Про удосконалення заходів щодо попередження захворювань на поліомієліт в Україні

(1) - число доз оральної поліомієлітної вакцини вакцини (ОПВ) згідно з документами про щеплення або за словами батьків;

(2) - число доз ОПВ при додаткових імунізаціях, якщо про це є відомості;

(3) - дати (день/місяць/рік);

(4) - дата останнього щеплення ОПВ;

(5) - дата народження, якщо невідомо, указати вік у роках і міс.;

(7) - дата надання даних (реєстрації) в СЕС;

(8) - дата розслідування випадку;

(9) - дата отримання першої проби фекальних мас;

(10) - дата отримання другої проби фекальних мас;

(11) - дата повторного клінічного обстеження;

(12) - підвищення температури на початку паралічу: 1 = так, 2 = ні, 9 = невідомо;

(13) - швидкий розвиток паралічу (протягом 4 днів): 1 = так, 2 = ні, 9 = невідомо;

(14) - локалізація: 0 = тільки параліч лицевого нерву, 1 = кінцівки, 2 = кінцівки та дихальні м'язи (бульбарний), 3 = тільки бульбарний, 9 = невідомо;

(15) - наявність асиметричного паралічу: 1 = так, 2 = ні, 9 = невідомо;

(16) - огляд через 60 днів: 1 = залишковий параліч, 2 = відсутність паралічу, 3 = втрачено з-під нагляду, 4 = смерть до наступного обстеження;

(17) - ізоляція поліовірусу: 1 = так, "дикий", 2 = так, вакцинний, 3 = так, вірус не типовано, 4 = суміш, "дикий" + вакцинний, 5 = не виділено, 6 = проба не оброблена;

(18) - ізоляція ентеровірусу: 1 = так, 2 = ні, 3 = проба не досліджена;

(19) - заключна класифікація: 0 = не ГВП, 1 = підтверджено, 2 = виключено, 3 = поліомієлітоподібне захворювання, 4 = можливо вакцино-асоційований, 5 = вакциноасоційований;

(20) - заключний клінічний діагноз після 60 днів від початку паралічу: 1 = полірадікулоневрит / синдром Гійєна-Барре /синдром Ландрі/, 2 = поліомієліт, 3 = травматична невропатія, 4 = пухлина, 5 = параліч лицевого нерву, 6 = інше.

Підпис відповідальної особи _____________________ Дата ______ * форми, які заповнюються в районних СЕС в останній день місяця; ** форми, які заповнюються в обласних/міських СЕС в перший день наступного місяця.

Підпис відповідальної особи ___________________ Дата ________ * форми, які заповнюються в районних СЕС в останній день місяця; ** форми, які заповнюються в обласних/міських СЕС в перший день наступного місяця.

Вірусологічні лабораторії здійснюють моніторинг за циркуляцією вірусів поліомієліту серед населення країни та в об'єктах довкілля. Лабораторні вірусологічні дослідження дають можливість диференціювати випадки паралітичного поліомієліту та гострого в'ялого паралічу (ГВП), що спричинені іншими чинниками, у тому числі і ентеровірусами. Спостереження за циркуляцією поліовірусів в навколишньому середовищі та вивчення рівня колективного імунітету важливі для оцінки епідемічної ситуації з поліомієліту в країні та ефективності профілактичних заходів.

Організація роботи вірусологічних лабораторій

Якісна робота вірусологічних лабораторій можлива за умов стандартизації методів досліджень та забезпечення вірусологічних лабораторій відповідним обладнанням, культурами клітин та середовищами для них, діагностичними препаратами, реактивами тощо. Важливим є використання досвіду вірусологічних лабораторій інших країн, дотримання рекомендацій ВООЗ щодо методики проведення вірусологічних досліджень.

