менінгокока серогрупи В, на долю якого припадає до 47%, менінгококи серогрупи А - 16%, групи С - 16%. Проте, серологічне типування в даний час проводиться застарілими методами і значна частка збудників залишається нетипованою.

Важливим питанням є впровадження в роботу лікувально-профілактичних закладів системи моніторингу антибіотикорезистентності збудників ГБМ, особливо пневмококів.

Аналіз якості лабораторної діагностики гнійних бактеріальних менінгітів свідчить про необхідність її суттєвого поліпшення, що потребує забезпечення лабораторій сучасними імунобіологічними препаратами, в першу чергу наборами для експрес діагностики, поживними середовищами гарантованої якості для первинного посіву матеріалу, тест-штамами для дослідження антибіотикорезистентності тощо, впровадження методів молекулярно-генетичних досліджень для виявлення та типування збудників гнійних бактеріальних менінгітів.

З метою удосконалення лабораторної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів НАКАЗУЮ:

1. Затвердити "Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів" (додаються).

2. Міністру охорони здоров'я АР Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Севастопольської міської, Головного управління охорони здоров'я та медичного забезпечення Київської міської держадміністрацій, Головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті:

2.1. Забезпечити своєчасну клінічну та мікробіологічну діагностику, ефективне лікування менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів у відповідності з затвердженими методичними вказівками.

2.2. Впровадити в практику роботи лікувально-профілактичних закладів систему мікробіологічного моніторингу антибіотикорезистентності збудників ГБМ, в першу чергу пневмококів.

2.3. Координацію робіт з лабораторної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів, здійснення мікробіологічного моніторингу антибіотикорезистентності покласти на бактеріологічні лабораторії епідеміологічних відділів закладів державної санітарно-епідеміологічної служби.

2.4. Забезпечити лабораторії лікувально-профілактичних закладів та установ державної санітарно-епідеміологічної служби необхідним переліком діагностичних імунобіологічних препаратів, тест-штамами для дослідження антибіотикорезистентності.

2.5. Інформацію про виконання цього наказу щороку надсилати до Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України до 1 лютого.

3. Головному лікарю Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України, головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті:

3.1. Забезпечити організаційно-методичне керівництво з лабораторної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів, узагальнення та аналіз якості досліджень, результатів мікробіологічного моніторингу антибіотикорезистентності у регіоні та підготовку спеціалістів.

3.2. Забезпечити збір штамів збудників менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів, їх підтвердження, типування, щорічний аналіз етіологічної структури та антибіотикорезистентності.

4. Вважати такими, що не застосовуються на території України:

"Методические указания по микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов", додаток 3 до Наказу Міністерства охорони здоров'я СРСР від 1 грудня 1988 року № 858 "О мерах по усовершенствованию лечебно-диагностических и профилактических мероприятий в борьбе с менингококковой инфекцией и введению эпидемиологического надзора".

"Методические рекомендации по выделению и идентификации микробов рода Haemophilus", які затверджені начальником Головного управління карантинних інфекцій МОЗ СРСР 25.06.79 № 283-84.

5. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду (Мухарську Л.М.), начальника Управління організації медичної допомоги дітям та матерям (Моісеєнко Р.О.), директора Департаменту організації та розвитку медичної допомоги населенню (Тарана В.М.).

Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів встановлюють єдиний порядок відбору, транспортування клінічних зразків, та проведення лабораторних досліджень з метою діагностики та профілактики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів.

Методичні вказівки можуть бути використані в роботі усіма установами охорони здоров'я на території України незалежно від їх відомчої належності і форм власності, а також юридичними і фізичними особами, що проводять лабораторні дослідження з метою діагностики та профілактики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів.

Лабораторна діагностика менінгококової інфекції (МІ) та гнійних бактеріальних менінгітів (ГБМ) здійснюється наступними методами:

- бактеріологічним - шляхом виділення, ідентифікації збудника, та вивчення його чутливості до антибіотиків;

- імунологічним - шляхом виявлення специфічних антигенів в рідинах організму (ліквор, кров та ін.) або антитіл у сироватці крові (додаток 3);

- молекулярно-генетичним - шляхом виявлення специфічних фрагментів ДНК збудника.

Матеріалом для бактеріологічного дослідження можуть бути: спинномозкова рідина (СМР), кров, ексудат із петехій, слиз із задньої стінки носоглотки, трупний матеріал.

