Отримання індивідуальних даних є необхідним. Крім цього, всідані мають бути зведені в таблицю, де для кожної дослідної групизазначено кількість тварин на початку досліду, кількість тварин, уяких виявлено ушкодження, вплив на поведінку або біохімію, типискладності цих ушкоджень або впливу, відсоток тварин, у якихвиявлено кожен тип ушкоджень і ступінь складності кожногоушкодження або впливу.
Результати цього досліду мають бути оцінені з точки зоруступеню впливу, складності і кореляції поведінкового, біохімічногоі гістопатологічного ефектів і будь-яких інших наявних ефектів вдослідній і контрольній групах.
Числові результати повинні бути оцінені відповідним ізагальноприйнятим статистичним методом. Статистичні методи, щовикористовуються, вибираються у відповідності до типу досліду.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду, якщо це можливо, повинен містити в собінаступну інформацію:
3.1. Піддослідні тварини:
- вид, що використовувався,
- кількість і вік тварин,
- джерело, умови проживання і т.ін.,
- індивідуальна вага кожної тварини на початку досліду.
3.2. Умови проведення досліду:
- детальну інформацію щодо приготування дослідної речовини,її стабільності і гомогенності, якщо необхідно,
- обґрунтування вибору середовища-носія,
- детальна інформація щодо способу приймання дослідноїречовини,
- детальна інформація щодо якості їжі і води,
- обґрунтування вибору доз,
- описання доз, що приймаються, включаючи інформацію щодосередовища-носія, об'єму і фізичної форми матеріалу, що надається,
- ідентифікація і детальна інформація щодо будь-якої захисноїречовини.
3.3. Результати:
- дані щодо ваги тіла,
- дані щодо токсичної реакції у відповідності до групи,включаючи смертність,
- природа, складність і тривалість клінічних наслідків(виліковних або ні),
- детальний опис біохімічних методів і результатів,
- результати розтину,
- детальний опис всіх результатів гістопатологічнихдосліджень,
- статистичне представлення результатів, якщо необхідно.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
Цей метод є аналогічним до методу OECD TG 418.
В.38. ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ЗАТРИМАНОЇ НЕЙРОТОКСИЧНОСТІ
З ПОВТОРЮВАНОЮ ДОЗОЮ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
При оцінюванні і аналізі токсичних ефектів речовин важливовзяти до уваги потенціал окремих класів речовин викликатиспецифічні типи нейротоксичності, які не можуть бути виявлені підчас інших досліджень токсичності. Виявлено, що певніфосфорорганічні речовини викликають затриману нейротоксичність ітому, їх слід розглядати як такі, що мають бути досліджені.
Можуть бути застосовані лабораторні скрінінг-тести дляідентифікації речовин, що можуть викликати затримануполіневропатію; однак, негативні результати лабораторнихдосліджень не є доказом того, що речовина не викликаєнейротоксичного ефекту.
Цей 28-денний дослід, направлений на дослідженнянейротоксичності, надає інформацію щодо можливих видів небезпекидля здоров'я, які можуть бути викликані повторною експозицієювпродовж обмеженого проміжку часу. Цей дослід надасть інформаціющодо реакції на дозування і дозволить оцінити невиявлений рівеньшкідливих ефектів, який може виявитись корисним для визначеннякритеріїв безпеки щодо експозиції.
Дивіться також Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Фосфорорганічні речовини містять вільні фосфорорганічніефіри, тіоефіри або ангідриди, що є органічними похіднимифосфорної кислоти, фосфорної кислоти і фосфороамідних кислот, таїхніх тіопохідних, або інші речовини, що можуть викликатизатриману нейротоксичність, що інколи спостерігається в речовинахцього класу.
