Обов'язковому вірусологічному дослідженню підлягає секційний матеріал від померлих хворих з діагнозом пневмонії або ГРІ. При патолого-анатомічному розтині трупу для дослідження відбирають шматочки легенів, трахеї і зіскоб з неї. З метою деконтамінації відібрані шматочки без ознак геморагії та некрозу одразу занурюють у стерильний посуд з сумішшю рівних частин гліцерину та забуференого фізіологічного розчину і залишають при 4 град.C протягом доби. Перед дослідженням шматочки тканин двічі відмивають у чашках Петрі стерильним фізіологічним розчином, подрібнюють ножицями і у стерильній ступці розтирають з піском, додаючи фізіологічний розчин до отримання 20-30% суспензії, яку центрифугують при 10 тис. об/хв. 20 хвилин. Надосадкову рідину використовують для:
2. Зараження курячих ембріонів або культур клітин. З метою підвищення ефективності ізоляції вірусу грипу, змиви та центрифугат попередньо концентрують, додаючи рівний об'єм стерильної 2% суспензії еритроцитів морської свинки, суміш струшують та витримують при перемішуванні у льодовій бані 20 хвилин. Еритроцити осаджують центрифугуванням (1000 об/хв.), до осаду додають 0,4-0,6 мл забуференого фізрозчину і використовують для зараження курячих ембріонів (рН = 7,2).
3. При виділенні аденовірусів до змиву додають чутливу стабільну лабораторну лінію культури відмитих розчином Хенксу клітин з розрахунку 100 тис. на 1 мл.
Одержану суміш витримують 1,5 години при 20 град.C, час від часу перемішуючи. Після осадження клітин центрифугуванням надосад зливають, клітини ресуспендують у половинному об'ємі середовищем, що містить 5% БСА або ембріональної телячої сироватки і вносять по 0,5 мл у пробірки для вирощування.
Для концентрації інших вірусів збудників ГРІ використовують поліетиленгліколь ММ 6000, 30% розчин якого, стерилізований кип'ятінням, може зберігатися при 4 град.C один місяць, і стерильний поліглюкін-кровозамінник вітчизняного виробництва. До 5 мл досліджуваного змиву додають 4 мл 30% поліетиленглюколю та 2 мл поліглюкіну. Суміш струшують декілька разів на протязі однієї години та центрифугують 20 хвилин при 2 тис. об/хв. при 4 град.C. Надосадкову рідину зливають, осад ресуспендують в 0,4-0,6 безсироватковим середовищем або забуференим фізіологічним розчином з 0,5% желатину або БСА. Концентрат використовують для зараження курячих ембріонів або культур клітин. Підготовлені зразки до зараження повинні зберігатись при 4 град.C. Якщо немає можливості заразити біосистему в найближчі 48 годин після відбору, їх необхідно зберегти до дослідження в ампулах в суміші сухого льоду зі спиртом або в холодильнику при -70 град.C у рідкому азоті.
Порядок виділення вірусу грипу
Вірус грипу роду А і В виділяють та культивують на курячих ембріонах і первинних культурах клітин нирок ембріонів людини, курки та ін.тварин. Використання курячих ембріонів і культур клітин необхідне для найбільш успішної ізоляції вірусу А і В, оскільки ефективність репродукції в цих системах коливається із року в рік і залежить від особливостей циркулюючих штамів. Курячі ембріони 10-11-денного віку заражають за звичною методикою, вводячі матеріал по 0,1 мл в амніотичну та алантоїсну порожнини. Одним зразком заражають 3 ембріони.
Залишок матеріалу використовують для засіву на стерильність (середовище 199 без антибіотиків, бульйон та ін.).
Заражені ембріони інкубують в термостаті при 33-34 град.C 72 години, після чого охолоджують на протязі 16 годин при 4 град.C або 30 хвилин при - 20 град.С. Після охолодження пастерівською піпеткою відбирають в стерильні пробірки рідину з амніотичної та алантоїсної порожнини і перевіряють її на вміст вірусу грипу в реакції гемаглютинації (РГА).
