Про затвердження методичних вказівок з мікробіологічної діагностики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів

При менінгіті в СМР виявляється, як правило, один вид мікроорганізмів, мікст-інфекція мозкових оболонок зустрічається вкрай рідко. Тому, з метою прискорення видачі результату, на другий день одночасно можна робити висіви з однотипних колоній на середовище для отримання чистої культури та на диференційно-діагностичні середовища, вивчення культури за низкою ознак та на чутливість до антибіотиків.

Кров. Засіяні флакони з кров'ю поміщають в термостат при температурі (37 +/- 1) град. С на 24 години.

При наявності росту у поживних середовищах первинного посіву - мікроскопують. В залежності від результатів бактеріоскопії висівають із флаконів на СА, КА чи ША. Чашки інкубують при температурі (37 +/- 1) град. С в ексикаторах зі свічкою. Облік результатів посіву на СА, КА чи ША проводять так, як описано у розділі щодо дослідження ліквору.

Переглядають чашки з посівами. При відсутності росту висівають щодня або через день із флаконів з відібраним матеріалом, що інкубується, протягом тижня. При наявності підозрілих колоній відсівають їх для отримання чистої культури. Подальшу ідентифікацію гемокультури проводять як і при дослідженні СМР. Вивчають чутливість виділених мікроорганізмів до антибіотиків.

Слиз носоглотки. Доставлені засіяні чашки та тампони, занурені в напіврідке середовище, поміщають в термостат при температурі (37 +/- 1) град. С.

Змочені тампони або тампони в транспортному середовищі (попередньо відтиснувши об стінки пробірки) засівають на чашку з СА, ША та КА. Засіяні чашки переносять на 24 години у термостат з температурою (37 +/- 1) град. С, створивши для них умови підвищеного вмісту СО2 . На другий день переглядають чашки, засіяні напередодні, візуально та під стереоскопічним мікроскопом. При наявності росту мікроскопують підозрілі колонії і відсівають для отримання чистої культури і в подальшому ідентифікують її. При відсутності росту на чашках проводять повторний перегляд їх через 40-48 годин від посіву, і роблять висів з напіврідкого середовища збагачення.

Подальшу ідентифікацію проводять як і при дослідженні СМР. Вивчають чутливість виділених мікроорганізмів до антибіотиків.

Ексудат із петехій. Відібраний матеріал засівають на чашки Петрі з СА, що містить антибіотики (ристоміцин або лінкоміцин) для пригнічення росту мікрофлори шкіри. Із залишку ексудату готують мазки для мікроскопії. Крім того, мазки із вмісту петехій можна приготувати у вигляді відбитків. Для цього стерильною петлею обережно скарифікують поверхню петехій, потім прикладають кількома місцями стерильне предметне скло; відбитки фіксують полум'ям пальника, фарбують. На підставі даних мікроскопії можлива видача попередньої відповіді.

Засіяні чашки інкубують при температурі (37 +/- 1) град. С 24 години (при відсутності росту - 48 годин), підозрілі на менінгокок колонії відсівають і вивчають за описаною схемою. Вивчають чутливість виділених мікроорганізмів до антибіотиків.

5.1. Створення підвищеної концентрації вуглекислого газу для культивування посівів Рекомендується при первинному виділенні збудників менінгіту з ліквору, крові та одержанні біомаси.

З цією метою використовують СО2 -термостати, генератори GENbox з газпакетами. При відсутності СО2 -термостатів та генераторів GENbox з газпакетами для створення підвищеної концентрації СО2 можна використовувати будь-який посуд з притертою кришкою, наприклад, ексикатор. Засіяні чашки розміщують в середині посудини догори дном, там же закріплюють запалену свічку висотою 2-3 см та накривають кришкою. До моменту затухання свічки створюється підвищена концентрація СО2 (7-10%). Після цього посіви ставлять в термостат.

5.2. Проба на каталазу

Метод базується на здатності мікроорганізмів, що мають фермент каталазу, розщепляти перекис водню, утворюючи воду та кисень. Не можна використовувати для постановки тесту культуру, вирощену на кров'яному агарі, оскільки каталаза еритроцитів може давати хибно-позитивні результати.

На предметне скло наносять краплю 10% перекису водню, в неї скляною паличкою або платиновою петлею вносять культуру і розтирають круговими рухами. При позитивній реакції утворюється піна (бульбашки газу).

5.3. Проба на оксидазу

Для постановки тесту слід використовувати комерційні диски або смужки для визначення оксидази (такі як СІП для визначення оксидази, смужки для виявлення цитохромоксидази виробництва PLIVA-Lachema). За відсутності комерційних препаратів застосовують індофенольний метод або метод Ковача.

Дослідження проводять з тест-реактивами:

1. Індофенольний метод

Розчин А - альфа-нафтол - 1,0 г;

Спирт етиловий (96 град.) - до 100 куб. см.

Розчин Б - N, N-диметил-п-фенілендіамін - 1,0 г;

Спирт етиловий (96 град.) - до 100 куб. см.

Інгредієнти розчинити, тест-реактиви зберігати в прохолодному темному місці розчин А - до 10 діб, розчин Б - не більше 1 дня.

Ці розчини можна безпосередньо наносити по краплі на колонію або просочити смужку фільтрувального паперу, на якому розтирають матеріал із мікробної колонії. Оксидазопозитивні культури через 0,5-1,0 хвилину дають темно-синє забарвлення.

2. Метод Ковача

Тетраметил-п-фенілендіаміну гідрохлорид - 0,5 г;

Дистильована вода - до 100 куб. см.

Розчинити реактив у воді, зберігати в холодильнику при температурі (6 ± 2) град. С до 2 тижнів.