Лабораторні обстеження проводять з діагностичною, профілактичною метою та за епідеміологічними показаннями. З діагностичною метою обстежують хворих та з підозрою на гнійні бактеріальні менінгіти, в тому числі на менінгококову інфекцію. За епідеміологічними показаннями обстежують осіб, що були в контакті з хворими на менінгококову інфекцію. З профілактичною метою обстежують групи ризику з метою визначення масивності циркуляції менінгококів та домінуючих серогруп збудника.

Незалежно від природи збудника клінічні прояви менінгітів відносно постійні і в діагностиці уражень та тактиці лікування особливе значення мають результати лабораторного виділення етіологічного агента. Основними збудниками гнійних бактеріальних менінгітів вважають Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. Крім того, описані випадки захворювання на гнійні менінгіти, викликані Listeria monocytogenes, ентеробактеріями (Escherichia coli, Salmonella spp., Klebsiella pneumoniae, Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens та ін.), патогенними грибками, Leptospira, Mycoplasma. У дітей раннього віку та осіб з ослабленою імунною системою гнійні менінгіти можуть бути спричинені, крім названих груп мікроорганізмів, представниками умовно-патогенної та опортуністичної мікрофлори (стафілококами, стрептококами, ацинетобактерами, псевдомонадами та ін.).

2.1. Мікроорганізми роду Neisseria

За "Визначником бактерій Берджі" (IX видання, 1994) рід Neisseria належить до "Групи грамнегативних аеробних та мікроаерофільних паличок і коків". Представники роду Neisseria є сферичними бактеріями (крім N. elongata, яка є паличкою), які формують пари; вони нерухливі, оксидазопозитивні, каталазопозитивні (крім N. elongata), деякі з них утворюють жовтий пігмент, відновлюють нітрати (крім N. gonorrhoeae та N. canis). Патогенними для людини є N. meningitidis та N. gonorrhoeae. Крім того, від людини можуть виділятись N. N. subflava, sicca, mucosa, flavescens, lactamica, cinerea, elongata, які є резидентною флорою слизових оболонок.

Neisseria meningitidis - збудник менінгококової інфекції з характерним ураженням слизової оболонки носоглотки з подальшою генералізацією у вигляді менінгококової септицемії (менінгококцемія) та запалення м'яких мозкових оболонок (менінгококовий менінгіт).

Менінгококи - грамнегативні диплококи, що складаються з двох бобовидних коків, які лежать увігнутими сторонами один до одного. Вони не мають спор, іноді утворюють ніжну капсулу. Часто розташовуються всередині лейкоцитів (але зустрічаються і поза клітиною). В мазках із культур можуть розташовуватись по одному, попарно і по чотири.

Для цих бактерій при вирощуванні на штучних середовищах характерний поліморфізм - вони змінюють розмір, форму, а при фарбуванні за Грамом можуть набувати різної інтенсивності забарвлення клітин, особливо при тривалому культивуванні. Виявлення чіткішого ставлення до забарвлення за Грамом можна досягти при використанні методики забарвлення за Грамом в модифікації Калини.

Менінгококи - аероби, ростуть при температурі (37 +/- 1) град. С і рН середовища 7,2-7,6. Характеризуються високою потребою в ростових факторах, яка покривається внесенням до поживного середовища крові або сироватки ссавців. Як джерело вуглецю та азоту, менінгококи використовують амінокислоти. Для росту вони вимагають щойно приготованих середовищ. Культивування менінгококів проводять при підвищеній концентрації СО2 в атмосфері  вирощування (5-10%).

Ферментативні властивості менінгококів виражені слабо; серед вуглеводів вони здатні розщепити лише глюкозу і мальтозу.

При руйнуванні бактеріальних клітин звільняється сильний ендотоксин - ліпополісахаридний комплекс, який, викликаючи каскад реакцій організма у відповідь, може призвести до розвитку інфекційно-токсичного шоку.

Менінгокок не стійкий до дії зовнішніх факторів і досить швидко гине, а при низькій температурі губить здатність до утворення колоній. Тому, при доставці матеріалу в лабораторію необхідно запобігати його охолодженню! При нагріванні до 60 град. С менінгокок гине через 10 хвилин, кип'ятіння вбиває його за 30 секунд, аналогічний ефект дає ультрафіолетове опромінення. Бактерії чутливі також до дезінфікуючих речовин: 1% розчин фенолу викликає загибель N. meningitidis протягом 1 хвилини, так само діють на них 0,5-1% розчини хлораміну, 70% етанол, 3-5% розчини карболової кислоти.