РГА ставлять з використанням 1% суспензії еритроцитів морської свинки (або людини 0 групи, які можуть бути більш чутливі для виявлення вірусу при ранніх пасажах). Курячі еритроцити рекомендують застосовувати, коли вірус вже адаптований до курячих ембріонів. Для збільшення титрів до рівня, який може визначитися в реакції гемаглютинації, інколи необхідно додатково зробити 2-3 "сліпих" пасажі.
Зібрану рідину, яка містить вірус, освітлюють центрифугуванням 10 хвилин при 10 тис.обертів і зберігають надосад при 4 град.C до наступного зараження курячих ембріонів. Якщо алантоїсна рідина містить вірус, перед інокуляцією її розводять розчином Хенксу або забуференим фізрозчином до концентрації вірусу 10 - 100 ГАО/мл.
Для виділення вірусу грипу С матеріал необхідно вводити тільки в амніотичну порожнину (вірус не репродукується в алантоїсній) 7-денних ембріонів (під контролем овоскопу, ембріон знаходиться в горизонтальному положенні) і інкубують при 33 град.C п'ять діб.
При використанні пермісивних для вірусу грипу культур клітин спостерігають цитопатичні зміни у вигляді легкої вакуолізації або прозорості клітин, які швидко дегенерують. Цитопатична дія (ЦПД) може проявитись лише після кількох "сліпих" пасажів. Присутність вірусу в клітинах визначається в реакції гемадсорбції, яка значно випереджає появу ЦПД. Реакція ставиться із свіжими еритроцитами морської (гвінейської) свинки. Гемадсорбцію починають ставити та враховувати з контрольних незаражених пробірок, з яких зливають підтримуюче середовище. В кожну пробірку додають по 0,1 мл розчину Хенксу і 0,2 мл 0,4% суспензії із еритроцитів морської свинки. Пробірки з культурою залишають клітинами вниз на 10 хвилин при 18-20 град.C. При позитивній гемадсорбції в полі зору мікроскопа клітини, щільно вкриті прикріпленими еритроцитами, що не змиваються при струшуванні. Позитивна гемадсорбція в контрольних пробірках свідчить про те, що культури містять сторонній гемадсорбуючий агент, тому необхідно повторити дослід на іншій партії культур клітин.
Якщо в контролях гемадсорбція негативна, враховують реакцію в інших дослідних пробірках. При негативній гемадсорбції пробірки струшують і вдруге враховують ще раз через 10 хв. Якщо при повторному обліку реакція негативна, ці проби використовують для наступного пасажу. При позитивній гемадсорбції з культуральним середовищем ставлять реакцію гемаглютинації з 0,4% суспензією еритроцитів морської свинки (або "0" групи крові людини) і 0,5% суспензією еритроцитів курей.
Якщо титр гемаглютинінів в якій-небудь культуральній рідині 1:8 або більше - цей зразок залишають для первинної ідентифікації реакції інгібіції гемаглютинації (РІГА) з комерційними діагностичними сироватками (як вказано в поясненні до них).Реакцію ставлять при кімнатній температурі. В разі негативної РІГА - пробу повторюють, інкубуючи суміші розведених діагностичних сироваток з дозами вірусу при 4 град.C протягом ночі, проводячи реакцію на лотках з льодом.
Якщо в пробах з позитивною гемадсорбцією титр гемаглютинінів 1:4 або менше (з еритроцитами морської свинки і курки) матеріал використовують для подальших пасажів.
Перед відправленням в Український центр грипу для їх подальшого вивчення виділені ізоляти ще раз пасують в курячих ембріонах для підвищення титру та одержання більшого об'єму.
Виділення та ідентифікація інших респіраторних вірусів
Ізоляція аденовірусів. Аденовіруси можуть бути ізольовані від хворих до 7 дня від початку захворювання з слизу носа, горла, кон'юнктиви та секційного матеріалу.
Змиви після доставки в лабораторію для зберігання до засівання швидко заморожують в суміші сухого льоду із спиртом при -70 град.C. Зберігають проби після заморожування при - 15 - 20 град.C до 7 днів.