Смужку фільтрувального паперу просочують реактивом, на ній розтирають матеріал із колонії. Можна нанести краплю реактиву безпосередньо на ізольовану колонію. Оксидазопозитивні культури через 10-30 сек. дають рожеве з переходом у лілове забарвлення.

Добову агарову культуру наносять у вигляді штриха платиновою чи пластиковою петлею, або скляною чи дерев'яною паличкою або пастерівською піпеткою.

Щоразу при постановці тесту проводять контрольні дослідження з тест-культурами мікроорганізмів, які дають позитивну (Pseudomonas aeruginosa) і негативну (E. coli) реакції.

5.4. Визначення сахаролітичної активності

Для визначення сахаролітичної активності використовують комерційні ідентифікаційні набори такі як: МИКРО-ЛА-ТЕСТ (Нейсеріятест, Нефермтест, Стафітест, Стрептотест, Ентеротест та ін.) фірми Pliva-Lachema; API 20 NE, API 20 E, Rapid 20 E, API Listeria, API Staph, API NH, API 20 STREP, API Candida та ін. виробництва bioMerieux (офіційний представник фірми bioMerieux в Україні СП "Бівакс"). Дослідження виконують за інструкцією до препаратів.

Можна також застосовувати індикаторні паперові тест-системи. Для цього готують 1,5 куб. см густої суспензії досліджуваної культури в ізотонічному розчині натрію хлориду з рН 7,2, вносять її по 6 крапель в 5 пробірок. В кожну з пробірок поміщають індикаторний диск з вуглеводом (глюкозою, сахарозою, лактозою, мальтозою, фруктозою або левульозою) та індикатором феноловим червоним. Пробірки заливають вазеліновим маслом і витримують в термостаті при температурі (37 +/- 1) град. С. Про розщеплення вуглеводів свідчить зміна кольору дисків з малиново-червоного на жовтий. Облік результатів можливий через 6-24 години. Диски з глюкозою, лактозою і сахарозою використовують з наборів СІП для ідентифікації ентеробактерій або холерних вібріонів.

При відсутності дисків або наборів використовують середовища з вуглеводами для визначення сахаролітичних властивостей.

5.5. Визначення продукції полісахаридів N. meningitidis на агарі з 5% вмістом сахарози

Густо висівають культуру петлею на сектор чашки Петрі з сироватковим агаром, що містить 5% сахарози. Через 48 годин інкубації в термостаті при температурі (37 +/- 1) град. С на поверхню вирощеної культури наносять 1 краплю водного розчину Люголя. Реакція вважається позитивною при утворенні бурого забарвлення вирощених колоній.

5.6. Йодний тест для N. sicca

Реакцію на йод визначають на культурі, вирощеній бляшками на середовищі для постановки вказаного тесту (див. Додаток 2). На культуру пастерівською піпеткою наносять 1 краплю 0,25% водного розчину йоду. Позитивна реакція (поява синього забарвлення бактеріальної маси) характерна тільки для виду N.sicca.

5.7. Визначення редукції нітратів

Метод базується на здатності мікроорганізмів відновлювати солі азотної кислоти (нітрати) до солей азотистої кислоти (нітритів). Перед посівом менінгококів до нітратного бульйону додають 20% інактивованої сироватки. Посіви витримують в термостаті при (37 +/- 1) град. С до 5-7 діб. Після інкубації в пробірку з культурою вносять 3 краплі реактиву Гріса (суміш розчинів № 1 і № 2) або Касаткіна.

Поява червоного забарвлення через 30 секунд після додавання реактивів Гріса або Касаткіна свідчить про редукцію нітратів до нітритів - реакція позитивна. Відсутність забарвлення свідчить про те, що реакція негативна або відбулося відновлення до послідуючих продуктів (аміаку, молекулярного азоту, оксиду азоту, гідроксиламіну). Тому при відсутності забарвлення в пробірку додають на кінчику скальпеля порошок металічного цинку і результат оцінюють знову:

- забарвлення не з'являється - нітрати в середовищі відсутні, оскільки відновлені бактеріями до нітритів і далі до послідуючих продуктів відновлення;

- з'являється червоне забарвлення - нітрати в середовищі редуковані до нітритів, але не бактеріями, а цинком (реакція негативна).

5.8. Застосування дисків з жовчу для ідентифікації збудників менінгітів

Колонії мікроорганізмів, морфологічно схожі з менінгококовими, відсівають на сектори чашок Петрі з 20% сироватковим агаром. На кожний сектор накладають стерильний диск, просочений концентрованою жовчу (диски готують заздалегідь). Культури менінгококів навколо дисків з жовчу дають зону затримки росту, що ніколи не спостерігається при рості непатогенних нейсерій.

Можна використовувати середовище з 0,2% жовчі для вивчення ставлення мікроорганізму до жовчі.

5.9. Оптохіновий тест

Для постановки цього тесту можна використовувати готові комерційні диски з оптохіном, які накладають на щойно посіяну на КА культуру. У пневмококів навколо диску з оптохіном утворюється зона затримки росту.

5.10. Визначення ферменту уреази

Метод базується на здатності мікроорганізмів, які мають фермент уреазу, розщеплювати сечовину до аміаку, за рахунок якого відбуваються зміни рН середовища, що визначають за зміною кольору індикатора.

Пробу на уреазу можна ставити за методом Заксе: змішують (ex tempore) реактив А (1 частину) і реактив В (19 частин). Суміш розливають у вузькі пробірки по 0,1 куб. см і вносять кілька петель досліджуваної культури. Не можна брати конденсаційну воду, оскільки вона має лужну реакцію і може змінити pH середовища, а отже і колір індикатора. Пробірки ставлять в термостат на 30 хвилин.

