Про удосконалення заходів щодо попередження захворювань на поліомієліт в Україні

Для постановки реакції віруснейтралізації використовують розведення 10 -3 та 10 -4 (близько 100 ЦПД50 в 50 мкл): у дві лунки з відповідною сироваткою чи сумішшю сироваток додають по 50 мкл розведення 10 -3, а у дві інші - 50 мкл розведення 10 -4. У 4 лунки для контролю клітин вносять по 100 мкл середовища. В усі лунки контрольного титрування також додають по 50 мкл середовища. Загальний об'єм у всіх лунках повинен бути однаковим.

Мікроплату закривають кришкою і інкубують при 36 град.С протягом 1 години. Після цього в усі лунки додають по 100 мкл суспензії клітин (НЕр-2, RD), що містять 150000 клітин в 1 мл, заклеюють плату спеціальною плівкою, і інкубують її в СО2-інкубаторі при 36 град.С. Мікроскопують за допомогою інвертованого мікроскопу і записують результати щоденно, облік результатів закінчують через 24 години після виявлення 100% ЦПД у лунках контролю вірусу. Якщо титр вірусу дорівнює 10 4,5 - 10 6,5 ТЦД50 (тобто 100 ТЦДЦ50 + - 0,5 lg в 50 мкл, що відповідає робочій дозі вірусу 10 -3 - 10 -4), то можна оцінювати реакцію віруснейтралізації. Якщо титр вірусу менший або більший необхідно повторити типування з правильно підібраною дозою вірусу.

Серологічні методи дослідження проводяться з метою визначення рівня антитіл до поліовірусів у сироватках крові хворих або для оцінки стану популяційного імунітету населення до поліомієліту. Виявлення сероконверсії (приросту титру антитіл в 4 і більше рази) в сироватці хворого є додатковим підтвердженням діагнозу захворювання з урахуванням комплексу клінічних, вірусологічних та епідеміологічних даних. Для виявлення сероконверсії використовують парні сироватки, першу з яких бажано взяти на 2-4 добу хвороби, другу - через 2-3 тижня. При необхідності досліджують і третю сироватку крові. Для визначення рівня гуморального імунітету відбирають тільки одну сироватку. Для отримання сироватки бажано відібрати 3-5 мл крові. Пробірку з кров'ю залишають на 2 години при кімнатній температурі. Утворений згусток відокремлюють від стінок пробірки стерильною скляною паличкою або пастерівською піпеткою. Прискорення ретракції згустка крові та збільшення виходу сироватки відбувається, якщо далі кров витримують у холодильнику при температурі 0 - +8 град.С протягом 18-24 год. Відокремлену від згустка сироватку центрифугують протягом 10 хв. при 1500 об/хв для видалення рештки домішок клітин крові. Частину сироватки досліджують, решту зберігають у замороженому стані.

Якщо досліджуються парні сироватки, то першу сироватку зберігають до моменту отримання другої. В подальшому їх досліджують одномоментно.

Якщо у дитини неможливо взяти кров із вени, її можна отримати із пальця. Мінімальна кількість сироватки, що не необхідна для дослідження, становить 0,1 мл. З пальця можна одержати 0,3-0,4 мл крові, яку збирають у невеличку стерильну ємкість, без антикоагулянтів або консервантів. Сироватку від згустка відокремлюють, як позначено вище.

Як вже відмічалось, РН грунтується на специфічній взаємодії антитіл сироватки хворого чи вакцинованої особи з еталонним вакцинним або аутоштамом поліовірусів з наступною нейтралізацією інфекційної активності вірусу (відсутність ЦПД чи бляшок при відповідних контролях).

При постановці РН з метою серологічної діагностики беруть постійну дозу вірусу (100 ТЦД50 або 100 БУО в 0,1 мл) і послідовні 2-разові розведення досліджуваних сироваток крові.

Дослідження необхідно проводити з вакцинними штамами вірусу поліомієліту типів 1, 2 та 3, які можна одержати в Українській референс-лабораторії з поліомієліту. Проведення реакції з використанням еталонних вірулентних штамів поліовірусу суворо забороняється.

Еталонні вакцинні штами напередодні постановки РН титрують на тих клітинах і за такою ж методикою, як далі буде проводитись постановка РН.

Методика постановки РН з метою серологічної діагностики поліомієліту за пригніченням ЦПД

Для звільнення сироваток крові від термолабільних інгібіторів їх прогрівають при 56 град.С протягом 30 хв (слід враховувати, що така теплова обробка призводить до зменшення титру антитіл класу IgM). Потім готують розведення парних сироваток крові з 2-кратним інтервалом від 1:4 до 1:512-1:1024, і кожне розведення, починаючи з останнього, після ретельного перемішування вносять по 0,4 мл у 3 простерилізовані пробірки. У пробірки з розведеннями сироваток додають по 0,4 мл розведення вакцинного штаму поліовірусу відповідного типу, що містить 100 ТЦД50. Суміші вірусів з різними розведеннями сироватки крові струшують і витримують при температурі 36 град.С протягом 1 год.

Кожну суміш вносять по 0,2 мл у 2-4 пробірки (флакони) з 24- 48 - годинною моношаровою культурою чутливих клітин, попередньо видаливши з неї середовище росту. (При недостатній кількості сироватки крові нейтралізацію з вірусом кожного типу ставлять в одному ряді розведень.) Інфіковані моношари інкубують при 36 град.С протягом 30-60 хвилин, після цього заливають середовище підтримки.

Паралельно ставлять контролі:

1) Контроль дози вірусу для визначення фактичної кількості ТЦД50, що бере участь у реакції: по 4 пробірки з моношаром клітин інфікують вірусом, взятим у робочому розведенні (100 ТЦД50 у 0,1 мл), а також у трьох зменшених розведеннях, які містять 10 ТЦД50, 1 ТЦД50, 0,1 ТЦД50 вірусу.

2) Контроль сироваток на цитотоксичність: 0,1 мл найменшого розведення (1:4) кожної сироватки крові наносять на моношар з культурою клітин.

3) Контроль культури клітин - для виявлення можливої неспецифічної ЦПД. Для цього залишають незараженими 4 моношари культур клітин, які інкубують при температурі 36 град.С протягом 5-7 діб.