Класифікація менінгококів базується на відмінностях в структурі полісахаридів капсули; виділяють серогрупи A, B, C, X, Y, Z, Z'(29E), W135, а також H, I, K та L.

Зверніть увагу: серогрупа D в даний час не визнана.

Існують певні епідеміологічні особливості в захворюваннях, що викликаються менінгококами різних серогруп. Серогрупи A, B, C, W135 та Y найчастіше викликають менінгіт. У більшості країн менінгококова інфекція, викликана менінгококами серогрупи В, типовіша для дітей до 5 років, а випадки захворювання, викликаного менінгококами серогруп С і А, частіше спостерігаються у віковій групі від 15 до 25 років. Менінгококи серогрупи С - найчастіша причина епідемій у Африці та Азії.

Проте, перебіг менінгококової інфекції і її лікування практично не залежать від серогрупи штаму-збудника. Істотним виключенням з цього правила є захворювання, викликані менінгококами "рідких" серогруп (W135, Y, X) і може вказувати на наявність у пацієнта вродженого дефіциту термінальних компонентів комплементу, різко знижену резистентність до менінгококової інфекції і можливість повторних захворювань.

2.2. Мікроорганізми роду Haemophilus

Рід Haemophilus належить до родини Pasterellaceae, налічує 15 видів (за "Визначником бактерій Берджі" (IX видання, 1994). Представники роду являють собою дрібні (до 0,3 мкм) поліморфні нерухливі кокобактерії або палички (іноді коки, ниткоподібні бактерії), не здатні утворювати спори. За Грамом забарвлюються негативно, належать до факультативних анаеробів. Для свого росту вимагають спеціальних факторів: X (протогем або протопорфірин) та V (никотинамідаденіндинуклеотид (NAD) або NAD-фосфат).

Фактор X міститься в еритроцитах у вигляді термостабільної групи тетрапіролів, які входять до складу гематину та геміну та синтезується деякими мікроорганізмами (сарцини, стафілококи). Фактор V - термолабільний кофермент, який є складовою частиною вітамінів групи В. Обидва ці фактори присутні в крові, однак, у нативній крові барана або людини знаходяться ферменти (НАДази), здатні руйнувати V фактор. Тому V залежні гемофіли не ростуть або дають бідний ріст на кров'яному агарі.

Деякі види гемофільних бактерій патогенні для тварин і здатні викликати у них захворювання, інші - для людини. Із організму людини виділено 9 видів гемофілів, із них патогенними є H. influenzae та H. ducreyi (збудник м'якого шанкеру).

H. influenzae - типовий вид роду - каталазопозитивні, оксидазоваріабельні, редукують нітрати, розщеплюють глюкозу, мають уреазу, деякі штами виділяють індол, не утворюють сірководень. Обов'язковою умовою для росту є наявність у поживному середовищі свіжої крові (коня, барана), але самостійно H. influenzae нездатні лізувати еритроцити, тому, для вивільнення необхідних факторів росту, клітини крові руйнують при приготуванні поживного середовища (див. Методику приготування "шоколадного агару", середовища Левінталя). Антигенна структура H. influenzae включає антигени двох типів - капсульні і соматичні. За капсульним антигеном їх поділяють на 6 серотипів (a, b, c, d, e, f), які визначають при серотипуванні в РА з політиповими та монотиповими сироватками. Наявність капсули є основним фактором вірулентності. Більшість інвазивних інфекцій викликається штамами H. influenzae типу b (Hib). Капсула Hib складається із полірибозилрибітолфосфату (ПРФ), тобто містить у якості мономеру пентозу (рибозу) на відміну від інших типів, які містять гексозу, це, ймовірно, і визначає більш високий рівень їх вірулентності. Безкапсульні штами позначають як такі, що не типуються.