Уреаза розщеплює сечовину, змінює pH середовища, що призводить до його почервоніння. Якщо фермент уреаза відсутній, зміна забарвлення середовища не відбувається. Рекомендується одночасно ставити контроль середовища. Облік негативної реакції можливий тільки після 24 годин інкубації.

5.11. Визначення індолоутворення

Метод базується на здатності мікроорганізмів розщеплювати амінокислоту триптофан з утворенням індолу.

З цією метою можна використовувати папірці із СІП. Пробірки з поживним бульйоном засівають однією петлею культури і додають 2-3 краплі інактивованої сироватки коня. Пробкою затискають індикаторний папірець на індол, просочений пара-диметиламіно-бензальдегідом. Інкубують при (37 +/- 1) град. С 18-24 години. При наявності індолоутворення жовтий папірець набуває рожево-малинового кольору.

Для визначення індолоутворення у H. influenzae слід використовувати "шоколадний бульйон".

5.12. Визначення наявності орнітиндекарбоксилази

У пробірку з 0,3-0,5 куб. см фізіологічного розчину вносять диск з орнітином (можна використовувати СІП) і додають декілька крапель добової бульйонної культури H. influenzae, заливають стерильним вазеліновим маслом і інкубують протягом 18-24 годин при температурі (37 +/- 1) град. С. При позитивному результаті з'являється синє забарвлення.

Для визначення наявності орнітиндекарбоксилази у H. influenzae слід використовувати культуру вирощену на "шоколадному бульйоні".

5.13. Визначення наявності бета-галактозидази у штамів H.influenzae

Бета-галактозидаза - фермент, що здатний безпосередньо гідролізувати лактозу до галактози та глюкози. ONPG (O-нітрофеніл-бета-D-галактопізнозидаза) - речовина, схожа за структурою з лактозою. У присутності бета-галактозидази ONPG руйнується на галактозу і O-нітрофенол, який надає жовтого забарвлення. H. influenzae на відміну від інших представників роду не має бета-галактозидази і це використовується як диференційно-діагностична властивість мікроорганізма.

Для постановки тесту слід використовувати комерційні диски просочені ONPG.

В 0,5 куб. см фізрозчину готують густу суспензію досліджуваної культури (еквівалент 2 одиницям за стандартом мутності МакФарланда) і вносять туди диск з ONPG, інкубують при температурі (37 +/- 1) град. С. Попередній облік проводять через 1 годину. Позитивна реакція - наявність жовтого забарвлення. Негативний результат може бути врахований тільки після 24 годин інкубації.

Для виявлення антигенів (Аг) збудника ГБМ у якості експрес-діагностики можуть використовуватись реакція латекс-аглютинації, зустрічний імуноелектрофорез, непрямий метод флуоресцуючих антитіл, реакція непрямої гемаглютинації з антитільними еритроцитарними діагностикумами, реакція коаглютинації.

6.1. Реакція латекс-аглютинації

Відомим "некультуральним" методом виявлення антигенів збудників ГБМ є метод латекс-аглютинації (ЛА) із застосуванням відповідних комерційних тест-систем. Латексні частки, покриті специфічними антитілами до антигенів N. meningitidis, S. pneumoniae або H. influenzae, аглютинують у присутності бактеріальних антигенів, що містяться в СМР; результат аглютинації оцінюється візуально. Постановка всієї реакції займає близько 10 хв., реакція не вимагає наявності живих бактерій у СМР. Досвід роботи показує, що діагностика ГБМ методом ЛА з тест-системами фірми BioMerieux (Франція), дозволяє довести лабораторне підтвердження ГБМ до 60-70%. Однак чутливість методу ЛА порівняно невисока (біля 70%), оскільки мінімальна обумовлена концентрація бактерій у СМР методом ЛА складає від 10-5 до 5 х 10-6 бактерій/куб. см або від 1 до 50 нг антигену/куб. см. Методику постановки реакції див. в інструкції по використанню тест-системи.

В практичній діяльності найчастіше застосовуються серологічні методи типування, основані на виявленні антигенних детермінант молекул, представлених на бактеріальній поверхні, - полісахаридів, білків, липополісахарида і т.і. Як вже було сказано, менінгококи поділяються на серогрупи (за полісахаридом), серотипи і серосубтипи (за білками зовнішньої мембрани), імунотипи (за ліпополісахаридом), пневмококи - на серотипи, гемофільна паличка - на серотипи (за полісахаридом), з яких найвірулентніший серотип b.

Як правило, поверхневі макромолекули патогенних бактерій, у тому числі збудників ГБМ, є, з одного боку, факторами вірулентності, що зумовлюють можливість колонізації організму людини і генералізації інфекції, і, з іншого боку, - мішенню для специфічних і неспецифічних захисних систем людини. Тому визначення серогруп, серотипів, імунотипів бактерій дозволяє прогнозувати результат їх взаємодії із системами вродженого і набутого, у тому числі вакцинального, імунітету і є істотним елементом епідеміологічного нагляду.

Обмеження серологічних методів. Взаємодіючи із системами імунітету, поверхневі молекули піддаються найсильнішому селекційному тиску. Механізми, що приводять до фазових варіацій, мутацій, рекомбінацій, горизонтальному переносу генів забезпечують широку варіабельність поверхневих макромолекул і приводять до відсутності чіткого взаємозв'язку імунотипу штаму з його еволюційним походженням і клональною належністю: родинні штами можуть мати різні серотипи, в той час як, штами, що мають однаковий серотип, не обов'язково є еволюційно близькими.