РН за редукцією вірусних бляшок здійснюється за такою ж методикою, з використанням чутливих культур клітин, що виросли на дні флаконів від пеніциліну, та бентонітового покриття.

Враховують результати РН, починаючи з контролів. Потім оцінюють результати в дослідних пробірках чи флаконах. Затримка ЦПД вірусу свідчить про наявність антитіл у сироватці крові. В РН по редукції бляшкоутворення позитивним вважається результат, коли спостерігається повна відсутність чи зниження на 80% кількості бляшок при повноцінному контролі вірусу (5-100 бляшок). Діагностичне значення має 4-разове зростання титру антитіл у другій сироватці.

Серологічні дослідження можуть надати допомогу при підтвердженні діагнозу поліомієліту, але згідно з рекомендаціями ВООЗ їх не можна вважати головним діагностичним критерієм. Ці дослідження не дозволяють відрізнити інфікування диким поліовірусом від нормальної реакції на вакцинацію проти поліомієліту. Особливе значення серологічні дослідження мають для оцінки стану колективного імунітету до поліовірусів.

Взяття і доставка матеріалу

Лабораторну діагностику поліомієліту необхідно проводити шляхом виділення вірусів з фекальних проб хворого з використанням культури клітин. Забір проб необхідно проводити якомога швидше - в перші 14 діб (а краще протягом перших днів) після появи паралічів. У цей період кількість вірусів у фекальних масах досягає найвищих рівнів. У зв'язку з тим, що виділення вірусів з фекальних мас не носить постійного характеру, проби треба відбирати двічі: перша проба - в день обстеження хворого, друга проба - через 24-48 годин після забору першої проби.

Змиви з ротоглотки менш ефективні для виділення поліовірусів (лише у перші 7-10 днів після початку хвороби). Незважаючи на нейротропізм поліовірусів, вони рідко виділяються із спинномозкової рідини, у той час, як інші ентеровіруси можуть бути ізольовані з ліквору з високою частотою. Усі проби для виділення вірусів повинні бути взяті у найбільш ранні терміни після початку захворювання. У летальних випадках секційні проби слід взяти у перші години після смерті.

Усі проби для виділення вірусу необхідно брати дуже обережно, щоб виключити можливість контамінації однієї проби вірусом з іншої проби.

В осередку інфекції відбирають по одній пробі фекальних мас від кожного з 5 контактних дітей віком до 5 років. Доцільно обстежувати осіб, які могли спілкувались з хворим: друзів по дитячим іграм, однокласників, братів та сестер. Збір матеріалу від осіб що спілкувалися і у випадках, коли від початку паралічу пройшло більше 6 тижнів, але матеріал не було зібрано, а також у випадках смерті хворого. Якщо від початку паралічу пройшло більше 3 місяців, досліджувати матеріал від осіб, що спілкувалися з хворим, недоцільно.

Для вірусологічних досліджень збирають проби фекальних мас вагою 8-10 грамів. Ця кількість матеріалу дозволить при необхідності провести повторні дослідження. Проби розміщують у спеціальних контейнерах з кришками, що загвинчуються, чи іншому стерильному посуді (скляному або пластмасовому). На пробі вказують прізвище пацієнта, реєстраційний номер випадку, дату взяття матеріалу. Пробу відразу ж вміщують у холодильник з температурою 0-+8 град.С. На кожного обстеженого оформлюється направлення на лабораторне дослідження, яке повинно знаходитись окремо від проби (додаток 1). Його не слід обгортати навколо проб чи класти у холодильник.

Для транспортування проби треба загорнути у гігроскопічний матеріал, запакувати у пластиковий пакет і розмістити в контейнері з термоізоляційним шаром і холодовими елементами. Усі бланки з даними, що мають відношення до проб, треба покласти в конверт, зазначити на ньому дату б відправлення, помістити в окремий поліетиленовий пакет і покласти в контейнер.

Якщо очікується, що період часу між взяттям проби та її дослідженням у лабораторії перевищить 72 год., пробу необхідно тримати в морозильній камері при температурі -20 град.С. У такому випадку проби направляють в лабораторію замороженими з використанням холодових елементів чи з сухим льодом, що носить назву "зротнього холодового ланцюга". Якщо його не дотримуватися протягом усього часу транспортування, поліо- та інші ентеровіруси, що знаходяться в фекаліях, можуть інактивуватися. При транспортуванні зразків фекалій потрібно використовувати термоконтейнери, сумки та холодові елементи, що призначені тільки для клінічного матеріалу, вони ні в якому разі не можуть бути використані для вакцини.

Лабораторію, до якої надсилають зразки, повинно бути попереджено про надходження матеріалу. У летальних випадках відбирають секційний матеріал - сегмент низхідної товстої кишки довжиною 3-5 см разом з вмістом, шматочки тканин з шийного та поперекового відділів спинного мозку, довгастого мозку, варолієвого моста (приблизно по 1 см3). Матеріал заливають середовищем для транспортування вірусів. Це середовище складається з основного сольового розчину Хенкса, розведеного до рН 7,4 буфером HEPES, з 0,2% бичачого альбуміну. До середовища додають антибіотики - пеніцилін і стрептоміцин (або гентаміцин) і феноловий червоний, як індикатор. Середовище розливають по 2,5 мл у герметично закриті флакони і зберігають при 0-+8 град.С. Концентрований розчин гентаміцину (1 г гентаміцину сульфату в 200 мл стерильного фосфатного сольового буферу) розливають по 5 мл і зберігають при -20 град.С. Для використання додають 1 мл цього розчину до 100 мл середовищ, щоб кінцева концентрація дорівнювала 30-50 мкг/мл.

Додатково можна використовувати інші антибіотики: мікостатин фунгіцидної дії (25 ОД/мл), канаміцин та інші.

Підготовка матеріалу до вірусологічних досліджень

Половину зразку фекальних мас залишають при -20 град.С як резерв, необхідний для повторного вірусологічного дослідження. Другу половину використовують для виділення ентеровірусів, попередньо підготувавши суспензію освітлених фекальних мас. З цією метою ВООЗ рекомендує використовувати хлороформ. До флакону з керамічними (скляними) кульками додають 10 мл ФБР (фосфатно-буферного розчину). За допомогою шприця вносять 0,5 мл хлороформу і шпателем - 2 г фекалій, щоб отримати 20% суспензію. Флакон енергійно струшують протягом 20 хв. та центрифугують 20 хв. при 1500-3000 об/хв. Переносять по 3-4 мл освітленої фекальної суспензії в 2 пробірки. Проби підписують і нумерують. Одну використовують для виділення вірусів, другу зберігають як запасну при -20 град.С. Для отримання суспензії освітлених фекальних мас, можна використовувати і ефір за загальновживаною методикою.