Затримана нейротоксичність є синдромом, пов'язаним з тривалимзатриманим початком атаксії, дистальною аксонопатією хребта іпериферійного нерву, а також пригніченням і старіннямневропатичної цільової естерази (NTE) в нервовій тканині.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідна речовина щоденно подається пероральним шляхомденними дозами домашнім курям впродовж 28 днів. За тваринамиведеться принаймні щоденний нагляд на предмет виявлення аномалій вповедінці, атаксії і паралічу до спливу 14 днів після отриманняостанньої дози. Біохімічні аналізи, зокрема, пригніченняневропатії цільової естерази (NTE) проводяться на курях, щовипадково вибираються до кожної групи, як правило, через 24 і48 годин після отримання останньої дози. Через два тижні післяотримання останньої дози кури, що залишились умертвляються, післячого проводиться гістопатологічний огляд вибраних нервових тканин.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
Здорові молоді дорослі кури, що не заражені інфекційнимихворобами, не приймали медикаментів, і не мають аномалій в ходівипадково відбираються і розподіляються до дослідних і контрольнихгруп, після чого вони проходять акліматизацію в лабораторнихумовах впродовж принаймні п'яти днів до початку досліду.
Клітки або приміщення, що мають достатню площу для того, щобкури могли вільно пересуватись, для того, щоб можна було оцінитиходу.
Дозування дослідної речовини відбувається впродовж семи днівна тиждень пероральним шляхом, бажано з використанням зонду абожелатинових капсул. Рідини можуть подаватись нерозчиненими аборозчиненими у відповідному середовищі такому як кукурудзяне масло;тверді речовини необхідно розчинити, якщо це можливо, оскількизначні дози твердих речовин в желатинових капсулах можуть незасвоїтись організмом належним чином. Для безводних середовищнеобхідно знати токсичні характеристики середовища, а якщо вони невідомі, їх необхідно визначити до початку досліду.
1.4.2. Умови досліду
1.4.2.1. Піддослідні тварини
Рекомендується відбирати молодих дорослих курей в періодяйцекладки (Gallus gallus domesticus), віком від восьми до12 місяців. Використовуються породи і штами стандартного розміру,кури повинні бути вирощені в умовах, що дозволяють їм рухатисьвільно.
1.4.2.2. Кількість і стать
Звичайно використовується три дослідні групи і контрольнагрупа, що використовує середовище-носія. Умови, в яких знаходитьсяконтрольна група, що використовує середовище-носія, є ідентичнимиумовам дослідної групи окрім приймання дослідної речовини.
Кількість птахів в кожній групі повинна бути достатньою длятого, щоб можна було умертвити принаймні шість птахів дляпроведення біохімічного аналізу (по три особини за два етапи), ашість птахів залишити живими для проведення 14-денного оглядупісля проведеного досліду на предмет виявлення патології.
1.4.2.3. Рівні доз
Рівні доз вибираються з урахуванням результатів дослідженнязатриманої нейротоксичності після значної експозиції, а такожінших наявних токсичних або кінетичних даних щодо дослідноїречовини. Найвищий рівень дози вибирається з метою викликаннятоксичних ефектів, бажано затриманої нейротоксичності, але несмертності або значних страждань. Потім вибираються наступні нижчірівні доз з метою демонстрації будь-яких реакцій, пов'язаних здозуванням і не виявлення шкідливих ефектів при найнижчому рівнідозування.
1.4.2.4. Тест на граничний вміст
Якщо в результаті досліду при рівні дози принаймні1 000 мг/кг ваги тіла з використанням процедур, описаних для цьогодосліду, не виявлено токсичних ефектів і, якщо токсичність неочікується на підставі даних, отриманих відносно структурнопов'язаних речовин, в проведенні досліду з вищим рівнем дози неманеобхідності. Цей тест на граничний вміст застосовується завинятком тих випадків, коли дія дослідної речовини на людинувказує на необхідність застосування вищого рівня дози.
1.4.2.5. Період нагляду
Всі тварини оглядаються принаймні щодня впродовж періодуекспозиції і впродовж 14 днів після його закінчення окрімвипадків, коли на цей період заплановано загальний розтин.
1.4.3. Процедура
Дослідна речовина надається сім днів на тиждень впродовж28 днів.
Загальний огляд
Огляди повинні розпочатись негайно після початку наданнядослідної речовини. Всі кури уважно оглядаються принаймні щодня вкожний з 28 днів досліду і вподовж 14 днів після дозування дозапланованого умертвіння. Всі ознаки токсичності необхіднозаписати, включаючи час виявлення, тип, ступінь складності ітривалість. Огляди повинні включати в себе огляди на предметвиявлення поведінкових аномалій, але не обмежуватись ними. Атаксіяоцінюється у відповідності до звичайної шкали, що складаєтьсяпринаймні з чотирьох рівнів, випадки виявлення паралічу мають бутизаписані. Принаймні два рази на тиждень кури виводяться за межікліток і примушуються до періодичної моторної активності, такоїяк, піднімання по драбині, для полегшення виявлення мінімальноготоксичного ефекту. Птахи в передсмертному стані або тварини, щомають значні розлади або біль після виявлення цих ознак повиннібути усунені, безболісно вбиті і піддані розтину.