Істотним обмеженням серологічних методів типування є необхідність виділення живої культури бактерій, що далеко не завжди можливо. Крім того, реагенти для серотипування (специфічні антитіла) в Україні не виробляються, а вартість закордонних реагентів велика, тому серотипування збудників ГБМ не проводиться. Практичні установи з метою епіднагляду проводять серогрупування менінгококів.

6.2. Реакція аглютинації на склі (див. інструкцію по застосуванню сироваток)

При серологічному групуванні штамів менінгококів, особливо з носоглотки, часто спостерігається ауто- або поліаглютинація. Щоб зняти це явище, необхідно при постановці РА використовувати мікробну суспензію. Для цього рекомендуються полістиролові панелі або велике скло, на якому краплі обмежують олівцем по склу. Для кожної досліджуваної культури менінгококів використовують 1 ряд лунок панелі. Число горизонтальних лунок відповідає числу аглютинуючих групоспецифічних сироваток. Рідку сироватку кожної серогрупи у лунці розводять вдвічі (до 1 краплі сироватки додають 1 краплю суспензії культури). В окремій лунці кожного ряду готують суспензію досліджуваної культури. Необхідна густина суспензії досягається зливним ростом колоній на 1/8-1/10 частині чашки Петрі. Запаяною зігнутою пастерівською піпеткою бактеріальну масу знімають, ретельно емульгують, спочатку в 2-х краплях фізіологічного розчину, внесеного раніше в лунку. Потім для одержання оптимальної робочої густини до суспензії додають до 1,0 куб. см фізіологічного розчину. Суспензію розносять по одній краплі в горизонтальні лунки. Панелі струшують протягом 1 хвилини руками або на апараті для струшування.

Специфічну реакцію виявляють та враховують протягом 3 хвилин. Пізніший облік не виключає наявності реакції за рахунок перехресно реагуючих антигенів. Контролем служить лунка, в якій готують початкову суспензію бактерій у фізіологічному розчині.

Висновок про належність культури до тієї або іншої серогрупи роблять на основі позитивної реакції аглютинації з відповідною сироваткою по 4-хрестовій шкалі (при відсутності аглютинації в фізіологічному розчині).

При наявності реакції аглютинації з декількома сироватками тест повторюють. Для цього беруть культуру з іншого сектору зливного росту колоній, ставлять реакцію з сироватками, що взяті в розведенні 1:2; 1:4 і, в разі підтвердження попередніх результатів, досліджуваний штам визнають як поліаглютинабельний. У відповіді вказують з якими сироватками спостерігалась позитивна реакція і в яких титрах.

Якщо повторення реакції аглютинації дало інші результати, тобто культура реагувала тільки з однією сироваткою, роблять висновок про наявність клітин, що чітко групуються, і поліаглютинабельних клітин.

Визначення належності пневмококів до того чи іншого серотипу проводять за допомогою РА в пробірках з бульйонною культурою і сироваткою в розведенні 1:5 (див. "Інструкцію по використанню сироваток...")

В цій же реакції або в реакції аглютинації на склі з полі- та монотиповими сироватками визначають належність до певного серотипу H. influenzae.

8.1. При бактеріологічному дослідженні ліквору та крові терміни видачі відповіді такі:

- в 1-й день на основі прямої бактеріоскопії ліквору та "товстої краплі" крові дають попередню відповідь, яка в залежності від результатів формулюється в 3 варіантах:

а) при наявності в мазках великої кількості морфологічно типових бактерій пишуть: "В спинномозковій рідині (крові) при прямій бактеріоскопії виявлені грамнегативні коки (або грампозитивні коки, грамнегативні палички), схожі по морфології з менінгококами (пневмококами, H. influenzae або іншими). Дослідження продовжується.";

б) при наявності в мазках поодиноких бактерій пишуть: "В спинномозковій рідині (крові) при прямій бактеріоскопії виявлені поодинокі (або парні) клітини коків (або паличок і т.п.). Дослідження продовжується.";

в) при відсутності будь-яких бактеріальних клітин пишуть: "В спинномозковій рідині (крові) при прямій бактеріоскопії бактерій не виявлено."

На 2-й день видають також попередню відповідь, яка, в залежності від результатів бактеріологічного дослідження, формулюється таким чином:

а) при наявності росту бактерій, типових за морфологічними та культуральними властивостями для нейсерій та інших родів пишуть: "При прямому посіві спинномозкової рідини (крові) отримано ріст нейсерій (або стрептококів, грамнегативних паличок та ін.). Вивчення культури продовжується.";

б) при відсутності росту пишуть: "При прямому висіві спинномозкової рідини (крові) росту бактерій не виявлено. Дослідження продовжується.".

На 3-й день на підставі культурально-біохімічних та серологічних властивостей бактерій, що відсіяні з чашки на другий день, видають відповідь: "Із спинномозкової рідини (крові) виділена культура менінгококів серогрупи А, В або ін. (або інша культура)". В рідкісних випадках - "M.(B.) catarrhalis".

В цей же день може бути видана попередня відповідь про ріст (або його відсутність) в результаті висіву із середовища збагачення. Формулювання таке ж, як і при оцінці результатів прямого посіву з чашки. В цей же день видають остаточну позитивну відповідь на пневмококи, яка формулюється так: "Із спинномозкової рідини (крові) виділена культура S. pneumoniae.".

На 4-й день може бути видана заключна позитивна відповідь про видову належність нейсерій, що виросли при прямому посіві, а також інших бактерій.

На цьому ж етапі, як і в наступні дні (аж до 7-8 дня), може бути видана заключна позитивна відповідь, одержана в результаті висіву із середовища збагачення. Формулювання таке ж (див. 3-й день).