Виділення і ідентифікація ентеровірусів

Паралельно інфікують по 2 пробірки з моношаром клітинних ліній НЕр-2 та RD) (по 0,2 мл суспензії на кожну пробірку). По 2 пробірки з кожною лінією клітин залишають як контроль клітинних культур. Інкубують при 36 град.С. Моношар клітин мікроскопують щоденно, записуючи результати мікроскопування (цитопатогенну дію, яка може спричинятися як ентеровірусами, так і бути результатом токсичної дії фекальних мас на клітини). Проби, що викликали ЦПД у культурі клітин, заморожують при -20 град.С і розморожують, центрифугують, відбирають супернатант, який використовують для наступного пасажу з метою запобігання токсичній дії фекалій до початку серотипування. З матеріалом, що не дав ЦПД, або якщо після зараження фекальною суспензією клітини проявляють швидку (менш, ніж за 24 години) дегенерацію через токсичність фекалій, необхідно зробити додаткові пасажі.

Після виявлення цитопатогенного агенту проводять титрацію вірусів та ідентифікацію їх в реакції віруснейтралізації згідно з методиками, що описані вище. Термін дослідження клінічного матеріалу у вірусологічних лабораторіях областей 28 діб.

Усі поліовіруси та інші ентеровіруси, виділені з клінічного матеріалу та об'єктів довкілля, протягом 7 діб після їх виділення та ідентифікації повинні бути нарочним доставлені до УРЛП для підтвердження правильності типування і наступного проведення внутрішньотипової диференціації. Щоквартально обласні лабораторії надсилають звіти до УРЛП за формами, що надаються (додаток 2).

Первинне розмноження ентеровірусів відбувається в ентероцитах тонкої кишки, звідки вони з фекальними масами потрапляють до довкілля, забруднюють грунт, воду, можливе їх надходження до молочних продуктів, овочів і фруктів. Значне накопичення ентеровірусів, включаючи поліовіруси, відбувається в тканинах молюсків, що фільтрують воду (устриці, мідії тощо).

Здійснення вірусологічного моніторингу об'єктів довкілля необхідно для визначення інтенсивності циркуляції ентеровірусів на території, їх типового складу, наявності "диких" поліовірусів та оцінки ефективності роботи очисних споруд.

Рекомендовані методи дослідження об'єктів довкілля:

Вірусологічне дослідження води.

Дослідження стічних вод, води, відкритих водоймищ, питної води здійснюють під час проведення попереджувального та поточного санітарного нагляду, а також за епідеміологічними показниками.

У результаті дослідження стічних вод визначають рівні контамінації їх вірусами, типовий склад, його зміни протягом сезонів року та оцінюють ефективність роботи очисних споруд.

Відкриті та підземні водоймища досліджують на наявність вірусів при виборі їх як джерел водопостачання, планово та за епідемічними показниками.

Вірусологічні дослідження питної води здійснюють як планово, так і за епідеміологічними показаннями, погодивши з епідеміологом кратність і точки відбору зразків води.

1. Відбір проб води.

Проби відбирають у стерильний посуд, найбільш доцільно використовувати флакони з-під вірусологічних середовищ об'ємом 500 мл. Після відбору проб води флакони закривають гумовими стерильними корками і закріплюють лейкопластирем.

В лабораторію проби доставляють у сумках-холодильниках чи пенопластових коробках з сухим льодом чи термоелементами.

Термін доставки - до 6 годин від моменту відбору. В лабораторії вода підлягає дослідженню в перші години з моменту надходження. При необхідності її можна зберігати при +4 град.С протягом доби, а при -20 град.С і довше.

Кратність вірусологічного контролю стічних вод за умов поточного санітарного нагляду складає 1 раз на місяць. Порівняльно досліджують проби води до і після очистки. Загальна кількість води для досліджень складає 500 мл.

Відбір проб води поверхневих водоймищ здійснюють з мостів, помостів, плавзасобів, але в місцях, де глибина водоймищ не менше 0,5 м. Не рекомендується відбирати проби з берега. Воду в намічених місцях відбирають за допомогою барометра. Поверхневі проби відбирають з глибини 10-15 см від поверхні води, придонні - 30-50 см від дна. В зимовий період роблять ополонки, але таким чином, щоб у воду не потрапило забруднення з льоду чи інструментів. Посуд відкривають безпосередньо перед відбором.

При дослідженні води з артезіанських свердловин проби відбирають після тривалої відкачки води до постійного динамічного рівня. Стерильні пляшки чи флакони заповнюють водою, щільно закривають стерильним корком. Загальний об'єм води для дослідження складає 3 літри.

Проби питної води відбирають безпосередньо або через стерильні гумові шланги в скляний посуд об'ємом 10-20 л. При цьому водозабірній кран тричі обпалюють спиртовим факелом, і воду спускають протягом 15 хв.

Для дехлорування води в 10-літрові склянки до їх стерилізації вносять тіосульфат натрію з розрахунку 20 мг на 1 л води. Воду набирають у склянки з дехлоратором. Об'єм однієї проби води - 10-20 л.

2. Концентрація вірусів із води за допомогою бентоніту.

В основу принципу концентрації вірусів покладено їх здатність до адсорбції на частках бентоніту в кислому середовищі (рН 4,0-5,0) з подальшою елюцією в лужні розчини елюантів (рН 8,5-9,5).

Елюції вірусів з бентоніту в лужному середовищі перешкоджають катіони. Тому комплекс вірус-бентоніт попередньо відмивають (знесолюють) дистильованою водою в кислому середовищі.

На ефективність концентрації вірусів впливають: вміст органічних речовин у досліджуваних об'єктах, наявність двух-трьохвалентних катіонів, ступінь мікробного забруднення.

2.1. Концентрація вірусів із стічної води.