Вага тіла
Всі кури мають бути зважені безпосередньо до поданнядослідної речовини і принаймні один раз на тиждень після цього.
Біохімія
Шість курей, вибраних випадково з дослідної і контрольноїгрупи, що використовувала середовище-носія вбиваються впродовждекількох днів після отримання останньої дози, а мозок іпоперековий відділ хребта мають бути підготовлені і проаналізованіна предмет виявлення ознак пригнічення невропатичної цільовоїестерази (NTE). Крім того, може виявитись необхідною підготовка іаналіз тканини сідалищного нерву на предмет виявлення ознакпригнічення невропатичної цільової естерази (NTE). Звичайно триптаха з контрольної і кожної дослідної групи умертвляються після24 годин, а три птаха - після 48 годин після отримання останньоїдози. Якщо дані, отримані в результаті дослідження затриманоїнейротоксичності після значної експозиції або в результаті іншихдосліджень (наприклад, дослідження токсикокінезу) вказують надоцільність іншого часу умертвіння після отримання останньої дози,необхідно умертвити тварин в цей час і задокументувати відповідніобґрунтування.
Аналіз ацетилхолінестерази (AChE) також може бути проведенона цих зразках, якщо це доцільно. Однак, спонтанна реактиваціяAChE може відбутись in vivo і, таким чином, призвести донедооцінки потенціалу речовини в якості інгібітору AChE.
Загальний розтин
Загальний розтин всіх тварин (вбитих за планом і вбитих впередсмертному стані) повинен включати в себе огляд зовнішньоговигляду мозку і хребта.
Гістопатологічний огляд
Нервові тканини тварин, що вижили впродовж періоду огляду, іне використовувались для біохімічних дослідів, повинні піддатисьмікроскопічному огляду. Тканини обробляються фіксатором in situ звикористанням техніки перфузії. Необхідно виконати розрізи мозочку(середній подовжній рівень), видовженого мозку, хребта іпериферійних нервів. Розріз хребта виконується на потиличномусегменті, середньо-грудній і попереково-крижовій зоні. Необхідновиконати розрізи дистальної зони, тибіального нерву і їхвідгалуження до литкового м'язу, а також сідалищного нерву.Розрізи необхідно дослідити, шляхом мієлінового абоаксон-специфічного плямування. Початково мікроскопічний оглядповинен бути проведений на збережених тканинах всіх твариндослідної групи і групи з високим рівнем дозування. У випадку,коли ефекти в групі з високим рівнем дозування є очевидним,необхідно також провести мікроскопічне дослідження курей з груп зсереднім і низьким рівнем дозування.
2. ДАНІ
Негативні результати в критичних точках, вибраних для цьогометоду (біохімія, гістопатологія і дослідження поведінки) звичайноне вимагають подальшого дослідження затриманої невпротоксичності.Неоднозначні або неостаточні результати в цих критичних точкахможуть вимагати проведення подальших дослідів.
Отримання індивідуальних даних є необхідним. Крім цього, всідані мають бути зведені в таблицю, де для кожної дослідної групизазначено кількість тварин на початку досліду, кількість тварин, уяких виявлено ушкодження, вплив на поведінку або біохімію, типискладності цих ушкоджень або впливу, відсоток тварин, у якихвиявлено кожен тип ушкоджень і ступінь складності кожногоушкодження або впливу.
Результати цього досліду мають бути оцінені з точки зоруступеню впливу, складності і кореляції поведінкового, біохімічногоі гістопатологічного ефектів і будь-яких інших наявних ефектів вдослідній і контрольній групах.