Заключну негативну відповідь видають не раніше 8-го дня, коли при останньому висіві із середовища збагачення (на 7-й день його інкубації) не виявляють росту бактерій. Її формулювання: "При інкубації спинномозкової рідини (крові) на середовищі збагачення протягом 7 днів виділити бактерії не вдалося".

8.2. При бактеріологічному дослідженні відбитків-мазків з петехій хворого або шматочків тканини трупного матеріалу дають попередню відповідь, яка в залежності від результатів, формулюється в трьох варіантах (п. 8.1.).

8.3. При бактеріологічному дослідженні слизу з ротоглотки видають тільки заключні відповіді. Терміни видачі та формулювання такі: на 4-й день при виділенні культури менінгококу видають позитивну відповідь: "У носоглотковому слизі виявлені менінгококи серогрупи..." (або такі, що не піддаються серогрупуванню).

У випадках додаткового відсіву колоній з чашок, а також при використанні напіврідкого середовища збагачення термін видачі відповіді затримується на один день.

При відсутності росту менінгококів в посівах видають негативну відповідь: "У носоглотковому слизі менінгококи не виявлені".

Увага! Згідно стандартам епіднагляду рекомендованим ВООЗ лабораторним підтвердженням випадку захворювання є:

- для менінгококової інфекції -

виявлення менінгококового антигену в спинномозковій рідині, або виділення культури збудника

- для Hib-інфекції -

виділення культури або виявленням антигену Hib у СМР або в крові. Виділення штаму Hib з нестерильних локалізацій - наприклад, з носоглотки, де бактерії можуть рости, не викликаючи захворювання, не є підтвердженням Hib-інфекції.

У зв'язку з різноманітністю збудників менінгітів і великою різноманітністю антибактеріальних препаратів, особливого значення набуває рання розшифровка етіології захворювання.

Останнім часом, поряд з бактеріологічними і серологічними методами, широко використовуються молекулярно-генетичні дослідження, а саме, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), яка дозволяє виявити в СМР і крові фрагменти нуклеїнових кислот широкого спектру збудників. Застосування методів на основі ПЛР значно покращує діагностику ГБМ, не потребуючи присутності живих мікроорганізмів у досліджуваному матеріалі; вони мають вищу чутливість порівняно з класичними методами.

Принцип ПЛР полягає в багаторазовій ампліфікації генетичного матеріалу, що міститься в досліджуваному зразку, за допомогою ферменту термостабільної ДНК-полімерази. Для генодіагностики ГБМ як зразок (матеріал для дослідження) використовуються стерильні рідини організму людини, у першу чергу, спинномозкова рідина. Розмноженню й ідентифікації піддають фрагменти генома збудників ГБМ, тобто, в першу чергу, менінгококів, пневмококів, гемофільної палички.

У порівнянні з традиційними методами діагностики, генодіагностика відрізняється високою чутливістю і дозволяє використовувати для дослідження матеріал, який не містить живі збудники, а тільки фрагменти їх генетичного матеріалу.

Результати генотипування характеризуються більшою однозначністю в порівнянні з морфологічними, біохімічними чи імунологічними методами ідентифікації мікроорганізмів і надають безпосередню інформацію для з'ясування епідеміологічних зв'язків різних збудників.

Типування збудників ГБМ вкрай важливо для епідеміологічного нагляду, проведення протиепідемічних заходів, короткострокового і довгострокового епідеміологічного прогнозу.

Методи генодіагностики і генотипування не заміняють традиційних мікробіологічних методів, але є істотним і необхідним їх доповненням. Застосування генодіагностики і генотипування дозволяє підвищити рівень діагностики менінгококової інфекції і гнійних бактеріальних менінгітів і дає можливість більш повного епідеміологічного спостереження за поширеністю різних варіантів їх збудників на території країни.

Геномна ДНК збудників ГБМ являє собою досить велику кільцеву хромосому, так, наприклад, геном N. meningitidis складається з 2,3 мільйона пар основ і близько 2160 генів. Функції багатьох генів ще невідомі, однак серед них можна виділити унікальні ділянки, специфічні для даного роду, виду, підвиду мікроорганізмів. Власне генодіагностика і полягає в розмноженні та визначенні подібності певної ділянки, що може бути зроблене за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

В основі методу ПЛР лежить багаторазове копіювання за допомогою ферменту ДНК-полімерази певного фрагмента ДНК. Комплементарне добудовування послідовностей може початися тільки у визначених стартових блоках - коротких двониткових ділянках. Для створення стартових блоків у заданих ділянках ДНК використовують затравки, що являють собою спеціально синтезовані in vitro олігонуклеотиди довжиною близько 20-30 основ - праймери. Праймери комплементарні послідовностям ДНК на лівій і правій межах фрагмента, що ампліфікується, і орієнтовані таким чином, що синтез ДНК, здійснюваний ДНК-полімеразою, відбувається між ними. Процес ампліфікації полягає в повторі циклів, що складаються з денатурації ДНК, відпалювання праймерів і синтезу фрагмента ДНК, який проводиться при різній температурі на приладі з програмним контролем температурного режиму - термоциклері (ампліфікаторі). У результаті відбувається збільшення кількості копій специфічного фрагмента у геометричній прогресії. Після 30-35 циклів ампліфікації синтезується 108 копій фрагмента - ампліконів, що дає змогу визначення і візуалізації їх електрофоретичної рухливості в агарозному (акриламідному) гелі. Праймери можуть бути строго видоспецифічними або родоспецифічними.