2.3. Пневмококи

S. pneumoniae є представником роду Streptococcus, родини Streptococcaceae, до якого належать грампозитивні, каталазо- і оксидазонегативні бактерії сферичної форми (коки) ледь видовжені (ланцетовидні). В мазках з нативного матеріалу розташовуються парами, кожна з яких оточена товстою капсулою. Капсула утворюється в живому організмі, а тому мікроскопія мазків з нативного матеріалу має діагностичну цінність. На простих поживних середовищах капсула утворюється тоненька, але її розвиток стимулює додавання крові або сироватки до поживного середовища. У мазках з поживних середовищ можуть розташовуватись ланцюжками і бути більш округлої форми. Пневмококи нерухливі, спор не утворюють. Структура клітинної стінки пневмококів типова для грампозитивних бактерій; для них характерна наявність потужної полісахаридної капсули, яка оберігає мікроорганізм від опсонізації та фагоцитозу. Вони є факультативними анаеробами, росту яких сприяє підвищена концентрація вуглекислого газу в атмосфері інкубації до 5-7%. Добре ростуть на кров'яних або сироваткових середовищах, доповнених 0,1% глюкозою. Здатні до лізису еритроцитів, викликаючи альфа-гемоліз на кров'яному агарі (КА). Оптимум росту 37 град. С. У присутності 6,5% NaCl не ростуть, чутливі до жовчі та оптохіну. Ферментативною активністю не відзначаються: здатні розщеплювати з утворенням кислоти лактозу, рафінозу, трегалозу; можуть утворювати альфа-галактозидазу. Вид S. pneumoniae серологічно не однорідний: за антигенами капсульних полісахаридів розрізняють 84 серотипи. Для серотипування пневмококів слід використовувати комерційні тест-системи для латекс-аглютинації та коаглютинації, які виявляють капсульний антиген.

Відбір клінічних зразків - важливий етап в ізоляції й ідентифікації бактеріальних агентів, які спричинили менінгіт. Клінічні зразки повинні бути отримані перш, ніж почата антимікробна терапія, щоб уникнути втрати життєздатності етіологічних агентів. Відібраний для дослідження матеріал повинен бути взятий в роботу в бактеріологічній лабораторії якомога швидше.

Спинномозкова рідина (СМР). Із спинномозкового каналу, лікар за допомогою люмбальної (міжхребетної) пункції стерильно, дотримуючись правил асептики, відбирає СМР в день госпіталізації хворого. Відбирають матеріал у 3 стерильні пробірки (по 1 куб. см мінімум; при можливості, по 3-4 куб. см): пробірка № 1 для біохімічних досліджень (визначення білка та глюкози); пробірка № 2 для бактеріологічних досліджень і пробірка № 3 для цитологічних досліджень (підрахунок клітин) і доставляють в лабораторію не пізніше 2 годин після забору. Якщо негайно доставити ліквор в лабораторію неможливо, то як виключення, його слід посіяти на чашки з шоколадним і кров'яним агарами та декілька крапель внести в середовище для контролю стерильності (тіогліколеве). Помістити посіви в термостат з температурою (37 +/- 1) град. С і намагаються негайно відправити до лабораторії, але не пізніше 3-х годин після забору матеріалу. Замість середовища для контролю стерильності ВООЗ рекомендує використовувати триптиказо-соєвий бульйон з 0,025% натрію поліанетолсульфонату (Laboratory Manual for the Diagnosis of Meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. WHO/CSR/EDC/99.7/)

Під час зберігання і транспортування відібраний матеріал оберігають від охолодження і висихання. Доставка здійснюється в контейнері з грілкою або в термосі.

Слиз носоглотки. Матеріал беруть натще або не раніше 2 годин після останнього прийому їжі. Для відбору матеріалу використовують стерильний ватний тампон закріплений на дротині, загнутий під кутом 135 град. ще до стерилізації. Шпателем, тримаючи його в лівій руці, притискають корінь язика, а правою рукою вводять тампон загнутим кінцем догори під м'яке піднебіння в носоглотку і легкими горизонтальними рухами зігнутого тампона під м'яким піднебінням збирають виділення - слиз. Витягати тампон треба дуже обережно, щоб не зачепити язик, щоку і не торкнутися зубів.

Відібраний носоглотковий слиз може бути засіяний на місці його взяття на відповідні поживні середовища (див. табл. 1), матеріал втирають в середовище з усієї площі тампона з подальшим розсівом бактеріологічною петлею для отримання ізольованих колоній по усій площі чашки. Оскільки слиз носоглотки містить різноманітну мікрофлору, яка може пригнітити ріст менінгококів, то до сироваткового агару (СА) додають антибіотики, що пригнічують ріст грампозитивних мікроорганізмів (ристоміцин або лінкоміцин).