Числові результати повинні бути оцінені відповідним ізагальноприйнятим статистичним методом. Статистичні методи, щовикористовуються, вибираються у відповідності до типу досліду.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду, якщо це можливо, повинен містити в собінаступну інформацію:
3.1. Піддослідні тварини:
- вид, що використовувався,
- кількість і вік тварин,
- джерело, умови проживання і т.ін.,
- індивідуальна вага кожної тварини на початку досліду.
3.2. Умови проведення досліду:
- детальну інформацію щодо приготування дослідної речовини,її стабільності і гомогенності, якщо необхідно,
- обґрунтування вибору середовища-носія,
- детальна інформація щодо способу приймання дослідноїречовини,
- детальна інформація щодо якості їжі і води,
- обґрунтування вибору доз,
- описання доз, що приймаються, включаючи інформацію щодосередовища-носія, об'єму і фізичної форми матеріалу, що надається,
- обґрунтування вибору часу для припинення біохімічногодосліду, якщо він відрізняється від періодів тривалість 24 і48 годин.
3.3. Результати:
- дані щодо ваги тіла,
- дані щодо токсичної реакції у відповідності до групи,включаючи смертність,
- рівень неочевидних шкідливих ефектів,
- природа, складність і тривалість клінічних наслідків(виліковних або ні),
- детальний опис біохімічних методів і результатів,
- результати розтину,
- детальний опис всіх результатів гістопатологічнихдосліджень,
- статистичне представлення результатів, якщо необхідно.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
Цей метод є аналогічним до методу OECD TG 419.
В.39. ДОСЛІДЖЕННЯ ПОЗАПЛАНОВОГО/РЕПАРАТИВНОГО СИНТЕЗУ
ДНК НА КЛІТИНАХ ПЕЧІНКИ ССАВЦІВ IN VIVO
1. МЕТОД
Цей метод є аналогічним до методу OECD TG 486, Дослідженнярепаративного синтезу ДНК на клітинах печінки ссавців In Vivo(1997).
1.1. ВСТУП
Метою дослідження репаративного синтезу ДНК на клітинахпечінки ссавців in vivo є ідентифікація дослідних речовин, щовикликають репарацію ДНК в клітинах печінки піддослідних тварин(дивіться 1, 2, 3, 4).
Цей дослід in vivo забезпечує метод виявлення генотоксичнихефектів на печінку, викликаних хімічними речовинами. Виявленікритичні точки є показником ушкодження ДНК і подальшої репараціїклітин печінки. Звичайно печінка є основним органом, що відповідаєза метаболізм засвоюваних складових частин. Таким чином, печінка єприйнятним органом для вимірювання ушкодження ДНК in vivo.
Якщо є докази того, що дослідна речовина не досягне цільовоїтканини, в застосуванні цього досліду нема необхідності.
Критична точка досліду репаративного синтезу ДНК з клітинамипечінки ссавців in vivo визначається прийманням міченихнуклеозідів в клітинах, що не піддавались синтезу ДНК (фаза S).Найширше використовується техніка визначення приймання
3
трітіум-міченого тимідіну
( H-TdR)
радіографічним методом. Печінкищурів, яких рекомендується використовувати для дослідження
репаративного синтезу ДНК (UDS) in vivo. Можуть використовуватись
тканини, крім тканин печінки, але вони не піддається цьому методу
дослідження.
Виявлення реакції UDS залежить від кількості основ ДНК, щовидаляються і замінюються в місці ушкодження. Таким чиномдослідження UDS є винятково важливим для виявлення "репараціїдовгих фрагментів ДНК" (20-30 основ), викликаної дослідноюречовиною. Для контрасту визначається "репарація короткихфрагментів ДНК" (1-3 основи) зі значно нижчим рівнем чутливості.Крім того, можуть зустрічатись випадки мутагенності черезвідсутність репарації, неправильну репарацію або неправильнуреплікацію ушкоджень ДНК. Обсяг реакції UDS не визначає надійністьпроцесу репарації. Крім того, можливим є випадок, при якомумутаген реагує з ДНК, але пошкодження ДНК не відновлюється завдякипроцесу відновлення шляхом видалення ушкодженої ділянки.Відсутність специфічної інформації щодо мутагенної активності,отриманої в результаті дослідження UDS компенсується потенціальноючутливістю цієї критичної точки, оскільки вона визначається длявсього геному.