Виділення та ідентифікація збудника зі зразків СМР або крові хворого класичними бактеріологічними методами, залишаючись "золотим стандартом" діагностики, має серйозні обмеження, обумовлені застосуванням антибіотиків на догоспітальному етапі. Крім того, бактеріологічна діагностика триває не менше 2 діб.

Перевагами ПЛР є - можливість виявлення навіть декількох копій генома бактерій у зразку і, як наслідок, максимальна діагностична потужність; чутливість і специфічність, що сягають 100%, висока відтворюваність; стиснуті (декілька годин) терміни дослідження. Тому показаннями до генодіагностики ГБМ є:

- негативні результати діагностики іншими методами;

- використання для діагностики зразків СМР, узятих після антибіотикотерапії або на пізніх стадіях хвороби;

- необхідність термінового діагностичного результату;

- заміщення вартісних імунологічних методів.

Прямих протипоказів до застосування генодіагностики ГБМ не існує. Однак, з одного боку, ПЛР здатна виявити мінімальне бактеріальне забруднення досліджуваного зразка; з іншого боку, у деяких біологічних рідинах, у тому числі, СМР можлива присутність інгібіторів ПЛР. Тому при постановці реакції обов'язковим є використання позитивних і негативних контролів, висока якість усіх реагентів і їх періодична перевірка, акуратність і ретельність виконання дослідження, що дозволяє уникнути як хибно-позитивних, так і хибно-негативних результатів.

Основні вимоги до організації роботи ПЛР лабораторій викладені в ДСП 9.9.5.-080-2002. Лабораторія ПЛР-діагностики повинна бути укомплектована кваліфікованим персоналом, мати відповідні приміщення, устаткування і витратні матеріали, необхідні для виконання трьох основних етапів дослідження методом ПЛР: виділення ДНК із досліджуваного матеріалу, постановки реакції ампліфікації, обліку результатів ампліфікації. Для запобігання контамінації важливо проводити кожен етап в окремому, спеціально обладнаному приміщенні. Один і той же працівник не повинен бути задіяний на різних етапах роботи протягом одного робочого дня.

Забір і зберігання зразків біологічного матеріалу. Забір, зберігання та доставка зразків до лабораторії проводиться з дотриманням правил асептики і біологічної безпеки при роботі з інфекційним матеріалом (ДСП 9.9.5.-080-2002). Приготований з біологічних зразків чистий препарат ДНК не вважається інфекційним.

Зразки СМР забирають у хворих на ГБМ, бажано при госпіталізації в стаціонар, у рамках звичайної діагностичної спинномозкової пункції. Для запобігання хибно-позитивних результатів рекомендується використання одноразових голок для пункції і стерильних одноразових пробірок типу "Епендорф". Як правило, для ПЛР-діагностики достатньо 0,1-0,5 куб. см СМР. Використання інших асептично узятих зразків (кров, аутопсійні матеріали) можливе, але при ГБМ має менше значення.

Відібрані зразки СМР можуть бути досліджені методом ПЛР негайно, зберігатися протягом 1-3 днів при (6 +/- 2) град. С, або бути піддані глибокому заморожуванню. При -20 град. С зразок може зберігатися кілька місяців, при -70 град. С практично необмежено. Варто уникати декількох циклів заморожування-розморожування зразка, тому, якщо зразок планується досліджувати неодноразово, аліквоти повинні бути розлиті в окремі пробірки.

Виділення ДНК. Зразки СМР можна використовувати в реакції ампліфікації безпосередньо; перед дослідженням проби (100 мкл СМР, покриті зверху 100 мкл мінеральної олії) інкубують в термостаті для мікропробірок 20 хвилин при 99 град. С з метою руйнування бактерій, після чого центрифугують при 10 000 g протягом 1 хвилини при кімнатній температурі і супернатант відбирають для постановки ПЛР. Концентрацію і чистоту ДНК у подібній пробі можна підвищити, додавши етап виділення шляхом сорбції. При цьому, щоб переконатися, що в кожному зразку СМР виділення ДНК пройшло успішно, у зразок СМР перед виділенням ДНК додається внутрішній контроль - препарат ДНК, наприклад, вірусу гепатиту В (HBV), а також готується додаткова пробірка без СМР, але з HBV, що являє собою негативний контроль виділення. Надалі для кожного зразка СМР ставиться реакція на виявлення ДНК HBV, що повинна дати позитивні результати.

Для виділення ДНК використовується свіжа культура бактерій, що вирощена на твердих поживних середовищах з одиночної колонії. Необхідна кількість матеріалу, як правило, одна чи кілька колоній, переноситься стерильною одноразовою петлею в стерильну одноразову пробірку з очищеною стерильною водою або фізіологічним розчином, що не містить навіть слідових кількостей бактеріальної ДНК. Безпосередньо для цілей ПЛР-діагностики препарати з виділених культур використовуються рідко, оскільки в цих випадках можлива діагностика стандартними мікробіологічними методами. Проте, чисті культури можуть бути використані для генотипування, перевірки специфічності і чутливості праймерів і тест-систем у цілому, а також у якості позитивного або негативного контролів.

ДНК із бактеріальної суспензії виділяється стандартними методами лізису/сорбції/відмивання (наприклад, з використанням наборів "ДНК-сорб", ЦНДІ епідеміології, Москва, Росія) або фенол-хлороформної екстракції. Концентрації ДНК у пробі при необхідності можна визначити спектрофотометрично при довжині хвилі 260 нм. Число мікроорганізмів, еквівалентних даній концентрації ДНК, розраховується виходячи з приблизного співвідношення: 1 бактеріальна клітина містить 4 фемтограма ДНК.