Якщо стічні води містять фекалії, побутові відходи та інші тверді частки, то воду попередньо слід звільнити від них. Для цього воду центрифугують при 1000 об/хв протягом 15 хв. або фільтрують через паперовий або ватно-марлевий фільтри. Отриманий фільтрат використовують для наступної концентрації ентеровірусів.

Слід відзначити, що під час попередньої обробки, разом з твердими частками видаляється також частина ентеровірусів. Щоб це не позначилось на результатах дослідження, рекомендується здійснити додаткову десорбцію ентеровірусів з осаду стічних вод. Для цього до осаду додають 0,5 М фосфатний буфер (Nа2НРО4, рН 8,0-8,3) в 0,88 М розчині NaCl у співвідношенні 1:2 - 1:3 (вага:об'єм). Суміш ретельно перемішують 5-10 хв., а потім центрифугують при 3500 об/хв протягом 20 хв. Надосадову рідину використовують для дослідження.

Концентрацію ентеровірусів із стічних вод здійснюють за такою схемою. Відбирають 500 мл стічної води, звільненої від твердих часток, додають NaCl до 0,1 М концентрації (6,0 г NaCl), 1,0 мл 5% гелю бентоніту і по краплям та під контролем рН 1 М розчин HCl чи ацетатний буфер до рН 4,5-5,0. (Гель бентоніту можна одержати в Українській референс-лабораторії з поліомієліту.)

В цих умовах при кислих значеннях рН відбувається адсорбція ентеровірусів на бентоніті. Вже через 4-5 хв. струшування матеріалу утворюється комплекс вірус-бентоніт, який осаджують центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 10 хв. При цьому на дні посуду, в якому здійснювали центрифугування, утворюється білий осад бентоніту в комплексі з адсорбованими на ньому вірусними частками. Для знесолювання комплексу вірус-бентоніт до осаду додають 15-20 мл дистильованої води і за допомогою піпетування та інтенсивного струшування переводять осад у гомогенну суспензію, яку переносять у центрифужний флакон і центрифугують при 3000-4000 об/хв протягом 15 хв. Надосадову рідину видаляють. Осад використовують для елюції ентеровірусів.

Для цього до осаду додають 2-3 мл 0,05 М розчину трисбуферу на дистильованій воді з рН 9,0 і інтенсивно струшують протягом 4-5 хв. Суспензію далі центрифугують при 4000 об/хв протягом 15-20 хв. і прозору надосадову рідину відбирають піпеткою. Таким чином одержують елюат-1. Але повного звільнення ентеровірусів з поверхні часток бентоніту не відбувається. Тому до осаду знову додають 1,5-2 мл 0,05 М розчину трис-буферу і процедуру елюції повторюють. Елюат-2 об'єднують з елюатом-1 у стерильному флаконі. Отриманий вірусний концентрат, як правило, містить до 90% вірусів від вихідної їх кількості. Тривалість усієї процедури концентрації - біля 1 години.

Концентрат вірусів підлягає деконтамінації - звільненню від сторонньої мікрофлори.

2.2. Дослідження осаду стічних вод.

Зразки осаду стічних вод або активного мулу відбирають в стерильний посуд загальним об'ємом 0,5 л. Проби старанно перемішують, розливають у флакони по 250 мл і центрифугують при 1500 об/хв протягом 20 хв. Для десорбції вірусів до кожного зразку додають елюючий розчин з розрахунку 1:2-1:10. Використовують суміш фосфатного буферу (рН 8,2) (1 частину) і м'ясопептонного бульону (9 частин). За допомогою 1 М розчину NaOH або 1 М розчину HCl встановлюють рН суміші в межах 8,6-8,8, проби струшують протягом 10 хв., а потім центрифугують при 3000 об/хв протягом 30 хв.

Більш ефективно десорбцію вірусів із осаду стічних вод або активного мулу здійснюють за допомогою 0,88 М розчину MaCl на 0,5 М розчині фосфатного буферу (Nа2РО4 - КН2РО4), що має показники рН 8,2-8,4. При цьому вдається десорбувати до 87% від загальної кількості адсорбованих вірусних часток.

Надосадову рідину використовують для концентрації вірусів за допомогою бентоніту за методом, що наведений в підрозділі "Концентрація вірусів із стічної води".

2.3. Концентрація вірусів із води поверхневих водоймищ.

До 1 л досліджуваної води додають 0,75 мл 5% гелю бентоніту. Для інтенсифікації адсорбції ентеровірусів на бентоніті у воду вносять СаСl2 до 0,01-0,1 М концентрації. Показник рН суміші доводять до 4,5-5,0 за допомогою 1 М розчину НСl, який додають по краплям. Значення рН контролюють за допомогою рН-метру або індикаторного паперу. Суміш інтенсивно струшують 3-5 хв. При цьому утворюється комплекс вірус-бентоніт, що випадає в осад при низькошвидкісному центрифугуванні при 1000-1500 об/хв протягом 20 хв. Надосадова рідина видаляється, а осад з метою знесолювання суспендують в 10 - 15 мл дистильованої води (рН 4,5). Потім суспензію центрифугують при 3000-4000 об/хв протягом 15 хв.

Елюцію вірусів з бентоніту здійснюють, як і в випадку з стічною водою, з використанням 0,05 М трис-буферу з рН 9,0.

Отриманий елюат в об'ємі 3-5 мл дедаконтамінують від бактеріальної мікрофлори і використовують для виявлення ентеровірусів.

2.4. Концентрація вірусів із питної води.

До досліджуваної проби питної води в об'ємі 20 л додають 5% гель бентоніту в кількості 5 мл. З метою інтенсифікації адсорбції ентеровірусів на бентоніті та прискорення седиментації осаду в досліджувану воду вносять стерильний розчин хлориду кальцію до 0,01 М концентрації. Суміш струшують 1-3 хв. Утворений комплекс вірус бентоніт осаджують або природним відстоюванням при 4 град.С протягом 14-18 годин, або низько-швидкісним центрифугуванням при 1000-1500 об/хв. протягом 20-30 хв.

Надосадову рідину зливають. Після деконтамінації осад вносять безпосередньо в основу середовища для виявлення ентеровірусних бляшок, якою заливають моношари чутливих культур клітин.

Через 48 годин після інкубації в термостаті при 36 град.С заражених моношарів культур клітин в них формуються вірусні бляшки, які характеризують кількісний вміст ентеровірусів в досліджуваній пробі води.