Дивіться також Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Клітини в стадії відновлення: відносна кількість ядровоїзернистості (NNG), що є вищою від актуального значення, яке можебути визначено в лабораторії, в якій проводиться дослідження.
Відносна кількість ядрової зернистості (NNG): кількіснийпоказник активності клітин UDS при радіографічних дослідженняхUDS, який визначається шляхом віднімання середньої кількостіцитоплазмофих ядер в ядерно-еквівалентних цитоплазматичних зонах(CG) від кількості ядер (NG): NNG=NG-CG. Кількість NNGвизначається для окремих клітин, а потім підсумовується дляклітин, що культивуються, в паралельних культурах і т.ін.
Репаративний синтез ДНК (UDS): репаративний синтез ДНК післявидалення і заміни ділянки ДНК, що містить ушкодження, викликанехімічною речовиною або фізичними факторами.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження UDS на клітинах печінки ссавців in vivo визначаєсинтез відновлення ДНК після видалення і заміни ділянки ДНК, щомістить ушкодження, викликане хімічними речовинами або фізичними
3
факторами. Звичайно дослід спирається на внесення H-TdR до клітин
ДНК печінки, які мають низьку частотність клітин в фазі S
3
клітинного циклу. Приймання H-TdR звичайно визначається за
допомогою авторадіографії, оскільки ця техніка не має високої
чутливості до інтерференції з клітинами фази S, як, наприклад,
підрахунок імпульсів в рідинній фазі.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Вибір видів тварин
Для досліду звичайно використовують щурів, однак, також можнавикористовувати будь-які інші види ссавців. Звичайно в дослідівикористовуються види молодих дорослих лабораторних тварин. Напочатку досліду розбіжність в вазі тварин повинна бути мінімальноюі не перевищувати +- 20% середньої ваги тварин кожної статі.
1.4.1.2. Розміщення і умови харчування
Застосовуються загальні умови, зазначені в Загальному вступідо частини В, при цьому рівень вологості повинен знаходитись вмежах 50-60%.
1.4.1.3. Підготовка тварин
Здорові молоді тварини випадково відбираються до контрольноїі дослідної груп. Клітки облаштовуються таким чином, щобмінімізувати можливий вплив, викликаний місцем розташуванняклітки. Тварини ідентифікуються індивідуально і знаходятьсяв клітках впродовж принаймні п'яти дні до початку досліду дляакліматизації в лабораторних умовах.
1.4.1.4. Дослідна речовина/Підготовка
Тверді дослідні речовини до початку дозування розчиняютьсяабо підвішуються у відповідних розчинниках або середовищах-носіяхі розбавляються, якщо це необхідно. Рідкі дослідні речовини можутьподаватись в нерозчиненому або розчиненому вигляді. Для дослідунеобхідно використовувати свіжі речовини, окрім випадків, колидані стабільності демонструють прийнятність зберігання речовини.
1.4.2. Умови досліду
1.4.2.1. Розчинник/Середовище
Розчинник/середовище не повинен викликати токсичних ефектівпри рівнях доз, що використовуються, і не повинен за підозрою бутитаким, що вступає в хімічну реакцію з дослідною речовиною. Якщовикористовуються не добре відомі розчинники/середовища, їхвикористання в досліді повинно бути обґрунтоване на підставіданих, які вказують на їхню відповідність. Рекомендується,наскільки можливо, в першу чергу розглядати можливістьвикористання водних розчинників/середовищ.
1.4.2.2. Контроль
В кожну незалежну частину експерименту необхідно включитипаралельний позитивний і негативний контроль(розчинник/середовище). Окрім прийому дослідної речовини, тваринив контрольній групі повинні знаходитись в тих самих умовах, що ітварини в дослідних групах.