Для визначення родових ознак Neisseria, Streptococcus і Haemophilus може бути використаний ген бактеріальної 16S рибосомальної РНК. Специфічні "серогрупові" праймери розпізнають наступні гени менінгококів: для серогрупи А - унікальний ген, що кодує УДФ-N-ацетил-d-глюкозамін-2-епімеразу (mynA), для серогруп В і С - гени, що кодують полісіалілтрансферазу-D (siaD). Ці гени беруть участь у синтезі полісахаридів капсули менінгококів і праймери здатні диференціювати менінгококи серогрупи B від менінгококів серогрупи C (а також W135, Y, і інших). Теоретично праймери здатні визначити серогрупу менінгокока більше, ніж у 90% випадків захворювання, оскільки сумарно менінгококи серогруп А, В та С відповідальні більше, ніж за 90% випадків МІ в Україні. Результат ПЛР із серогруповими праймерами є додатковою перевіркою і підтвердженням вірності результатів, отриманих з родоспецифічними праймерами.

Для підвищення ефективності ампліфікації використовується методика "гарячого старту".

Аналіз і облік результатів. Продукти ампліфікації виявляються і диференціюються методом електрофорезу в 2% агарозному гелі, що містить бромистий етидій, з подальшою візуалізацією при підсвічуванні гелю ультрафіолетовим випромінюванням. Довжина ампліфікованого фрагмента гена 16S РНК Neisseria - 341 пара нуклеотидів, Haemophilus - 516 п.н., Streptococcus - 792 п.н., довжина специфічних ампліконів N. meningitidis серогрупи А - 349 п.н., групи В - 539 п.н., С - 209 п.н. Фіксацію, збереження та аналіз отриманих зображень гелів зручно проводити за допомогою спеціалізованих систем обробки зображення (Gel-Doc, БиоРад; BioTest, ЦНДІ епідеміології). При невеликому обсязі досліджень можливі і безпосередня візуальна оцінка та фотографування результатів.

Облік результатів. На доріжці (доріжках), яка відповідає позитивному контрольному зразку (зразкам), повинна бути яскрава специфічна смуга, яка світиться, на рівні довжин ампліконів, зазначених вище. Довжина амплікону визначається по додатковій доріжці, що містить маркер довжини. Позитивними вважаються зразки (клінічні проби), що містять специфічну смугу, яка світиться, більшої чи меншої інтенсивності, на тому ж рівні, що й позитивний контроль. Негативними вважаються зразки, у доріжках яких немає подібних смуг. У доріжці, що відповідає негативному контрольному зразку, не повинно бути високомолекулярних смуг (вище рівня 100 п.н.)

Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:

- Якщо в доріжці, що відповідає позитивному контролю, відсутня специфічна смуга. Причиною цього могла бути помилка в приготуванні реактивів, постановці ПЛР або збій програми ампліфікатора.

- Якщо в негативному контролі виявляється специфічна смуга, це означає, що у процесі роботи сталася контамінація реактивів або проб позитивною ДНК або продуктами її ампліфікації. У цьому випадку результати аналізу в усіх пробах вважаються недійсними. Для перевірки реактивів необхідно поставити не менше трьох негативних контролів на етапі виділення ДНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР (без пробопідготовки) для виявлення джерела контамінації. Якщо недостовірний результат повторився хоча б один раз, необхідно замінити реактиви.

Крім того, молекулярно-генетичні дослідження можуть бути використані для вирішення не тільки діагностичних, але й багатьох епідеміологічних питань: короткострокове і локальне розслідування спалахів, глобальний довгостроковий епіданаліз. З цією метою можуть бути використані наступні способи ідентифікації амплікона: гель-електрофорез (специфічний амплікон повинен мати певну довжину і відповідну електрофоретичну рухливість); рестрикційний аналіз (амплікон піддається дії ферментів рестриктаз, які розрізають його на характерне число фрагментів певної довжини); ПЛР із імуноферментним детектуванням (аналог ІФА при якій амплікон зв'язується зі специфічним зондом) та інші.

Для нетривалого зберігання (до 7-10 днів) пневмокок та H.influenzae сіють на скошений ША, термостатують при (37 +/- 1) град. С протягом 18-24 годин і зберігають при (6 +/- - 2) град. С. Менінгокок також відсівають на скошений ША, термостатують у такому ж режимі, але зберігати його слід при кімнатній температурі.

N. meningitidis, S. pneumoniae можна зберігати протягом 5-6 тижнів методом посіву в стовпчики з оптимальним для кожного мікроорганізма поживним середовищем: для N. meningitidis - сироватковий, для S. pneumoniae - кров'яний агари. Культуру N. meningitidis засівають уколом, термостатують при температурі (37 +/- 1) град. С. Через 24 години, при наявності росту культури по уколу та у вигляді бляшки на поверхні середовища, в пробірку наливають 1,5-2 куб. см стерильного вазелінового масла і в такому стані зберігають, транспортують, не допускаючи охолодження. Засіяний матеріал із однієї пробірки можна використовувати декілька разів для пересівів.

Зберігання культур менінгокока в лабораторних умовах можна здійснювати таким способом. Культуру засівають на чашку з агаром, що містить 20% нормальної кінської сироватки, ставлять для підрощування на 3-4 години в термостат при температурі (37 +/- 1 град. С), після чого ставлять в холодильник (6 +/- 2) град. С на 1-7 днів. Відновлення культивування штамів здійснюється шляхом перенесення цих же посівів знову в термостат при температурі (37 +/- 1) град. С на 18-20 годин. Такий спосіб зберігання виключає багаторазовий пересів культур, не потребує підвищеного вмісту СО2 в атмосфері, дозволяє зберігати культури, первинний посів яких утворюється з однієї або декількох колоній, а також зберегти капсулу та стабільність аглютинаційних властивостей.