Перелік необхідного обладнання:

Вірусологічний бокс, термостат (33 град. - 38 град.С), СО2 - інкубатор. Для збереження культур клітин і вірусовмісного матеріалу - холодильник побутовий, холодильні камери на 20 град.С, - 40 град.С чи - 70 град.С. Дистилятор, центрифуга, автоклав, сухожарова шафа. Посуд - флакони для культур клітин і взяття матеріалу з корками, що не мають токсичної дії, планшети 96-лункові для культур клітин, рН - метр, світловий мікроскоп, краще інвертований.

Культури клітин

При проведенні вірусологічних досліджень необхідно використовувати перещеплювані лінії клітинних культур НЕр-2 та RD, в окремих випадках, як виняток, культури Vero, Rh, Hela, інші чутливі культури людського або мавп'ячого походження. Культура клітин НЕр-2 найбільш чутлива до поліовурусів і вірусів Коксакі В, RD - до вірусів Коксакі А, вірусів поліомієліту і ЕСНО. В кожній лабораторії рекомендується створити банк клітин, в якому клітинні лінії можуть зберігатися певний час без втрати їх життєздатності. Необхідність створення банку пояснюється тим, що чутливість культур клітин до поліо- та інших ентеровірусів при пасажах може знижуватися, не виключається також і можливість їх контамінації. Тому час від часу треба перевіряти чутливість культур до еталонних штамів, вірусів поліомієліту. Небажано проводити більше 20-25 пасажів. Після зазначеної кількості пасажів, зміні чутливості чи у випадку контамінації клітинних ліній необхідно повернутися до банку клітин.

Забезпечення вірусологічних лабораторій культурами клітин НЕр-2 і RD здійснює Українська референс-лабораторія з поліомієліту (УРЛП).

Середовища для культур клітин

Робота з клітинними культурами може бути ефективною тільки за умов дотримання стерильності, якісної обробки посуду та використання поживних середовищ і збалансованих розчинів високої якості. Культивувати клітини можна на середовищах Ігла, Ігла МЕМ, 199 та інших. Якість свіжовиготовлених в лабораторії партій середовищ перевіряють при вивченні ефективності вирощування на них культур клітин, а також шляхом титрування відомого еталонного штаму вірусу в культурах клітин з таким середовищем. При відсутності токсичної дії середовища на клітини і відповідності титру вірусу відомим величинам, середовище використовують для подальших досліджень. Поживні середовища можуть бути ростовими та підтримувальними. Ростові середовища, або середовища росту, містять до 10% сироватки крові великої рогатої худоби чи ембріональної сироватки (сироватки повинні бути інактивовані і кожний флакон перевірений на стерильність та відсутність цитотоксичності). Середовища росту сприяють розмноженню клітин, їх швидкому росту і утворенню добре сформованих моношарів. Для репродукції в культурах клітин вірусів використовують середовища підтримки, які взагалі не містять сироватки, або в кількості не більше 2%. Для успішного культивування клітин необхідно дотримуватися правил асептики, створювати умови, що перешкоджають росту бактерій та цвільових грибів. З цією метою доцільно використовувати антибіотики. Застосовують пеніцилін (натрієва сіль бензилпеніциліну) та стрептоміцин (хлор-кальцієвий комплекс), які вносять в поживні середовища безпосередньо перед вживанням: 100 ОД/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Можна використовувати також гентаміцин (200 ОД/мл), канаміцин та лінкоміцин (100 ОД/мл), неоміцин (50 ОД/мл), ністатин (50 ОД/мл) та інші.