Для позитивного контролю використовуються речовини, що відоміяк такі, що викликають UDS, якщо вони подаються при рівні діїречовини, стосовно якого очікується підвищення, яке перевищує фон.Позитивний контроль, при якому вимагається метаболічна активація,використовується при дозах, що виявляють помірну реакцію (4). Дозиможуть бути вибрані таким чином, щоб ефект був очевидним, але невідкривав негайно досліднику сутність закодованих мікроскопічнихслайдів. Прикладами позитивних контрольних речовин є наступніречовини:
------------------------------------------------------------------
| Періоди відбору | Речовина |Номер CAS|Номер Einecs|
| зразків | | | |
|-----------------+-----------------------+---------+------------|
|Ранні періоди |N-нитрозодиметиламин |62-75-9 |200-249-8 |
|відбору зразків | | | |
|(2-4 години) | | | |
|-----------------+-----------------------+---------+------------|
|Пізні періоди |N-2-флуоренилацетамид |53-96-3 |200-188-6 |
|відбору зразків |(2-AAF) | | |
|(12-16 годин) | | | |
------------------------------------------------------------------
Можна використовувати інші позитивні контрольні речовини.Шлях приймання позитивної контрольної речовини, що відрізняєтьсявід шляху прийому дослідної речовини є прийнятним.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Кількість і стать тварин
Для досліду використовується відповідна кількість тварин,враховуючи природні біологічні розбіжності в реакції на досліднуречовину. Кількість тварин повинна складати принаймні три тварини,що підлягають аналізу на групу. У випадку, якщо зібрана значнаісторична база, необхідна кількість тварин для паралельноїпозитивної і негативної контрольної групи складає всього одну абодві тварини.
Якщо під час досліду в наявності є дані, отримані врезультаті проведення дослідів на тих самих видах тварин, і звикористанням того самого способу прийому дослідної речовини, якісвідчать про те, що нема значної різниці щодо токсичності заокремими статями, тоді дослід може проводиться на тваринах однієїстаті, бажано на самцях. Якщо дія дослідної речовини на організмлюдини може бути різною у відповідності до статі, наприклад, увипадку деяких фармацевтичних речовин, дослід проводиться натваринах відповідної статі.
1.5.2. Графік вживання дослідної речовини
Дослідна речовина звичайно подається вподовж єдиного етапувпливу дослідної речовини.
1.5.3. Рівні доз
Звичайно використовується принаймні два рівні доз. Найвищадоза визначається, як доза, що виявляє ознаки токсичності, такимчином, щоб вищі рівні доз, що приймаються у відповідності до тогосамого режиму дозування могли б викликати смертні випадки.Взагалі, нижчі дози повинні складати від 50% до 25% від вищоїдози.
Речовини з особливою біологічною активністю при низькихнетоксичних дозах (такі як гормони і мітогени) можуть бутивиключенням щодо критерію вибору дози і дози таких речовинвизначаються в залежності від кожного конкретного випадку. Якщоповодиться дослід з метою визначення діапазону доз в зв'язку звідсутністю необхідних даних, він повинен проводитись в тій самійлабораторії, з використанням тварин тих самих видів, штамів, статіі з застосуванням того самого режиму дозування, що і при основномудосліді.
Найвища доза може також визначатись як доза, що викликаєпевні ознаки токсичності в печінці (наприклад, пікнотичні ядра).
1.5.4. Тест на граничний вміст
Якщо в результаті досліду при одному рівні дози принаймні2 000 мг/кг ваги тіла при однократній або двократній дії дослідноїречовини, не виявлено токсичних ефектів і, якщо генотоксичність неочікується на підставі даних, отриманих відносно структурнопов'язаних речовин, в проведенні повного досліду неманеобхідності. Очікуваний вплив на організм людини може вказуватина необхідність використання вищого рівня дози при проведеннітесту на граничний вміст.
1.5.5. Приймання доз
Дослідна речовина звичайно подається за допомогою зонду звикористанням шлункового зонду або відповідного катетера. Іншіспособи прийому дослідної речовини є прийнятними, якщо їхнєвикористання обґрунтоване. Однак, використанняінтраперітонеального способу не рекомендується, оскільки притакому способі печінка піддається впливу дослідної речовинибезпосередньо, а не через систему кровообігу. Максимальний об'ємрідини, який може бути введений через зонд або через ін'єкцію заодин раз залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм неповинен перевищувати 2 мл/100 г ваги тіла. Використання об'ємів,що перевищують вищезазначений об'єм необхідно обґрунтувати. Крімречовин, що викликають подразнення або корозію, які звичайновиявляють подразнюючу дію при більших рівнях концентрації,змінність об'єму дослідної речовини необхідно звести до мінімумудля забезпечення однакового об'єму речовини при всіх рівнях доз.