Якщо бляшки не виявляються під бентонітовим покриттям, останнє використовують як вірусвмісний матеріал для подальшого дослідження.

3. Вірусологічне дослідження грунту.

Зразки грунту відбирають у стерильні флакони переважно з поверхневих шарів з глибини 0-20 см, інколи - з глибини 50- 100 см для визначення процесів міграції вірусів у грунтові води. До наважки грунту в 5 г, яка міститься в стерильному флаконі об'ємом 100 мл, додають 50 мл 0,5 М розчину фосфатного буферу чи (рН 8,5) чи м'ясного екстракту на гліцериновому буфері (рН 9,5-10,0).

Пробу грунту перемішують і інтенсивно струшують протягом 5 хв. Отриману суспензію грунту центрифугують при 3000 об/хв протягом 10-15 хв. Концентрацію вірусів з надосадової рідини за допомогою бентоніта здійснюють за методикою, наведеною для стічних вод.

4. Вірусологічне дослідження продуктів харчування.

Здійснють за епідеміологічними показаннями при визначенні етіології захворювань людей з харчовим фактором передачі.

Зразки рідких харчових продуктів (молоко, кефір тощо) в об'ємі 200-300 мл обробляють реагентами для видалення білків, ліпідів. З цією метою до проби продукту об'ємом 10 мл додають 0,3 г кристалічного натрію цитрату (Nа2С6Н5О7 5,5 Н2О). Після перемішування протягом 20 хв на магнітній мішалці до проби додають 10 мл фреону-113 (відносна густина 1,36) і гомогенізують 2 хв. Суміш центрифугують при 3000 об/хв протягом 30 хв. Надосадову рідину використовують для подальшої концентрації вірусів за допомогою бентоніту або поліетиленгліколю (ПЕГ-4000 або ПЕГ-6000).

Напівтверді харчові продукти по 25-30 г піддають екстракції вірусів у рідині з лужними значеннями рН (0,5 М розчин фосфатного буферу, 0,1 М розчин гліколевого буферу) з наступним концентруванням вірусів за допомогою ПЕГ-4000 або ПЕГ-6000.

Аналогічні дослідження проводять із зразками твердих харчових продуктів (овочами).

Деконтамшацію вірусного концентрату здійснюють за допомогою ефіру або антибіотиків. Етиловий ефір використовують на проміжних і заключних етапах концентрації вірусів. Після центрифугування до осаду (вірус-бентоніт) вносять ефір у співвідношенні 1:5, суміш струшують і флакони під ватно-марлевими корками витримують у вакуумній камері при +4 град.С 18-24 години. Елюати доцільно обробляти ефіром у співвідношенні 1:1.

Антибіотики до елюату додають із розрахунку: пеніцилін 200-1000 ОД/мл, стрептоміцин - 200-500 мкг/мл (в залежності від інтенсивності контамінації мікроорганізмами). Для досягнення максимального ефекту деконтамінації названі способи можна поєднувати.

1. Випадки ГВП. Проведені дослідження.

Випишіть кількість пацієнтів з ГВП, проби фекалій яких були надіслані вашу лабораторію, а також кількість таких пацієнтів з однією або більше пробами фекалій. Випадок ГВП з кількома пробами фекалій занотовується як цифра 1 у другій колонці. Під рубрикою "загальна кількість проб фекалій" впишіть всі проби фекалій хворих з ГВП.

2. Випадки ГВП. Результати.

Пам'ятайте, що лівий бік цієї таблиці відноситься до проб фекалій, а правий - до випадків ГВП. "Проби фекалій (усі)" - це проби, аналіз яких закінчено, тобто з повною ідентифікацією вірусів або негативними результатами аналізу. Всі інші проби є "такими, що досліджуються", і результати по ним слід записати в нижньому рядку в наступному кварталі.

Усі проби з поліовірусами повинні бути вміщені до стовпчику "позит. проба на поліовірус". Усі проби з неполіомієлітним ентеровірусом повинні бути вміщені до стовпчику "позит. проба на ЕВ". Таким чином, проба, із якої виділені поліовірус та ЕСНО-вірус, повинна бути представленою у двох стовпчиках.

Під рубрикою "позит. проба на поліовірус" представте загальну кількість ПАЦІЄНТІВ З ГВП, з проб яких було виділено поліовірус, під рубрикою "П 1"- випадки, з проб яких було виділено поліовірус 1 типу і так далі. Якщо з однієї або декількох проб фекалій тієї ж самої особи виділено кілька типів поліовірусів, цей випадок слід розмістити під рубрикою "змішані".

3. Контакти (особи, що спілкувалися з хворим).

Ті ж самі інструкції відносяться і до результатів проб фекалій контактів. Кількість проб фекалій і кількість контактів повинні бути однаковими, оскільки для кожного контакту потрібна тільки одна проба. Якщо від однієї особи надіслано, більш ніж одна проба, їх можна змішати і піддати аналізу як одну пробу.

4. Показники ефективності роботи.

Період часу між початком паралічу і збором проби фекалій:

В стовпчик "<= 14 діб" слід вписати випадки, коли першу пробу фекалій було зібрано не пізніше 14 діб після початку паралічу.

Період часу між збором і отриманням проби.

Представте дані про УСІ проби, термін взяття яких відомий. Якщо відомо, що проби, які надійшли більше ніж через три доби після їх збору, зберігалися при температурі - 20 град.С, то в рубриці "Примітки" слід вказати їхню кількість.

Стан отриманих проб.

Для того, щоб пробу можна було зареєструвати як "задовільної якості", вона повинна задовольняти усім наведеним критеріям. Якщо проби надсилають з безводними холодовими елементами, слід вимірити температуру в контейнері, яка повинна бути нижче за 8 град.С.

ПОЛІОМІЄЛІТ (хвороба Гейне-Медіна, дитячий спинальний параліч) - це гостра, інфекційна хвороба з явищами загальної інтоксикації й ураженням нервової системи переважно у вигляді гострих млявих парезів та паралічів, для яких характерна втрата сухожильних рефлексів, атонія та атрофія уражених м'язів. Усі три типи поліовірусів здатні спричиняти паралітичне захворювання.