Культивування перещеплюваних культур клітин

Перещеплювані клітинні культури вирощують у вигляді моношару на поверхні скла у флаконах, матрацах, пробірках. Для пересівання відбирають культури з чіткими межами між клітинами, що мають типову морфологію. Наявність у полі зору великої кількості округлих клітин, поява клітин з вакуолями та іншими ознаками патології робить дану генерацію непридатною для пересівання. У таких випадках для подальшої роботи використовують клітини з банку. Невелика кількість округлих клітинних елементів, які при незначному струшуванні змиваються з поверхні моношару, не є перешкодою їх використання для вірусологічних досліджень чи для подальшого перещеплювання. Під час росту клітин (після другої - третьої доби) спостерігається зміна рН у кислий бік, при цьому іноді частина клітин відривається від поверхні скла і потрапляє в поживне середовище. Зміна рН в кислий бік, що наступила на першу - другу добу після пасажу клітин та помутніння середовища також можуть бути пов'язані з контамінацією мікроорганізмами. З такою культурою працювати не можна, слід повернутися до банку клітин. Вибрану для пересівання культуру клітин знімають з поверхні скла за допомогою трипсину (0,25%) або версену (0,02%). Після дворазового відмивання моношарів невеликою кількістю розчину трипсину чи версену їх вміщують в термостат на 10-15 хвилин, після чого до клітин додають невелику кількість середовища росту. Ним старанно змивають клітини зі скла. Одержану суспензію клітин після підрахунку в лічільній камері розводять середовищем росту до концентрації, необхідної для посіву. У флакони об'ємом 100 мл розливають по 20 мл суспензії, що містить 40 - 60 тис. клітин в 1 мл, у матраци об'ємом 1,5 л вносять по 150 мл суспензії, в 1 мл якої міститься 60-70 тис. клітин. У пробірки вносять по 180-300 тис. клітин в об'ємі 1 мл. Формування моношару відбувається за 48 год.

З метою запобігання контамінації культури клітинами іншого походження не дозволяється у культурному боксі одночасно працювати більше ніж з однією лінією клітинних культур.

Створення банку клітин

Отримані в Українській референс-лабораторії клітини тричі перещеплюють, заморожують і зберігають при t - 70 град.С, - 40 град.С або в умовах рідкого азоту, дотримуючись правил кріоконсервування.

1. Кріоконсервування (замороження) клітинних культур.

На першому етапі отримують суспензію клітин за допомогою трипсину або версену (див. вище). Далі суспензію центрифугують при 1000 - 2000 об/хв 10 хвилин, зливають надосадову рідину. Ресуспендують клітини в середовищі для заморожування так, щоб кінцева концентрація була не менша за 10 7 клітин/мл. З цією метою можна використовувати 2 типи середовищ для заморожування:

- ростове середовище + 10% ДМСО (диметилсульфоксид)

- ростове середовище + 10% стерильного гліцерину, не

токсичного для клітин.

Клітинну суспензію розливають по 1 мл в пробірки для заморожування з кришками, що загвинчуються, або в ампули, відмічають дату, тип клітин, номер пасажу та прізвище відповідальної особи. Пробірки вміщують у пенопластові контейнери, які дозволяють охолоджувати клітини з постійною швидкістю і зберігають в холодильнику при -70 град.С. Термін збереження життєздатності культур клітин при -70 град.С складає близько року, іноді й більше, хоча частина популяції клітин при цьому втрачає життєздатність. При -40 град.С можна зберігати клітини протягом 0,5 року. В рідкому азоті час зберігання клітин необмежений.

2. Поновлення заморожених культур клітин

Пробірку із замороженими клітинами вміщують у полиетиленовий пакет і швидко розморожують у водяній бані при 36 град.С протягом 3-х хвилин. Після цього протирають поверхню пробірки 70% етанолом, обережно відкривають пробірку в боксі. Для зменшення токсичної дії консервантів (ДМСО чи гліцерину) в пробірку з клітинною суспензією поступово по краплям додають 1-2 мл поживного середовища, постійно - струшуючи вміст пробірки. Після цього негайно центрифугують клітини при 1000-2000 об/хв протягом 3-4 хвилин. Зливають надосадову рідину, яка містить консервант. Відмиті клітини ресуспендують в середовищі росту до кінцевої концентраціі 40 - 60 тис. клітин/мл і заливають в порожній посуд, що призначений для культивування культур (флакон, матрац). Наступного дня, коли клітини починають формувати моношар, перевіряють їх якість і замінюють середовище росту на свіже, щоб видалити залишки консерванту і нежиттєздатні клітини.