1.5.6. Препарування клітин печінки
Клітини печінки препаруються у тварин, що піддавались діїдослідної речовини, звичайно через 12-16 годин після дозування.Додатковий більш ранній час відбору зразків (звичайно від двох дочотирьох годин після дії речовини) звичайно є необхідним, окрімвипадків наявності очевидної позитивної реакції через 12-16 годин.Однак, відбір зразків може здійснюватись в інший час, якщо такийчас є обґрунтованим на підставі токсикокінетичних даних.
Короткочасні культури клітин печінки ссавців звичайновизначаються шляхом оббризкування печінки in situ колагеназою інадання можливості нещодавно відділеним клітинам печінкиприєднатись до відповідної поверхні. Клітини печінки тварин знегативної контрольної групи повинні мати рівень життєздатності(5) принаймні 50%.
1.5.7. Визначення НСД
Щойно відокремлені клітини печінки ссавців, зазвичай, 3вирощуються в середовищі що містить H-TdR протягом відповідногоперіоду часу, наприклад, 3-8 год. По закінченню інкубаційногоперіоду слід відділити середовище від клітин, які далі можутьвирощуватись в середовищі, що містить надлишок неміченого тимідинуз метою зменшення неінкорпорованої радіоактивності (холоднийчейз). Потім клітини промивають, фіксують і висушують. Длятриваліших інкубаційних періодів немає необхідності у застосуванніхолодного чейзу. Предметні скельця занурюють в авторадіографічнуемульсію, виставляють у темряві (напр. зберігають у прохолодномумісці протягом 7-14 днів), і підраховують розвинені, забарвлені інаявні сріблясті зерна. Предметні скельця готують у співвідношеннідва до трьох для кожної тварини.
1.5.8. Аналіз
Препарати на предметних скельцях мають містити достатнюкількість клітин із нормальною морфологією з метою проведенняоцінки значення НСД. Препарати досліджуються мікроскопічно наознаки видимої цитотоксичності (наприклад, пікноз, скорочені рівнівведення радіоактивних ізотопів).
Перед підрахунком зерен предметним скельцям маєпривласнюватися код. Зазвичай, підраховують 100 клітин з кожноїтварини з щонайменше двох предметних скелець; підрахунокщонайменше 100 клітин/на тварину має бути виправданим. Підрахунокзерен не здійснюється для ядра S-фази, але співвідношення клітинS-фази може записуватись.
3
Кількість включень H-TdR в ядрі та у цитоплазмі клітин знормальною морфологією, доказом чого є осад сріблястих зерен, маєвизначатись відповідними методами.
Кількість зерен визначається за ядром (зерна ядра, ЗЯ) та наеквівалентних ядру ділянках (зерна цитоплазми, ЗЦ). Кількість ЗЦвимірюється або в найбільш інтенсивно міченій ділянці цитоплазми,або в зернах цитоплазми, прилеглих до ядра, із розрахунку два дотрьох. Інші методи підрахунків (наприклад, підрахунок ціліснихклітин) можуть використовуватись, якщо вони є виправданими (6).
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Мають надаватись індивідуальні предметні скельця та дані протварин. Окрім цього, всі дані слід підсумовувати у формі таблиці.Кількість зерен сітки ядра (ЗСЯ) слід підраховувати для кожноїклітини, для кожної тварини і для кожної дози і часу, шляхомвіднімання підрахунків ЗЦ з підрахунків ЗЯ. У випадку проведенняпідрахунків "клітин в репарації", критерії визначення "клітин врепарації" мають обґрунтовуватися та засновуватися на данихнегативного історичного або супутнього контролю. Результати,отримані у цифрах, можуть бути оцінені із застосуваннямстатистичних методів. У випадку застосування статистичних методів,тести мають обиратися та обґрунтовуватися до проведеннядослідження.
2.2. ОЦІНЮВАННЯ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Приклади критеріїв позитивної/негативної оцінки:
позитивна (i) ЗСЯ вище попередньо встановленого порогу,
який підтверджено на основі історичних
даних лабораторії; чи
(ii) значення ЗСЯ значно вище за значення,
отримане під час супутнього контролю;
негативна (i) ЗСЯ має показник в межах порогу
історичного контролю; чи
(ii) ЗСЯ має показник, який є незначно більшим
за показник, отриманий під час проведення
супутнього контролю.