При поліомієліті первинне розмноження вірусу відбувається переважно в епітеліальних клітинах тонкої кишки, у меншій кількості - у клітинах епітелію глотки. Внаслідок цього відбувається активація місцевого імунітету, яка пов'язана, перш за все, з синтезом специфічних секреторних IgА. Це має суттєве значення для захисту організму при його повторному інфікуванні. Накопичення вірусу з наступною його генералізацією відбувається у лімфатичних регіонарних вузлах, після цього настає дисемінація вірусу у кров з можливим утворенням вогнищ розмноження у різних органах і тканинах, лімфатичних вузлах і наступним ураженням клітин передніх рогів спинного мозку та ядер рухових черепних нервів у стовбурі великого мозку. Але інфекційний процес частіше переривається на стадіях розмноження вірусу у кишечнику і первинної (малої) вірусемії. Тому у більш ніж 90% інфікованих осіб не відмічаються клінічні симптоми захворювання (вірусоносійство), у 4-8% - захворювання проходить в абортивній формі без порушень рухомості. Лише у 1-10 із кожних 1000 інфікованих осіб (0,1-1,0%) розвивається паралітична форма з ураженням мотонейронів клітин переднього рогу спинного мозку, денервацією м'язів з наступним стійким випаданням їх функцій. Ураження цих субстанцій - результат складних обмінних порушень, які виникають при взаємодії нервових клітин і поліовірусу. Постійною морфологічною ознакою вважають порушення будови тигроїдної речовини клітин переднього рогу спинного мозку, його тигроліз. Деструкції підлягають ядра й ядерця клітин нейронів, що є ознакою необоротньої зміни у клітині і призводять до стійкого випадіння функції. На місці клітин, що загинули, відбувається розростання гліозної тканини, функція клітин необоротно втрачається.

У передніх рогах спинного мозку поряд із клітинами, що змінилися й розпалися, можуть бути і незмінені клітини. Ця мозаїчність ураження мотонейронів пояснює безладність, асиметрію парезів і паралічів, типових для поліомієліту. Залежно від превалюючих уражень та клінічних проявів розрізняють:

- поліомієліт без уражень нервової системи: 1) інапарантна форма, 2) абортивна форма;

- гострий поліомієліт з ураженням нервової системи:

1) менінгіальна, непаралітична форма, 2) паралітична форма спинальна, бульбарна, понтинна та змішана (понтоспинальна, бульбоспинальна, бульбопонтоспинальна).

Спинальна форма протікає з локалізацією процесу у шийному, грудному, поперековому відділах спинного мозку, може бути обмеженою чи розповсюдженою.

Поліомієліт диференцюють за вираженістю клінічних симптомів перебігу на: легку, середньо-тяжку і тяжку форми. За наслідками захворювання розрізняють випадки із: повним відновленням порушених функцій, із залишковими розладами руху у без трофічних порушень чи з ними.

Інкубаційний період при різних формах поліомієліту частіше становить 7-14 діб, але може скорочуватися до 2-х діб чи продовжуватись до 35 діб.

Інапарантна форма поліомієліту проходить без клінічних проявів, але із серологічними змінами в організмі.

Абортивна форма супроводжується підвищенням температури, головним болем, іноді - болем у горлі та катаральними явищами, слабістю, млявістю, зниженням апетиту, нудотою, блюванням. Ці ознаки можуть доповнюватися пітливістю, гіперестезією, діареєю, болем у животі. Через 3-7 днів усі явища зникають, відбувається повне видужання. Без чітких епідеміологічних даних і лабораторного підтвердження діагностика цієї форми становить великі труднощі.

Менінгіальна форма у дітей протікає по типу серозного менінгіту. Під час першої хвилі лихоманки (2-3 доби) вона повністю нагадує абортивну. Це так звана "мала хвороба". Після зниження температури дитина відчуває себе добре 1-3 дні, але хвороба може мати одно- або двохвильовий перебіг. Потім відбувається знову підвищення температури і настає "велика хвороба" з усіма ознаками менінгіту: різкий головний біль, повторне блювання, ригідність м'язів потилиці, симптоми Керніга, Брудзинського, гіперестезія. У церебральній рідині виявляють зміни, характерні для серозного менінгіту: помірний лімфоцитарний цитоз, підвищення вмісту білку. Через 2-3 тижні настає повне видужання, проте ще деякий час спостерігається астенічний синдром. Для дорослих двохвильова лихоманка менш типова, ніж для дітей.

Паралітичні форми поліомієліту розвиваються з певною послідовністю. У перебігу хвороби розрізняють стадії: інкубаційну, препаралітичну, паралітичну, відновлення (реконвалесценції) та резидуальну.

Період препаралічів передує розвитку паралічів. Частіше він продовжується 3-6 діб, але може скорочуватись до 36-48 годин чи розтягуватися на більш тривалий час. Описані випадки миттєвого розвитку паралічів, так звані "вранішні паралічі", але трапляються вони рідко.

Захворювання починається гостро з підвищення температури та появи симптомів інтоксикації. Характерною вважається двохвильова чи двогорба температурна крива, для першої хвилі типовим є перебіг поліомієліту як "малої хвороби". Вже у цей період виникають симптоми, що вказують на залучення до процесу корінців спинного мозку і оболонок головного мозку. Вони можуть бути обгрунтуванням для ранньої діагностики поліомієліту. У хворих розвиваються головний біль, блювота, різноманітні больові симптоми, менінгіальні знаки, судоми, мязові спазми, вегетативні розлади - пітливість, зниження артеріального тиску, прискорення пульсу, червоний дермографізм.

Місцевий біль і гіперестезії можуть бути виражені настільки сильно, що маскують парези і паралічі, що з'являються в найближчий час. Внаслідок болю хворі приймають вимушені пози, у них відмічаються симптоми напруження мязів спини. Паралічі з'являються раптово. Іноді підвищення температури триває протягом кількох діб, потім критично падає, і вже тоді розвиваються парези й паралічі.

Загальноінфекційні симптоми зменшуються, свідомість прояснюється, але біль і вегетативні порушення можуть тривати чи навіть посилюватися, парези і паралічі, розлад рухів прогресують. Тривалість паралітичного періоду становить до 6 діб, хоча інколи він розтягується до двох тижнів. З 5-10 доби паралітичного періоду ясно визначається форма ураження і прогноз захворювання.