Матеріалом заражують по 4 пробірочних культури клітин нирок ембріона людини, HELA або HEP-2.
Інкубація продовжується 5-6 годин, після чого в пробірки додають підтримуюче середовище (середовище 199 з 5% сироватки новонароджених телят або 5% лактальбуміну).
Для аденовірусів характерна епітеліотропність, специфічний тип дегенерації клітин культури і швидке підкислення середовища. При необхідності пасування культуральну рідину зливають, клітинний шар механічно руйнують, і клітини разом із залишками середовища об'єднуют в одну пробірку. Потім пробірки 3 рази швидко заморожують і відтаюють, центрифугують і надосад використовують для наступного пасажу. При наявності характерної дегенерації клітин вміст пробірок об'єднують, двічі заморожують, - розморожують та інфікують культуру клітин як нерозведеним вірусом, так і розведеним від 10 з відхиленням в I логарифм (по 4 пробірки). Результати титрування обробляють статистично за Рідом і Менчем, а титр виражають в ТЦД 50/0,2 мл.
Ідентифікацію цитопатогенного агента з аденовірусами проводять також за допомогою реакції зв'язування комплементу (РЗК) згідно з інструкцією.
Для доказу того, що виділений цитопатогенний агент викликав захворювання у хворого, ставлять реакцію нейтралізації цитопатогенної активності вірусу парними сироватками хворого, які відбирають на початку захворювання та після 2-4 тижнів. Сироватки попередньо звільняють від неспецифічних інгібіторів. Антиген в дозі 100 ТЦД 50/0,2 мл змішують з рівними об'ємами розведень першої і другої сироваток, інкубують 1 годину при 37 град.C, і суміш антигену з антитілами по 0,2 мл інокулюють в культури клітин.
Контролі: дози вірусу та сироваток, незаражені культури тканини. Якщо виділений агент викликав захворювання, титр нейтралізації другої сироватки повинен бути в 4 і більше разів вищим, ніж перший.
Виділення РС-вірусу (респіраторно-синцитіального).
Вірус відрізняється надзвичайною лабільністю і низьким титром в секретах хворого, що практично робить неможливим його ізоляцію із проб, які довго зберігалися. В зв'язку з цим слід доставляти чутливу культуру клітин (лінії HEP-2, HELA-сублінії Брістоль, клітини нирок ембріона людини) до ліжка хворого, де й проводять зараження. Якщо це неможливо, змиви із носа та глотки хворих дітей переносять у пробірки (склад середовища зазначений вище). Все це енергійно струшують і ставлять у льодову баню. Не допускається заморожування! В перші години після відбору матеріалу здійснюється інокуляція чутливих культур клітин. До складу культурального середовища для виділення РС-вірусів сироватки дорослих тварин не включають, бо вони можуть містити антитіла або інгібітори до РС-вірусу. Замість них використовують ембріональну телячу сироватку або БСА.
Заражену культуру інкубують при 37 град.C не менше 3-х тижнів, регулярно змінюючи середовище. ЦПД інфікованої тканини у вигляді синцитію спостерігається не завжди, що визначається багатьма факторами, в тому числі штамом вірусу, умовами культивування та типом клітин. Обробка клітин або проби ДЕАЕ-декстраном підвищує чутливість клітин до РС-вірусу. Кількість клітин, заражених РС-вірусом людини, може збільшуватись в 100 разів при додаванні 15 мгк/мл ДЕАЕ-декстрану. В присутності високих концентрацій (близько 40%) сахарози інфекційність РС-вірусу стабілізується.
В культуральній рідині інфікованих клітин гемаглютинін РС-вірусу не виявляється. Адсорбція еритроцитів на клітинах, заражених РС-вірусом людини, не описана.