Засіяні чашки доставляють в лабораторію, ретельно захищаючи їх від охолодження та висихання.

При дослідженні за епідпоказаннями та з профілактичною метою сіють матеріал на сироватковий агар з антибіотиками.

Відібраний слиз носоглотки може бути доставлений в лабораторію і на тампоні, який занурюють в пробірку з транспортним середовищем або середовищем збагачення. Крім того, матеріал можна відбирати на змочені тампони, які потім доставляють в лабораторію. При транспортуванні слизу носоглотки на короткі відстані (1-2 години їзди до лабораторії) використання транспортних середовищ не рекомендується. При транспортуванні протягом 2-2,5 годин доцільно використання змочених тампонів. Для транспортування протягом 3 годин і більше доцільно використання транспортного середовища.

Кров. Об'єм крові необхідний для бактеріологічного дослідження залежить від віку пацієнта: у дітей раннього віку (до 2 років) відбирають 1-2 куб. см, у старших дітей (до 14 років) - 2-5 куб. см, у підлітків та дорослих - 5-10 куб. см. Стерильно з ліктьової вени беруть відповідний об'єм крові. Декілька крапель засівають на чашки СА, КА та ША, а решту матеріалу - у флакон з 0,1% напіврідким агаром або тіогліколевим середовищем у співвідношенні 1:10. Замість середовища для контролю стерильності ВООЗ рекомендує використовувати триптиказо-соєвий бульйон з 0,025% натрію поліанетолсульфонату (Laboratory Manual for the Diagnosis of Meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. WHO/CSR/EDC/99,7/). Одночасно роблять мазок та "товсту краплю" крові для бактеріоскопічного дослідження. Чашку і флакон доставляють в лабораторію, оберігаючи від охолодження.

Ексудат із петехій. Шкіру навколо петехії обтирають 70 град. спиртом. Набирають в шприц з тонкою голкою 0,1-0,2 куб. см фізіологічного розчину, який вводять в товщу петехії і відсмоктують назад. Зачохлюють голку і передають шприц з матеріалом до лабораторії, ретельно оберігаючи його від охолодження.

Трупний матеріал (кров, ліквор, шматочки мозку, уражені ділянки мозкових оболонок, уражень шкіри і т.і.), враховуючи низьку життєздатність менінгокока, є сенс брати для дослідження тільки в перші години після смерті, поки труп ще не захолов. За даними літератури на тканинах, до яких менінгокок має тропність, збудник може зберігатись у темноті до 4-5 діб.

Кров беруть стерильно із правого серця, після розтину скальпелем, за допомогою стерильної піпетки з грушею в кількості 7-10 куб. см. Із них 2-3 куб. см засівають в 25 куб. см 0,1% напіврідкого агару або тіогліколевого середовища, на СА, КА та ША, а залишки 5-7 куб. см використовують для інших досліджень (серологічних, в реакції зустрічного імуноелектрофорезу та ін.). Для посівів можна використовувати також згустки крові із великих судин.

Ліквор беруть стерильною піпеткою із міжоболонкового простору (під час виймання головного мозку з порожнини черепа), в стерильну пробірку в кількості 3-5 куб. см і негайно висівають на чашки з поживними середовищами (ША та КА). 0,1 куб. см досліджуваного матеріалу наносять в центр чашки і розподіляють по її поверхні похитуючи. Розтирати шпателем не рекомендується.

Бактеріологічні дослідження ліквору та крові проводять за описаною схемою. Треба мати на увазі, що ріст на чашках може бути змішаним із-за попадання іншої мікрофлори, тому до загальноприйнятого набору поживних середовищ треба додати чашку сироваткового агару з антибіотиком (ристоміцин, лінкоміцин).

Матеріал з мозкових оболонок беруть стерильним ватним тампоном і засівають газоном або штрихами на чашки з "шоколадним" та сироватковим агаром та в пробірку із середовищем збагачення, роблять 2 мазки, один з яких фарбують метиленовим синім, інший - за Грамом в модифікації Калини.

Для взяття матеріалу з мозку та інших органів до місця розрізу торкаються розжареним шпателем, матеріал беруть з глибини розрізу стерильним ватним тампоном. Посів проводять звичайним способом на ті ж тверді та рідкі поживні середовища. Культури, що виросли, диференціюють за описаною схемою (Таб. 2).