Клінічна форма вогнищевих спинальних форм поліомієліту полягає у порушенні функцій різноманітних мязів. Ураження мязів шиї призводить до їх слабкості, хворий не може утримувати голову у вертикальному положенні. При пальпації паретичних м'язів шиї відмічається слабке їх напруження, млявість, зниження сили. Серед мязів верхніх кінцівок найчастіше до процесу залучається дельтовидний м'яз, внаслідок чого стає неможливим підведення та відведення руки. Параліч мязів верхніх кінцівок співпадає із сегментарною інервацією діафрагми, тому парези рук можуть супроводжуватися ураженням діафрагми.

У нижніх кінцівках частіше вражаються мало - і великогомілкові м'язи, м'язи стегна, чотирьохголовий розгинач гомілки.

Згідно з даними більшості авторів, при поліомієліті найчастіше уражається люмбальний відділ спинного мозку, що призводить до розвитку парезів і паралічів м'язів кульшового суглобу та нижніх кінцівок. Ступень ураження м'язів може бути різним - від легких, що швидко минають до тяжких, розповсюджених, з ураженням м'язів усієї кінцівки і тулуба, найчастіше у вигляді параплегій. У подальшому поліомієліт може набувати висхідного характеру: процес, починаючись з нижніх кінцівок, захоплює верхні кінцівки, шию. Ураження діафрагми може призвести до зупинки дихання.

Параліч охоплює тільки частину м'язів, у той час як функція інших зберігається . Таке "клаптеподібне" ураження призводить до того, що між ними порушується звичайне взаємовідношення, виникають контрактури, деформації, які важко піддаються вправленню. В уражених кінцівках спостерігаються порушення кровообігу, вони стають холодними на дотик, шкіра набуває синюшного відтінку, уповільнюється ріст кісток.

Бульбарна форма поліомієліту супроводжується порушенням функцій довгастого мозку і варолієвого мосту та інших найважливіших структурних утворень мозкового стовбуру. Залежно від локалізації та глибини ураження ядер черепних нервів, що розташовані у цих утвореннях, розрізняють бульбарний поліомієліт з уражєнням верхньої та нижньої групи черепних нервів.

Якщо патологічний процес локалізується лише у нижньому відділі моста, уражується ядро лицевого нерва, розвивається парез або параліч мімічних мязів, що клінічно характеризується згладженістю носогубної складки, розширенням очної щілини, зміщенням кута рота у здоровий бік, неповним заплющенням ока, розгладженістю половини лоба. На боці паралічу відмічається рідке моргання, сльозоточивість, при вискалюванні зубів кут рота зміщується у здоровий бік. Відновлення функції мімічних м'язів звичайно починається з 10-14 доби і закінчуєтьсяу більшості випадків повним видужанням. Така форма хвороби зветься понтинною і зустрічається як ізольована дуже рідко.

Бульбарна форма відзначається гострим початком і тяжким перебігом з великим відсотком летальності. На фоні значного підвищення температури спостерігаються різкий головний біль, нудота, блювання, незначні менінгіальні симптоми. Вже на 2-3 добу з'являються, ністагм, порушення ковтання, кашель під час їжі та пиття, витікання води через ніс, неможливість проковтнути слину і слиз. До парезу м'язів глотки можеприєднатись ураження м'язів гортані - глухий голос, іноді афонія, задишка, порушення ритму дихання. У випадку бульбарного паралічу з ураженням дихального центру порушується ритм дихання, швидко прогресують судинні розлади, які поглиблюються при одночасному ураженні судиннорухового центру. Спостерігається тотальний цианоз, різке зниження артеріального тиску.

Нерідкі випадки поєднання уражень черепних нервів із спинальними розладами. Коли порушення функції життєво важливих цєнтрів посилюється спинальними розладами, виникають понтоспинальні, бульбоспинальні і бульбопонтинні форми поліомієліту.

У відновлювальний період і період залишкових явищ іде поступове відновлення порушених функцій. Перші рухи зявляються на 15-20 добу хвороби і пізніше. Особливо активно відновлювальний процес іде протягом перших трьох місяців хвороби, потім він уповільнюється, але за сучасними даними може тривати десятиріччя.

Після закінчення періоду відновлення стійкі парези і паралічі розглядаються як залишкові явища - резидуальний період. Глибокі паралічі призводятьдо атрофії м'язів, деформації суглобів, сухожиль, зв'язок, що спричиняє відставання у рості, остеопороз, вивихи, трофічні зміни. У стадії залишкових явищ нерідко спостерігаються кіфоз, лордоз, сколіоз, грижі черевної стінки, кінська або п'яткова стопа, косолапість та інші аномалії.

Небезпечність розвитку паралічу при інфікуванні поліовірусом підвищується за умов активного фізичного навантаження, тонзилектомії, внутрішньом'язових інфекцій. Параліч уражає ту кінцівку, в яку проводиться ін'єкція. Тонзилектомія підвищує небезпечність захворювання на бульбарну форму поліомієліту. У зв'язку з підвищеним ризиком виникнення паралічу не раціонально проводити хірургічні втручання при реєстрованих спалахах поліомієліту. Доцільно проводити лише найбільш важливі ін'єкції.

Поліомієліт - захворювання переважно дитячого віку. Але відомі епідемії серед дорослих. Своєрідність пєребігу його у дорослих полягає у тому, що нетиповою є двохвильова лихоманка, больовий синдром більш інтенсивний, частіше порушуються функції тазових органів, паралітичний період довший, спостерігається більш в'яле відновлення рухів.

У типових випадках діагностика поліомієліту особливих труднощів не становить. Наявність в'ялих паралічів, частіше нижніх кінцівок, які з'явилися після гарячкового періоду, їх асиметрія, проксимальна локалізація, збереження чутливості характерно для поліомієліту. Однак у сучасних умовах, коли реєструються поодинокі захворювання і легкі форми перебігу хвороби у щеплених, установити діагноз в окремих випадках важко. Необхідно виключити захворювання з обмеженою рухомістю в кінцівках, пов'язаних з хворобами опорно-рухового апарату - травма, епіфізарний остеомієліт, ревматизм з обмеженою рухомістю в суглобах тощо.

Найчастіше в'ялі розлади руху необхідно диференціювати з синдромом Гійена-Барре, травматичним невритом сідничого нерву, поперековим мієлітом.