Для зберігання культури пневмокока, її переносять повною петлею на скошений кров'яний агар, і витримують, без попередньої інкубації протягом 4-6 днів при температурі (4-22) град. С. Для одержання свіжої культури з поверхні засіяного агару роблять пересів на свіже середовище такого ж складу, після чого ставлять в термостат на добу при температурі (37 +/- 1) град. С.

H. influenzae також швидко відмирає. Життєздатність гемофілів можна продовжити до 1 місяця, для чого слід зробити густий посів на скошений "шоколадний" агар і після добової інкубації створити повну герметизацію. Таку культуру для пересіву використовують тільки одноразово.

Для тривалого зберігання штамів основних збудників менінгітів можна використовувати ліофілізацію культур або їх заморожування. Для останнього необхідно виростити мікроорганізм на відповідному середовищі (H. influenzae - на ША, а S. pneumoniae та N. meningitidis - на КА або ША) протягом 18-24 годин при температурі (37 +/- 1) град. С у ємкості з підвищеним вмістом СО2. Переконатись у чистоті культури, зібрати вирощену культуру у кріофлакон з 1 куб. см гліцеринового бульйону, промаркувати і заморозити при -20 град. С або -70 град. С. При цьому слід пам'ятати, що не можна допускати розморожування та повторного заморожування бульйону з культурою, оскільки штам загине. Якщо бульйон розтане, слід рекультивувати і заморозити вирощену культуру знову.

Бактеріологічні лабораторії Кримської республіканської СЕС, обласних, Київської та Севастопольської міських, Центральних на водному транспорті виконують такі функції:

11.1. Надання консультативної та практичної допомоги підвідомчим лабораторіям СЕС та ЛПЗ.

11.2. Підготовка спеціалістів з лабораторної діагностики гнійних бактеріальних менінгітів.

11.3. Вивчення обсягів досліджень на гнійні бактеріальні менінгіти підлеглих контингентів, оцінка їх достатності спільно з епідеміологами та інфекціоністами, аналіз показників якості діагностики.

11.4. Визначення потреби в поживних середовищах та діагностичних препаратах, організація постачання підвідомчих лабораторій.

11.5. Контроль якості бактеріологічної діагностики гнійних бактеріальних менінгітів та впровадження заходів щодо покращання цієї роботи на території, що обслуговується:

- перевірка на місці;

- аналіз показників роботи лабораторій;

- контроль за якістю ідентифікації культур збудників гнійних бактеріальних менінгітів;

- видача контрольних задач;

- проведення паралельних досліджень.

11.6. Вибірковий контроль якості поживних середовищ, що готуються у лабораторіях.

11.7. Відправка виділених атипових та таких, що виділені вперше або рідко зустрічаються штамів збудників гнійних менінгітів до бактеріологічної лабораторії ЦСЕС МОЗ України для подальшого їх вивчення.

12.1. Навчити медичний персонал правилам взяття, посіву та доставки матеріалу до лабораторії.

12.2. Систематично контролювати правильність взяття і доставки матеріалу.

12.3. При прийомі матеріалу переконатися у тому, що він відібраний та доставлений до лабораторії без порушень. Перевірити відповідність маркування на пробірці із записом в направленні.

12.4. У реєстраційному журналі треба вказати дату, час і правильність надходження матеріалу (порушення вказувати конкретно). Матеріал приймається і досліджується незалежно від встановленого порушення. Про порушення та необхідність повторного взяття матеріалу інформується відповідальна особа закладу, звідки надійшов матеріал. Якщо на протязі 3 годин матеріал повторно не надійшов до лабораторії, ситуація розцінюється як надзвичайна, про що сповіщається керівництву ЛПЗ (СЕС).

12.5. При виникненні в процесі діагностичного дослідження підозри на наявність в матеріалі менінгококів, гемофілів, пневмококів або інших бактерій, негайно інформуються відповідні спеціалісти СЕС і ЛПЗ. У реєстраційному журналі фіксується коли (дата, час) і кому (прізвище, посада) подано повідомлення. Оперативна інформація по телефону повинна супроводжуватися письмовою випискою на офіційному бланку.

12.6. Кожне приготування поживних середовищ повинно реєструватися у "Журналі приготування і контролю якості поживних середовищ" ф. 256/0 і контролюватися.

12.7. Кожен лікар повинен систематично аналізувати якість діагностики та вживати необхідні заходи щодо її поліпшення.

12.8. Порядок знищення отриманих культур, збудників ГБМ визначається закладом вищого рівня управління.

12.9. Усі штами N. meningitidis негайно повинні бути направлені до закладу вищого рівня управління (базову лабораторію) для серологічного типування. Усі сумнівні, атипові штами (мазки первинної бактеріоскопії) терміново мають бути направлені до закладу вищого рівня управління (базову лабораторію) для подальшого вивчення або слід повідомити про необхідність одержання консультації.

12.10. Персонал лабораторії повинен суворо дотримуватись правил протиепідемічного режиму роботи згідно ДСП 9.9.5.-080-2002.

Усі середовища обов'язково перевіряються перед використанням на стерильність (відсутність росту на них після інкубування протягом 48 годин при температурі (37 +/- 1) град. С. Крім того, вони повинні забезпечувати типовий ріст контрольних штамів. (Табл. 6).

Мікробіологічні дослідження з метою діагностики та профілактики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів проводять з дотриманням вимог біологічної безпеки відповідно до ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю".

Загальні вимоги до виготовлення поживних середовищ викладені в ГОСТ 10444.1-84.