Титрування вірусів у культурах клітин за цитопатичною дією (ЦПД)

Метод титрування вірусу за ЦПД грунтується на визначенні найбільшого розведення вірусвмісного матеріалу, в якому вірус може спричинити ЦПД у 50% інфікованих культур клітин. Ця величина називається 50% тканинною цитопатогенною дозою (ТЦД50).

Для титрування вірусів спочатку проводять звільнення внутриклітинного вірусу і очищення вірусвмісного матеріалу від клітинного детриту шляхом його заморожування та розморожування з подальшим центрифугуванням при 1000 - 2000 об/хв протягом 3-5 хв.

Для інфікування культур клітин готують десятиразові розведення досліджуваного вірусвмісного матеріалу, використовуючи стерильні сольові розчини (фізіологічний розчин, розчин Хенкса тощо). Розведення краще готувати в стерильних флаконах від пенициліну. Для отримання кожного наступного розведення слід міняти піпетки (наприклад, стерильною кінцевою піпеткою вносять у першу пробірку 1,8 мл сольового розчину і 0,2 мл вірусвмісного матеріалу - отримали розведення 10-1; другою стерильною піпеткою перемішують рідину і переносять 0,2 мл до другої пробірки - отримали розведення 10-2 і так далі).

Титрування здійснюють у чутливих культурах клітин, які сформували за добу добрий моношар на стінці пробірок або флаконів від пеніцілину. З пробірок чи флаконів з культурою клітин видаляють середовище росту і вносять по 0,1 мл вірусвмісного матеріалу на пробірку (0,2 мл на флакон). На кожне розведення вірусу використорують 4 пробірки (флакони) з культурою клітин. Починають інфікування культур з кінцевого розведення вірусу, у цьому разі зникає потреба щоразу міняти піпетки. Потім до кожного моношару клітин додають середовище підтримки. Інфіковані та контрольні культури вміщують у термостат і витримують при температурі 36 град.С. Результати визначають на 3 - 5 добу. Інтенсивність ЦПД оцінюють за системою плюсів (4+). Далі проводиться статистична обробка за методом Ріда-Менча або за формулою Кербера. Визначається ТЦД50 в об'ємі матеріалу, взятого для зараження одного моношару з культурою клітин. Роблять перерахунок по визначеню ТЦД50 на 1 мл вірусвмісного матеріалу.

Формула Кербера для визначення титру вірусу:

L - lg найменшого розведення, яке використане у титруванні;

d - інтервал у lg між двома послідовними розведеннями;

S - сума пропорцій позитивних тест-одиниць (тобто пробірок з культурою, де з'явилася ЦПД) у кожному розведенні.

У деяких випадках замість 4-х пробірок на одне розведення вірусу припустимо використання лише 2-х пробірок, при цьому точність підрахунків дещо знижується, хоча й залишається достатньою для подальших досліджень.

Титрування вірусів у культурі клітин за методом бляшкоутворення під бентонітовим покриттям

Цей метод грунтується на здатності цитопатогенних вірусів до локального руйнування клітинного моношару, покритого поживним середовищем, що містить бентоніт. Вірусна 6ляшка є наслідком деструкції клітин потомством однієї вірусної частки. Бляшки вірусів мають вигляд округлих прозорих плям на неушкодженому фоні моношару, покритому бентоніном. Феномен бляшкоутворення отримують таким чином: вірусвмісним матеріалом інфікують чутливі перещеплювані культури клітин, що вирощені в невеликих матрацах, на дні колбочок Ерленмейера або флаконів з-під пенициліну об'ємом 10-20 мл. Після адсорбції вірусів (через 30-40 хв.) інфіковані моношари заливають поживним середовищем, що містить гель бентоніту. Під шаром бентоніту в поживному середовищі клітини зберігають життєздатність протягом 4-6 діб. Через 1,5-2 доби після інфікування з'являються вірусні бляшки. Інфекційність вірусів виражають в бляшкоутворючих одиницях (БУО/мл). Для одержання ефекту бляшкоутворення доцільно використовувати ті самі клітинні культури, що й для виділення вірусів - негусті моношари 1-2 добового формуання.