Крім посівів з мозку, доцільно проводити вивчення мазків-відбитків з поверхні м'яких мозкових оболонок. Після підсушування та фіксації у суміші Нікіфорова, мазки фарбують та переглядають.

Для серологічного дослідження використовують парні сироватки крові одержані: при госпіталізації (сироватка № 1) та на 10-15 дні від початку захворювання (сироватка № 2).

Контейнери з пробами чітко маркують, скріпляють разом від кожної особи і позначають номер у відповідності з направленням (ф. 204/О), з обов'язковим зазначенням дати і часу відбору матеріалу, прізвища лікаря і номера телефону, за яким можна сповістити про попередній результат дослідження.

Спинномозкова рідина (СМР). Мікробіологічне дослідження ліквору складається з бактеріоскопії мазка, виділення збудника та його ідентифікації, серологічної детекції антигенів у СМР. Ліквор досліджують негайно після доставки в лабораторію. Якщо рідина мутна, посів здійснюють без попередньої підготовки. Прозору рідину центрифугують 5 хвилин при 3000 об/хв, осад висівають та мікроскопують. З матеріалу готують мазок, висушують на повітрі, фіксують сумішшю Нікіфорова протягом 5 хвилин і фарбують метиленовим синім або за Грамом в модифікації Калини. Не можна фіксувати мазки в полум'ї пальника або спиртівки!

Бактеріоскопічне дослідження проводять уважно, ретельно переглядаючи як мінімум 20 полів зору, або до того часу, поки бактерії не будуть виявлені. Пряма мікроскопія дозволяє встановити наявність бактерій, що викликали захворювання.

N. meningitidis можуть розташовуватись поза клітиною або всередині лейкоцитів, за Грамом забарвлюються негативно, виглядають як диплококи схожі на зернини кави.

H. influenzae в мазках - дрібні грамнегативні кокобактерії або палички, схильні до поліморфізму, оточені ледь помітною ніжною капсулою, розташовані у вигляді коротких ланцюжків або ниток.

Пневмококи мають вигляд ланцетовидних диплококів та коротких ланцюжків, утворюють капсулу; вони грампозитивні, добре фарбуються усіма аніліновими барвниками, при цьому капсула залишається безбарвною і помітна тільки на забарвленому фоні.

Опис морфології інших бактерій викладений у відповідних нормативних документах та довідниках.

Виявлення в мазках типових менінгококів або інших мікроорганізмів є підставою для видачі попередньої відповіді, про що негайно інформують лікаря лікувально-профілактичної установи.

Виділення збудника. Стерильною пастерівською піпеткою з дна пробірки беруть 0,3-0,5 куб. см матеріалу і по 2-3 краплі засівають: на сироватковий, 5% кров'яний, "шоколадний" (або середовище Левінталя) агари і на середовище для контролю стерильності. При необхідності, в залежності від результатів мікроскопії осаду, можна додатково зробити посів на середовища ЖСА і Ендо. Така різноманітність середовищ, що використовується для первинного посіву СМР дозволяє прискорити виділення мікроорганізмів, які можуть бути чинниками бактеріальних менінгітів. Посіви поміщають в термостат при температурі (37 +/- 1) град. С і створюють умови з підвищеною концентрацією СО 2 (5-10%).

При наявності достатньої кількості СМР рекомендується 2-3 краплі засіяти на чашку з АГВ або середовищем Мюллер-Хінтона і визначити чутливість мікроорганізма до антибіотиків.

Решту СМР використовують для проведення серологічних досліджень (коаглютинація, латекс-аглютинація, імуноферментний аналіз, ЗІЕФ), полімеразної ланцюгової реакції, тощо та для посіву у середовище збагачення (4 куб. см 0,1% напіврідкого агару з 1 куб. см сироватки). Посіви СМР витримують у термостаті до 7 діб при температурі (37 +/- 1) град. С з періодичними висівами на тверді поживні середовища.

Через 24 години візуально та за допомогою стереоскопічного мікроскопа переглядають усі чашки з посівами незалежно від результатів попередньої бактеріоскопії ліквору. Чашки без росту інкубують ще добу. До уваги беруть усі різновиди колоній.