Синдром Гіена-Барре - полірадикулоневрит, який характерезується периферичними паралічами м'язів кінцівок, є ускладненням різних інфекційних хвороб (інфекційно-алергічної природи). Але полірадикулоневриту властиві дистальна локалізація парезів і паралічів, їх симетричний поступовий розвиток, порушення чутливості. Поряд з больовим синдромом виникають гіпо- і гіперплазії, зниження м'язево-суглобної чутливості в пальцях кінцівок. Після видужання резидуальні зміни незначні.

Травматичний мієліт з ураженням сідничого нерву, який виник у результаті ектопірованої ін'єкції в сідничий м'яз, потребує диференціації від індукованого поліомієліту. Ймовірність того, що захворювання має поліомієлітну етіологію, висока у випадках, коли з появою паралічу співпадає підвищення температури або поява паралічу носить раптовий характер.

Значні труднощі виникають при диференціальній діагностиці поліомієліту і захворювань, що об'єднані в групу поліомієлітоподібних. Найчастіше вони спричиняються ентеровірусами Коксакі та ЕСНО і відрізняються гострим виникненням паралічів без попереднього початкового періоду, меншою тяжкістю, швидким відновленням порушених функцій уражених м'язів. Залишкові явища у вигляді стійких паралічів і парезів, атрофій реєструються рідко. Винятком є віруси Коксакі А-7 та ентеровірус типу 71, які спричиняють паралітичні захворювання, що не відрізняються від бульбоспинальних форм поліомієліту. Постановка діагнозу в таких випадках можлива лише за умов проведення вірусологічного дослідження.

Поліомієлітоподібна форма кліщового енцефаліту не має ознак, характерних для препаралітичної стадії поліомієліту, розвиток парезів не раптовий, а повільний, спочатку не дуже помітний. Беруть до уваги перебування в епідемічних зонах, укуси кліщів, професію хворого, вік. При кліщовому енцефаліті більш характерні паралічі м'язів шиї, верхніх кінцівок.

Понтинна форма поліомієліту потребує виключення паралічів лицевого нерву іншої причини. У разі поліомієлітної етіології ураження лицевого нерву не має болі, гіперакузії, сльозотечі, порушення смакової чутливості передніх 2/3 язика на боці пошкодження.

ЗГІДНО З РЕКОМЕНДАЦІЯМИ ВООЗ доцільна двоступінчата постановка діагнозу: попередня - за даними епідеміологічних і клінічних спостережень, і заключна - з урахуванням результатів вірусологічного і серологічного дослідження.

Усі хворі з підозрою на поліомієліт незалежно від тяжкості перебігу захворювання повинні бути госпіталізовані. Лікування поліомієліту залежить від форми і стадії хвороби. Воно повинне бути комплексним і відбуватися за участю лікарів різних спеціальностей.

У плані лікування необхідно передбачити методи підвишення імунобіологічних сил організму, боротьбу з інтоксикацією і порушенням вісцеральних функцій, болючих явищ, зняття реактивних запальних змін, застосування стимулюючої та відновлюючої терапії, лікування залишкових явищ, соціально трудове улаштування хворих при наявності стійких залишкових явищ. Але всі ці компоненти лікування слід використовувати не одночасно, а обережно, поетапно.

Етіотропних засобів для лікування хворих на поліомієліт немає. Інтерферон (реаферон) та інтерфероногени відчутного ефекту не дають. Введення імуноглобуліну не гарантує від розвитку паралічів.

У препаралітичній і паралітичній стадіях потрібен повний спокій, суворий постільний режим, призначення анальгетиків, седативних засобів, детоксикація, переважно пероральна або у вигляді внутрішньовенних вливань особливо поєднані з дегідратацією. Ефективними є гарячі вологі обгортання уражених м'язів. Треба стежити, щоб положення тіла, уражених кінцівок хворого було правильним. Ранній ортопедичний режим попереджує розтяг м'язів, розвиток деформацій і контрактур.

Призначають також гіпосенсибілізуючі, протизапальні, антигістамінні препарати.

Хворі з бульбарними розладами потребують проведення реанімаційних заходів із застосуванням апаратури для штучної вентиляції легень, відсмоктування слизу з дихальних шляхів.

У стадії відновлення застосовують теплові процедури, масаж, легку лікувальну гімнастику.

Медикаментозне лікування повинне бути вкрай обережним. Велика кількість ліків лише обтяжує перебіг захворювання.

Стимулюючу терапію можна починати лише після повного закінчення активного процесу у спинному мозку (тобто не раніше 3-4 тижня), вона повинна бути необтяжливою для хворого, вибір - індивідуальний.

Не раніше 14-20 доби від початку хвороби у період зменшення болю і появи рухів призначають стимулятори міжневральної та мотоневральної провідності - прозерин, дибазол. Призначають також галантамін, секурінін, нивалін, стефоглобін. Через місяць, якщо потрібно курс лікування повторюють. Показані курси судинних, метаболічних засобів, антиоксидантів: актовегін, істенон, трентал, ноотропіл (пантагам, фенібут), вітамін Є, епаден.

Застосовуються амінокислоти (глутамінова кислота, сульфатирозін), які поліпшують обмін речовин і позитивно впливають на процеси відновлення. Для поліпшення функції м'язів призначають вітаміни групи В, нікотинову кислоту, препарати, які утримують солі фосфору, кальцію, калію, ліпоцеребрін, метіонін, токоферола ацетат. До курсу лікування включають також біогенні стімулятори (пірогенал, алое, ФіБС та ін.).

У ранньому періоді відновлення протягом 20-25 діб призначають анаболічні гормони (неробол, ретаболіл). Ще раз треба підкреслити, що не слід призначати всі препарати одночасно.

Діти, хворі на поліомієліт, повинні оглядатися лікарем ортопедом для вирішення питання ортопедичного лікування і протезування. Для усунення деформацій і поліпшення функцій кінцівок показані фізіотерапевтичні лікувальні засоби, санаторнокурортне лікування у спеціалізованих санаторіях (Євпаторія, Одеса).

Тривалий догляд за хворими, їх етапне лікування і реабілітація здійснюються шляхом спадкоємності різних лікувальних закладів (стацюнар-поліклініка-санаторій).