Склад поживного середовища з гелем бентоніту для виявлення вірусних бляшок:

До стерильної бідистильовакої води у флаконі об'ємом 500 мл додають 5 мл гелю бентоніту. Суміш інтенсивно струшують, щоб одержати дрібнодисперсну суспензію часток сорбенту. Потім послідовно додають вищезгадані компоненти. Замість 10-кратного розчину Ерла можна використовувати однократний. У такому випадку згадані компоненти, за винятком бідистильованої води, додають безпосередньо до цього розчину. Важливо старанно диспергувати бентоніт в розчині Ерла шляхом інтенсивного струшування. Оптимальні значення рН бентонітового покриття 8,0 - 8,2.

Методика титрування вірусів за бляшкоутворенням

Вірусовмісний матеріал розводять десятиразово у стерильному сольовому розчині. Відбирають флакони із сформованим моношаром клітинних культур, видаляють з них поживне середовище і вносять на моношари флаконів від пеніциліну або колбочок Ерленмейєра відповідно по 0,2 та 0,5 мл матеріалу кожного розведення, починаючи з найвищого. Рівномірно розподіляють вірусовмісний матеріал по поверхні моношару. Адсорбція вірусів на клітинах відбувається при температурі 36 град.С протягом 30 - 40 хвилин. Після цього моношари відмивають стерильним сольовим розчином і вносять поживне середовище з бентонітом в об'ємі 3-5 мл для моношарів клітин, що вирощені на дні флаконів від пеніциліну, і 10-15 мл для невеликих матрасів або колбочок Ерленмейєра на 50 мл. Інфіковані флакони витримують при температурі 36 град.С. Облік здійснюють через 48 годин. Титр вірусу обчислюють в БУО/мл вірусвмісного матеріалу. В таблиці 1 наведений приклад розрахунку титру вірусу в БУО/0,2 мл (використовували флакони від пеніциліну з моношарами клітин, на кожний моношар вносили по 0,2 мл розведеного вірусу).

Визначають середню арифметичну величину від усереднених титрів для всіх розведень з урахуванням об'єму досліджуваної рідини, яку вносили на моношар.

де 5 - коефіцієнт перерахунку об'єму на 1 мл,

10 5 - розведення вірусу,

3 - кількість спостережень,

(3,2+5,0+5,0) - усереднена кількість бляшок при екстраполяції на однакове розведення (10 -5).

Ідентифікація ентеровірусів у реакції віруснейтралізації по пригніченню цитопатогенної дії.

Реакція нейтралізацій (РН) грунтується на властивостях імунної сироватки блокувати здатність вірусу репродукуватися в культурі клітин і не викликати ЦПД чи утворення бляшок. Це є наслідком взаємодії нейтралізуючих антитіл з поверхневими антигенами віріону, що відповідають за його адсорбцію на клітині. За певних умов віруснейтралізуючі антитіла здатні також руйнувати віріони. РН може бути застосована як для ідентифікації виділених ентеровірусів, так і для виявлення рівня антитіл у сироватці людини.

Ідентифікація виділених з клінічного матеріалу ентеровірусів здійснюється в реакції нейтралізації з використанням відомих діагностичних ентеровірусних імунних сироваток. Тип вірусу визначають по типу сироватки, що його нейтралізувала. Для реакції нейтралізації використовують стандартні комерційні набори діагностичних полі- та моновалентних сироваток. При проведенні реакції беруть однакові об'єми дози вірусу (100 ТЦД50) і діагностичної сироватки, у робочому розведенні якої не менше 20 нейтралізуючих одиниць. Підготовку сироваток та ідентифікацію вірусів слід проводити згідно з інструкцією, що додається до набору.