Індикація персистентного РС-вірусу в інфікованих клітинах здійснюється за допомогою імунофлюоресцентного забарвлення з поліклональною антисироваткою або твердофазного імуноферментного аналізу. При наявності дегенерації 75% клітинного шару в культурах клітин, в культуральній рідині визначають антиген РС-вірусу в РЗК з антитілами до еталонного штаму РС-вірусу. Реакцію нейтралізації для типування виділених РС-вірусів ставлять за загальноприйнятою методикою з використанням імунних сироваток морських свинок.
Виділення парагрипозних вірусів (ПГВ).
Для виділення ПГВ використовують культуру ниркової тканини із 12-тижневих ембріонів людини (НЕЛ). Ідентифікація виділених штамів провадиться в реакції нейтралізації імунними сироватками в культурах клітин, в реакції затримання гемадсорбції та РІГА з еритроцитами морської свинки, курки та людини.
Реакцію гемадсорбції ставлять з 0,4% суспензією стерильних еритроцитів морської свинки (0,2 мл), які вносять в заражені і контрольні пробірки без попереднього вилучення підтримуючого середовища. Штатив з пробами витримують клітинним моношаром вниз при 4 град.C 30-40 хвилин. Гемадсорбція спостерігається не раніше 4-5 днів після зараження культури клітин.
При негативних результатах, особливо в першому пасажі, пробірки з культурою клітин витримують в термостаті до 20 днів, гемадсорбцію ставлять через кожні 5 днів. Після другої реакції проводять часткову заміну середовища.
Ідентифікацію вірусів парагрипу здійснюють шляхом постановки реакції інгібіції гемадсорбції (РІГ) чи в реакції нейтралізації (РН).
РІГ ставиться на 15 пробірках HELA, в які вносять по 0,2 мл матеріалу, що дав в попередньому пасажі позитивну гемадсорбцію. Підтримуюче середовище - середовище 199 без сироватки, інкубація - при 37 град.C. На 5 день зливають середовище, відмивають клітини розчином Хенкса і вносять в кожні 3 пробірки по 0,2 мл гіперімунної кролячої сироватки до 1,2; 3 і 4 типів вірусу ПГ в розведенні 1:10, а потім додають по 0,6 мл розчину Хенкса. Контакт 20 хвилин при 20 град.C, після чого в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4% суспензії еритроцитів морської свинки і ставлять культуру на 30 хвилин при 4 град.C. Гемадсорбція відсутня в контролях культури і в тих пробірках, де тип вірусу збігся з типом однієї із гіперімунних сироваток.
Реакцію нейтралізації ПГ вірусів ставлять із 100 гемадсорбуючими одиницями в об'ємі 0,2 мл. Цю дозу з'єднують з 0,2 мл специфічної імунної сироватки кожного типу в розведенні 1:10 - 1:20 (з титром антитіл 1:80 - 1:160). Після 2-годинного контакту при 20 град.C в пробірки з культурою клітин вносять по 0,2 мл суміші антигену з антитілом, добавляють середовище 199 і інкубують при 37 град.C. Для кожного типу сироватки беруть по три пробірки. Ставлять контроль вірусу.
Через 4-5 днів в усі пробірки вносять по 0,2 мл суспензії еритроцитів і реєструють наявність або відсутність гемадсорбції. При позитивній реакції гемадсорбції в контролях вірусу, її відсутності в контролях культури та в пробірках, в які були внесені суміші вірусу і сироватки певного типу, все це свідчить про ідентичність виділеного вірусу даному типу сироватки.
Методи експрес-діагностики: люмінесцентної мікроскопії, імуноферментного аналізу та реакція пасивної гемаглютинації
Методи експрес-діагностики у своїй основі мають виявлення вірусних антигенів в мазках із зіву та носа хворих за допомогою специфічних противірусних глобулінів, мічених флуорохромами або ферментами. Ці методи використовуються в лабораторіях інфекційних стаціонарів для з'ясування природи гострих респіраторних інфекцій з метою:
- своєчасного призначення специфічних засобів етіотропної терапії;
- прогнозування подальшого перебігу хвороби і одужання;
- раціонального розміщення хворих за етіологічною ознакою.