Менінгокок на сироватковому агарі утворює плоскі, круглі з рівним краєм, ніжні колонії з опалесценцією розміром 2-3 мм. На "шоколадному" та кров'яному агарах його колонії ніжні, сіруватого кольору, з блискучою поверхнею та рівними краями, мають маслянисту консистенцію, розмірами до 3,0 мм. Менінгококи не змінюють кольору середовища.

Гемофіли на "шоколадному" агарі дають досить пишне розростання, їм притаманний різкий специфічний запах індолу. Колонії сірого кольору, плоскі, діаметром 0,2-2,0 мм, легко знімаються з середовища. На кров'яному агарі через добу з'являються дрібні прозорі колонії, схожі на краплинки роси або взагалі ріст може бути відсутнім. На МПА та сироватковому агарі H. influenzae не росте.

Колонії пневмококів на кров'яному, як і на "шоколадному" агарі, дрібні (діаметром 0,1-1,0 мм), сіруваті, плоскі, іноді з вдавленим центром, оточені зоною альфа-гемолізу. За зовнішнім виглядом колонії пневмококів важко відрізнити від колоній стрептококів групи В, інших "зеленячих" стрептококів - SS. mitis, oralis, sanguis, parasanguis, gordonii та ентерококів (E. faecalis), які в деяких випадках можуть викликати менінгіт, особливо у дітей до 1 року. На сироватковому агарі пневмококи утворюють дрібні, ніжні ледь жовтуваті колонії. Пневмококи при рості на кров'яному агарі можуть давати декілька типів колоній, що залежить від того, на скільки виражена капсула. Колонії пневмокока з розвинутою капсулою можуть мати декілька міліметрів в діаметрі і бути настільки слизистими, що нагадують краплину олії на поверхні агару. Їх розпізнавання не викликає труднощів. Штами, у яких не виражена капсула, дають колонії невеликих розмірів і їх виділення пов'язане з певними труднощами. При перегляді цих колоній у стереоскопічний мікроскоп можна розгледіти характерні морфологічні особливості росту цього мікроорганізма: сіруватий відтінок колоній, випукла поверхня і волога "сметаноподібна" консистенція. При тривалому інкубуванні (48 годин і більше) центральна частина колонії може опуститись, надаючи їй характерну блюдцеподібну форму (це, певною мірою, пояснюється дією аутолізинів пневмокока). Деякі штами можуть давати абсолютно сплющені колонії.

Останнім часом спостерігаються поодинокі випадки та спалахи гнійних менінгітів, які викликані піогенним стрептококом (S. pyogenes). Колонії цього збудника легко відрізнити від інших стрептококів по зоні бета-гемолізу на кров'яному агарі.

Великі (3-5 мм) колонії, які містять в собі грамнегативні палички, слід запідозрити у належності до ентеробактерій та псевдомонад.

Гриби роду Candida ростуть на всіх середовищах, не змінюючи кольору агару з кров'ю.

Мікроорганізми роду Acinetobacter добре ростуть на кров'яному і сироватковому агарах, а також на поживних середовищах без додавання нативного білка. Утворюють великі, білі, круглі й блискучі, часто слизисті колонії, на середовищах з кров'ю можуть давати зону гемолізу.

Для визначення чистоти культури та подальшого шляху ідентифікації готують мазки, фарбують за Грамом, ставлять реакцію з 3% розчином КОН та перші найпростіші біохімічні тести на оксидазу, каталазу (при підтвердженні чистоти культури), а також відсівають колонії на елективні середовища для накопичення чистої культури для подальшої ідентифікації.

Ідентифікація збудника менінгіту. Враховуючи характер росту, морфологію клітин і результати вказаних біохімічних тестів, вирішують ймовірну належність вирощеного мікроорганізму до того чи іншого роду й обирають шлях подальшого його вивчення й ідентифікації.

В таблиці 2 підсумовано мінімальну кількість ознак, достатніх для того, щоб виділені бактерії попередньо зарахувати до того або іншого таксону й обрати подальший шлях ідентифікації. На цьому етапі можлива видача попередньої відповіді.