Через те, що рід ентеровірусів представлено значною кількістю серологічних типів, доцільно під час типування використовувати суміш діагностичних сироваток проти різних типів вірусів поліомієліту, Коксакі та ЕСНО (схема Лім, Беньяш-Мельник). У таблиці 2 наведено склад сумішей для типування 42 типів ентеровірусів.

Таблиця 2. Склад сумішей імунних сироваток для типування ентеровірусів.

Якщо штам вірусу цими сумішами не нейтралізується, проводять РН з імунними сироватками до інших ентеровірусів. Робочі розведення виділеного штаму ентеровірусів готують, виходячи з його титру, таким чином, щоб у 0,1 мл кінцевого розведення містилося 100 ТЦД50 (або 100 БУО) вірусу. Кількісне співвідношення інгредієнтів для розведення вірусвмісного матеріалу наведено в табл. 3.

Таблиця 3. Співвідношення інгредієнтів для розведення вірусомісного матеріалу.

Наприклад. Вихідний титр вірусу 10 6,3 ТЦД50/мл, або 10 5,3 ТЦД50/0,1 мл. Доза, необхідна для РН (1000 ТЦД50/0,1 мл), міститься у розведенні 10 -3,3. Готують три послідовних 10- кратних розведення, останнє з яких розводять ще двічі, оскільки антилогарифм 0,3=2.

Розведення діагностичних імунних сироваток та приготування їх сумішей здійснюють згідно з інструкцією, до кінцевої концентрації 20 нейтралізуючих одиниць (тобто у 20 разів більше, ніж треба для нейтралізації 100 ТЦД50 вірусу) кожної сироватки. У цьому разі враховують вихідний титр сироватки або її робоче розведення, зазначені на етикетці ампули.

Для постановки РН готують нейтралізаційні суміші, до складу яких входять рівні об'єми вірусвмісного матеріалу в робочому розведенні (100 ТЦД50 вірусу в 0,1 мл) і сироватки кожного типу (чи сумішей діагностичних сироваток). Нейтралізаційні суміші витримують протягом години при температурі 36 град.С, вносять по 0,2 мл кожної суміші (0,1 мл вірусу+0,1 мл сироватки) в 4 пробірки (флакони) з 24-48 годинною моношаровою культурою клітин. Через 40 - 60 хвилин інкубації при 36 град.С додають середовище підтримки в певному об'ємі (в залежності від площі моношарів). Паралельно ставлять контролі:

- дози вірусу для визначення фактичноі кількості ТЦД50, що бере участь у реакції: моношари клітин інфікують робочим розведенням, а також розведеннями, які містять 10 ТЦД50 та 1000 ТЦД50;

- робочого розведення сумішей діагностичних сироваток з метою виявлення можливої неспецифічної цитопатичної дії;

- культури клітин.

Пробірки (флакони) розміщують в термостаті при 36 град.С і ведуть спостереження, починаючи з другого дня, протягом 3-5 діб. Облік результатів РН проводять, починаючи з оцінки стану контролів, які повинні бути такими: моношари неінфікованих культур залишаються незміненими до кінця експерименту (контроль клітин); типоспецифічні імунні сироватки (суміші) не спричиняють цитотоксичної дії, (контроль сироваток), робоча доза вірусу визначена вірно.

Тип виділеного вірусу визначається за спільним компонентом імунних сироваток, що входять до складу сумішей, які нейтралізують його інфекційну активність (табл. 4).

Таблиця 4. Визначення типу ентеровірусів за результатами реакції нейтралізації.

Наприклад. Виділений цитопатичний вірусний штам нейтралізується сумішами В і Е. До складу сумішей входять імунні сироватки до таких типів ентеровірусів:

Нейтралізація досліджуваного вірусу одночасно двома сумішами В і Е дає змогу зробити висновок, що досліджуваний вірус є вірусом поліомієліту 2 типу (табл. 4).