Методи ранньої лабораторної діагностики використовують також для термінового розшифрування причин епідемічних спалахів з метою своєчасного проведення відповідних профілактичних і лікувальних заходів.
Поряд з імунофлуоресцентним методом діагностики грипу і ГРІ впроваджується метод імуноферментного аналізу.
Для експрес-діагностики аденовірусної інфекції використовують реакцію пасивної гемаглютинації з еритроцитарним діагностикумом.
Метод імунофлуоресцентної діагностики грипу та інших ГРІ
Імунофлуоресцентний метод (ІФМ) використовують для швидкої діагностики грипу, парагрипу, адено-, РС-вірусної інфекції та мікоплазми пневмонії, а також змішаних інфекцій.
В основі методу лежить здатність антигенів вступати в реакцію із специфічними противірусними антитілами, міченими флуорохромом.
Діагностика здійснюється у двох напрямках:
1. Виявлення вірусного антигену в клітинах циліндричного епітелію слизової оболонки носоглотки або у відбитках із секційного матеріалу;
2. Виявлення вірусного антигену в культурах клітин, інфікованих матеріалом від хворих.
Використовують прямий і непрямий методи імунофлуоресценції. При прямій модифікації методу використовують комерційні флуоресцентні глобуліни проти вірусів грипу, парагрипу, аденовірусів, РС-вірусів та інших. Для непрямого методу використовують противірусні імунні сироватки різних видів тварин і відповідні антивидові флуоресціюючі глобуліни.
З допомогою ІФМ етіологічний діагноз можна встановити через 2-3 години при дослідженні препаратів від хворих і через 24-48 годин - при зараженні культури клітин. Ефективність досліджень найвища в гострій фазі захворювання (перші 3 дні) і суттєво залежить від якості відбору матеріалу, приготування препаратів.
Взяття матеріалу для дослідження ІФМ.
Матеріалом для дослідження служать епітеліальні клітини зіву і носа. Перед введенням тампона ніс звільняють від слизу. Сухий стерильний тампон вводять у порожнину носа хворого по зовнішній стінці, злегка опускають донизу, вводять в нижній носовий хід на глибину 2-3 см, вільною рукою злегка натискають на зовнішню стінку носа і обертовим рухом старанно знімають десквамований епітелій. Тампон опускають в пробірку з 2 мл ФБР. Іншими тампонами збирають матеріал з другої половини носа, а також із задньої стінки ротоглотки. Матеріал, взятий від хворого, необхідно швидко (не пізніше 4-х годин) передати в лабораторію, а до цього зберігати в холодильнику при температурі 4 град.C.
В лабораторії пробірки з тампонами в ФБР добре струшують, тампони ретельно вижимають до стінок пробірки і викидають. Одержану суспензію клітин центрифугують протягом 5-7 хвилин при 2000 об/хв. Для одержання осаду клітин циліндричного епітелію ФБР зливають одним легким рухом, осад клітин ресуспендують пастерівською піпеткою в декількох краплинах розчину, що залишився на дні пробірки і використовують для приготування мазків. На добре знежирені і сухі предметні скельця, які до використання зберігаються в етиловому спирті (96 град.) або в суміші Никифорова, наносять пастерівською піпеткою по одній краплині на кожну флюоресціюючу сироватку. Мазки висушують при кімнатній температурі. Після цього мазки фіксують в хімічно чистому (чистому для аналізу) безводному ацетоні, заздалегідь охолодженому до 2-4 град.C. Фіксовані мазки до фарбування флуоресціюючими глобулінами можуть зберігатися в холодильнику при 4 град.C протягом тижня.
Для дослідження секційного матеріалу використовують шматочки трахеї, бронхів і легенів розміром 0,5 см, які перед приготуванням препарату промивають в стерильному фізіологічному розчині від крові. З слизової оболонки трахеї і бронхів препарат готують шляхом зіскоблювання скальпелем епітеліального покриву. Шматочки легенів після промивання підсушують фільтрувальним папером, роблять свіжий зріз і для отримання відбитку прикладають на ретельно знежирене предметне скло. Препарати підсушують і фіксують в охолодженому ацетоні 5 хв.