Колонії, підозрілі на менінгокок, відсівають на СА для отримання та накопичення чистої культури, яку в подальшому ідентифікують за характерними властивостями та вивчають її чутливість до антибіотиків. Для диференціації N. meningitidis і B. (M) catarrhalis культуру відсівають у дві пробірки з СА та одну - з поживним агаром (МПА). Посіви на СА вирощують паралельно при температурі (37 +/- 1) град. С та (22 +/- 1) град. С, на МПА - при (37 +/- 1) град. С. Одночасне культивування виділеного збудника на МПА і СА є простим і надійним тестом, що дозволяє диференціювати Neisseria meningitidis, не здатну рости на СА при (22 +/- 1) град. С та на МПА при (37 +/- 1) град. С, від схожої на неї B. (M) catarrhalis. Вивчають біохімічні властивості нейсерій: відсутність росту на агарі з 0,2% вмістом жовчі або затримка росту навколо дисків з жовчу; активність у відношенні до вуглеводів (глюкози, мальтози, сахарози, фруктози, лактози); редукція нітратів; здатність утворювати полісахарид на середовищі з 5% вмістом сахарози (додаток 1).

Чиста культура, що підозрюється в належності до виду N. meningitidis, підлягає серогрупуванню за допомогою реакції аглютинації з менінгококовими сироватками.

Колонії, підозрілі на пневмокок та інші стрептококи, відсівають на КА для вивчення характеру гемолізу та чутливості до жовчі та оптохіну (Табл. 3). Крім того, за допомогою полівалентної пневмококової сироватки можна виявити пневмококові капсульні полісахаридні антигени. Для прискореного виявлення пневмокока безпосередньо із чашки первинного посіву використовують реакцію латекс-аглютинації.

Колонії, підозрілі на H. influenzae, відсівають для вивчення потреби в X та V факторах, характерної ознаки для цього виду мікроорганізму. Для цього відібрані і вирощені на ША колонії суспендують у поживному бульйоні або пептонній воді (Дотримуйтесь максимальної обережності, не допускаючи попадання шматочків середовища до суспензії, оскільки навіть маленька часточка агару може схибити результат!). Суспензію висівають петлею великого діаметра на чашку з МПА, потім на посів викладають смужки або диски з X, V та XV факторами. H. influenzae виростає тільки навкруг дисків з XV факторами.

Крім того, вивчити потребу в X та V факторах можна іншим шляхом.

1) Визначення здатності до сателітного росту (метод так званих "годівниць"). Для цього на чашку з КА засівають досліджувану культуру, а на поверхню зробленого посіву висівають 3-4 "бляшки" S. aureus. Якщо спостерігається ріст на КА навколо колонії гемолітичного S. aureus, досліджуваний мікроб належить до Haemophilus spp.

2) Тест з сапоніном. Досліджувану культуру інокулюють в ізотонічному розчині натрію хлориду, засівають на поверхню 5% КА. На посів кладуть диски з сапоніном та інкубують чашки 24-48 годин при температурі 37 +/- 1 град. С і 5-10% СО2 в атмосфері вирощування. Наявність росту навколо диску з сапоніном і відсутність такого поза зоною гемолізу вказує на належність досліджуваного мікроорганізма до родини Haemophilus.

Для ідентифікації H. influenzae, крім потреби в X- та V-факторах, наявності каталази, оксидази, вивчають наявність бета-галактозидази, уреази, нітратредуктази та здатність до індолоутворення.

На основі тестів на продукцію індолу, уреазну і орнітиндекарбоксилазну активність розрізняють 8 біотипів (див. таблицю 5).

При підозрі на ентеробактерії, синьогнійну паличку, піогенний стрептокок, стафілокок та ацинетобактер проводять дослідження згідно з відповідними нормативними документами.

При підозрі на лістерії, якщо дозволяє кількість колоній, проводять низку досліджень, а також тест на чутливість до антибіотиків. Для L. monocytogenes, крім ознак, вказаних в табл. 2, є характерним: рухливість при кімнатній температурі, здатність розкладати мальтозу, глюкозу, не активність у відношенні до дульциту, маніту, сорбіту та арабінози. Сахарозу та гліцерин розкладає повільно. L. monocytogenes утворює крайову зону гемолізу на агарі з 5%-ним вмістом баранячої крові.

Для ідентифікації Candida albicans роблять посів з підозрілих білих випуклих колоній на середовище Сабуро та картопляну воду для визначення філаментації.

Якщо прямий посів на чашки з поживним середовищем не дав росту колоній, то слід зробити висів на чашки з КА та ША із збагачувального середовища, що інкубувалося в термостаті.