Інколи для ідентифікації вірусу, виділеного з матеріалу від хворого з підозрою на ентеровірусну інфекцію, реакцію нейтралізації можна проводити в два етапи: замість 8 сумішей імунних сироваток (табл. 2) можна використовувати полівалентні поліо-, Коксакі А,В та ЕСНО антивірусні сироватки. У разі нейтралізації вірусу однією з цих сумішей проводять нейтралізацію з використанням монорецепторних поліо-, Коксакі-, або ЕСНО- антивірусних сироваток.

Ідентифікація ентеровірусів у реакції віруснейтралізації за редукцією бляшкоутворення під бентонітовим покриттям

Постановка РН проводиться з використанням тих самих ентеровірусних діагностичних сироваток, що і для РН За пригніченям ЦПД. Суть методу полягає в поєднанні виділеного вірусу з відповідною кількістю типоспецифічної діагностичної сироватки (чи суміші) і спостереженні за редукцією бляшок під бентонітовим поживним покриттям. Про відповідність штаму вірусу одній із сироваток свідчить пригнічення репродукції вірусу і, відповідно, відсутність бляшок на моношарі клітин.

Для постановки РН за редукцією бляшкоутворення під бентонітовим покриттям використовують виділені штами вірусів у робочій дозі 50-100 БУО в 0,1 мл. Суміші діагностичних сироваток (склад сумішей див. табл. 1), готують так, щоб у кінцевому розведенні в 0,1 мл містилося не менше, як 20 віруснейтралізуючих одиниць кожної сироватки.

У пробірці поєднують однакові об'єми однієї із сумішей діагностичних імунних сироваток і робочого розведення вірусу, інтенсивно струшують і витримують в термостаті при 36 град.С протягом 1 год. Такою сумішшю інфікують моношари (по 2-4 моношари на кожну суміш). Бажано використовувати ту культуру клітин, на якій було виділено даний штам вірусу. Через 40-60 хвилин контакту суміші з моношарами (період адсорбції вірусу) флакони заливають бентонітовим поживним покриттям (3-4 мл на флакон від пеніциліну). Паралельно контролють сироватки на цитотоксичність і робочу дозу вірусу. Результати РН оцінюють через 36-48 год. інкубації в термостаті при 36 град.С. При позитивних результатах РН відмічається відсутність бляшок або зниження їх кількості на 80% у порівнянні з контролем вірусу (50-100 БУО/0,1 мл). Тип вірусу визначається по табл. 4.

Ідентифікація штамів поліо- та інших ентеровірусів за альтернативним методом (мікрометод, рекомендований ВООЗ)

Постановка реакції здійснюється в спеціальних 96-луночкових мікроплатах для культур клітин з плоским денцем. Для постановки реакції віруснейтралізації можна користуватися тими самими діагностичними сироватками, що і для постановки реакції макрометодом в пробірках, флаконах. Використовують середовище, яке містить 2% ембріональної сироватки, культури клітин НЕр-2, RD. Готують розведення діагностичних сироваток згідно з доданим настановленням і вносять по 50 мкл кожної сироватки (суміші) в 4 лунки. Паралельно здійснюють контрольне титрування вірусу (визначення титру вірусу). Для цього готують серії десятиразових розведень вірусу від 10 -1 до 10 -7 в об'ємі 1 мл (0,9 мл середовища+0,1 мл вірусу) за винятком розведень 10 -3 і 10 -4, де об'єм повинен становити 2,0 мл (1,8 мл середовища + 0,2 мл попереднього розведення вірусу). Для контрольного титрування використовують розведення від 10 -7 до 10 -3, для досліду беруть по 50 мкл кожного 40 розведення у 4 повторах. Титр вірусу визначають за Ридом-Менчем або а Кербером (див. вище).