Культури клітин, чутливих до того чи іншого збудника вірусної інфекції, в пробірках з покривними скельцями заражають матеріалом від хворих (надосадною рідиною, що залишилася після приготування мазків для МІФ).
Заражені пробірки ставлять в термостат. Через 24-48 год. скельця виймають з пробірок загнутою пастерівською піпеткою і кладуть на предметне скло, прикріплюють лейкопластирем, висушують і фіксують, як вказано вище. Краще користуватися для вирощування культури клітин і приготування препаратів пеніциліновими флаконами.
Фарбування препаратів прямим способом.
Флуоресціюючі сироватки перед використанням повинні бути перевірені в препаратах культур клітин, інфікованих відповідними вірусами. Протигрипозні препарати доцільно перевіряти в первинно-трипсинованій культурі курячої ембріональної нирки. Аденовірусні, парагрипозні і РС-вірусні сироватки - на будь-якій стабільній лабораторній лінії клітин, яка підтримує репродукцію вказаних вірусів (Hela, Hep т.і.).
Фарбуючим титром кон'югату вважається те його кінцеве розведення, яке дає чітку флуоресценцію в дослідному препараті при відсутності її в контрольному.
Препарати від кожного хворого фарбують флуоресціюючим глобуліном A(HINI), A(H3N2), В, ПГ-1, 2, 3, РС-, аденовіруси, міколазма пневмонії, як вказано в інструкції до сироваток.
Фарбування препаратів за допомогою непрямого способу.
Використовують комерційні імунні противірусні сироватки з біологічними титрами не нижче 1:160 при робочому розведенні не нижче 1:2. Імунні сироватки можуть бути використані як в суміші, так і типові.
Для фарбування на препарати наносять 0,02 мл імунної сироватки в робочому розведенні, поміщають у вологу камеру при 37 град.C на 30 хв. Після фарбування препарати відмивають в проточній воді 40 хв., наносять флуоресціюючі специфічні антивидові глобуліни. Контакт здійснюється у вологій камері при 37 град.C протягом 15 хв. Відмивають фарбовані препарати так, як при прямому способі.
Оцінка результатів імунофлуоресценції.
При перегляді мазків звертають увагу на число і тип клітин, рівень їх світіння, наявність флуоресціюючих включень. В препаратах з носової порожнини людини найбільш часто зустрічаються клітини циліндричного та плиского епітелію, лейкоцити. Діагностичне значення має виявлення специфічного (яскраво-зеленого) світіння в 3-4 клітинах циліндричного епітелію, які мають келихоподібну або округлу форму з відповідно великим ядром і малою цитоплазматичною зоною. Локалізація світіння в клітинах частіше всього цитоплазматична, хоч при грипі і аденовірусній інфекції може бути ядерна. При наявності у хворого змішаної інфекції можна виявити одноразово два різних вірусних антигени з типовою локалізацією їх для тої чи іншої вірусної інфекції.
Лейкоцити і великі полігональні клітини з малим ядром (плиского епітелію) при аналізі препаратів до уваги не беруть.
При перегляді інфікованої і пофарбованої ФА культури клітин позитивний результат вважається при наявності достатнього яскраво-зеленого пофарбування структурних елементів клітин, які світяться в ядрі чи цитоплазмі <= і негативним (не дорівнює) при наявності слабкого дифузного світіння контурів клітин без чіткої диференціації клітинних структур порівняно з нефарбованою культурою клітин.
Контрольні дослідження.
При одночасному використанні різних флуоресціюючих глобулінів або імунних сироваток для дослідження мазків від хворих кожний з них є контролем для іншого. При роботі з культурою клітин необхідно мати як контроль незаражену культуру клітин (контрольні препарати) пофарбовані тими ж флуоресціюючими глобулінами.
Для перевірки специфічності флуоресценції проводять такі контрольні дослідження:
1. Обробка специфічним кон'югатом неінфікованих тканинних клітин;
2. Обробка неімунним і гетерологічним кон'югатом клітин, інфікованих вірусом;
3. Для зменшення специфічного світіння перед фарбуванням обробляють препарати неміченою імунною сироваткою.
Найбільш сучасним експрес-методом діагностики сьогодні вважається імуноферментний. Розроблені тест-системи для виявлення вірусів грипу А і В, РС-вірусу, мікоплазми пневмонії. В стадії розробки - тест-системи щодо аденовірусів, парагрипу, риновірусів. Постановка ведеться в полістиролових планшетах за загальноприйнятою методикою, облік реакцій проводиться за допомогою спектрофотометра (мультискана). Досліджується як матеріал безпосередньо від хворого, так і культуральна рідина інфікованих культур.
Методи серологічної діагностики грипу та інших ГРІ
Серологічна діагностика грунтується на виявленні приросту антитіл в парних сироватках хворих. Застосовують реакцію інгібіції гемаглютинації (РІГА), реакцію зв'язування комплементу (РЗК), реакцію пасивної гемаглютинації (РПГА), реакцію радіального гемолізу (РРГ). Враховуючи достатню інформативність цих методів, вони широко використовуються в епідеміологічному аналізі: визначення рівня колективного гуморального імунітету, ретроспективного аналізу природи епідемічних спалахів, оцінки імуногенної активності грипозних вакцин.
Для проведення серологічних реакцій як антигени використовують стандартні діагностикуми.
Реакція інгібіції гемаглютинації.
Використовується для діагностики грипу та парагрипозної інфекції. Метод грунтується на інгібіції гемаглютинаційної активності вірусу в присутності специфічних антитіл.
Для проведення РІГА з грипозними антигенами використовують 1% суспензію еритроцитів курей чи людини 0 (1) групи та діагностикуми із штамів, які резистентні до неспецифічних сироваткових інгібіторів. Реакція включає такі етапи роботи: підготовка сироваток, приготування робочої дози вірусу, суспензії еритроцитів, постановка реакції. Сироватки людини містять неспецифічні інгібітори, які спроможні затримувати гемаглютинацію і спотворювати результати РІГА. Перед постановкою реакції з грипозними діагностикумами парні сироватки від хворих розводять в 10 разів фізіологічним розчином (ФР) і прогрівають на водяній бані при 56 град.C протягом 30 хв.
При постановці РІГА з парагрипозними антигенами для вилучення неспецифічних інгібіторів сироватки обробляють еритроцитами морської свинки та коаліном. В цьому випадку сироватку змішують з 10% суспензією еритроцитів морської свинки у співвідношенні 1:5. Після 30-хвилинної інкубації при 4 град.C суміш центрифугують і до надосадової рідини додають рівний об'єм 25% розчину каоліну на ФР. Суміш активно струшують в шутелі 20 хв., а потім центрифугують 10 хв. при 2000 об/хв. Надосадова рідина - це сироватка в розведенні 1:10. В реакції використовують 0,5% суспензії еритроцитів морської свинки. В РІГА використовують розчин діагностикуму, що містить 4 аглютинуючі одиниці вірусу (АО) у робочій дозі. Постановку реакції ведуть, як вказано в інструкції до сироваток.
Діагностично достовірним є чотирикратне збільшення титрів антитіл у післяінфекційн й сироватці в порівнянні з сироваткою, отриманою на початку захворювання.
Реакція зв'язування комплементу (РЗК).
Ця реакція використовується у серодіагностиці грипу, РС-інфекції, аденовірусних захворюваннях. Вона не диференціює підтипи вірусів, але виявляє актитіла до загального комплементзв'язуючого антигену.
РЗК відноситься до складних серологічних реакцій. Окрім антигену і антитіл <= в ній беруть участь ще гемолітична система, яка виявляє результати реакції.
Найбільш прийнятим є мікрометод РЗК, завдяки якому досягається економія матеріалів і сироваток. Постановка РЗК детально викладена в інструкції до набору реагентів.
Реакція має найбільш широке застосування при діагностиці аденовірусної інфекції.