Слід враховувати біологічну релевантність даних: тобто, маютьвраховуватися такі параметри, як міжтваринна варіативність,співвідношення реакції на дозування та цитотоксичності.Статистичні методи можуть використовуватись в якості допоміжнихпід час проведення оцінки результатів дослідження.
Проте, значення статистичного методу не повинно бути єдинимвизначальним фактором для позитивної оцінки. Хоча більшістьекспериментів надають лише позитивні або негативні результати, впоодиноких випадках отримані дані перешкоджають формуваннюоднозначного судження щодо дії досліджуваної речовини. Результатиможуть залишатися сумнівними або під питанням, незалежно від тогоскільки разів повторювався дослід.
Позитивний результат дослідження НСД клітин печінки ссавцівin vivo показує, що досліджувана речовина спричиняє руйнування ДНКв клітинах печінки ссавців in vivo, які можна відновитинезапланованим синтезом ДНК in vitro. Негативний результат показуєвказує на те, що в умовах проведення дослідження, досліджуванаречовина не спричиняє руйнування ДНК, що демонструється під часдослідження проведення даного тесту.
Ймовірність того що досліджувана речовина досягне загальноїциркуляції, а саме цільової тканини (наприклад, систематичноїтоксичності) є дискусійним питанням.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про проведення дослідження має містити наступнуінформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування вибору середовища,
- розчинність та стійкість досліджуваної речовини урозчиннику/середовищі, якщо вони відомі.
Піддослідні тварини:
- різновид/вид, який використовується,
- кількість, вік та стать тварин,
- походження, умови утримування, дієта, та ін.,
- індивідуальна вага тварин на початку дослідження, включаючиіндивідуальний діапазон маси тіла, середній показник та відхиленнявід стандарту для кожної групи.
Умови проведення дослідження:
- позитивний та негативний контроль розчинника,
- дані дальнометричного дослідження, у випадку йогопроведення,
- обґрунтування вибору рівня дозування,
- докладна інформація щодо приготування досліджуваноїречовини,
- докладний інформація щодо застосування досліджуваноїречовини,
- обґрунтування напряму застосування,
- методи для перевірки того, що досліджувана речовина досяглазагальної циркуляції або цільової тканини, у випадку застосування,
- перехід від концентрації досліджуваної речовини уїжі/питній воді (у мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг/маситіла/на день), у випадку застосування,
- докладна інформація про якість їжі та води,
- докладний опис обробки та графіків відбору зразків,
- методи вимірювання токсичності,
- методи приготування клітин печінки та їх вирощування,
- використана авторадіографічна техніка,
- кількість приготованих предметних скелець та кількістьпідрахованих клітин,
- критерії оцінювання,
- критерії віднесення дослідження до позитивного, негативногоабо сумнівного розряду.
Результати:
- індивідуальне предметне скельце, середні показники зеренядра тварин та груп, зерен цитоплазми та зерен сітки ядра,
- співвідношення доза-реакція, де можливо,
- статистичне оцінювання, за умови проведення,
- ознаки токсичності,
- дані супутнього негативного (розчинник/середовище) тапозитивного контролю,
- історичні дані негативного (розчинник/середовище) тапозитивного контролю, включаючи діапазон, середні показники тавідхилення від стандарту,
- кількість "клітин на відновленні" якщо вони визначені,
- кількість клітин фази S-фази, якщо вони визначені,
- життєздатність клітин.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G.,(1985) An Assessment of the In Vivo Rat Hepatocyte DNA RepairAssay. Mutation Res., 156, p. 1-18.
(2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D.,Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G., (1987) A Protocol andGuide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. MutationRes., 189, p. 123-133.
(3) Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A.,Burlinson, B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G.,(1993) In Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M.,(Eds) Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM RecommendedProcedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for MutagenicityTesting. Report. Part II revised. Cambridge University Press,Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 52-77.
(4) Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G.,Burlinson, B., Doolittle, D.J., Furihata, C., Hertner, T.,McQueen, C.A. and Mori, H., (1993) Recommendations for thePerformance of UDS TestsIn VitroandIn Vivo. Mutation Res., 312,p. 263-285.
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. andHechenberger-Freudl, C., (1993) Assessment of the Relation Betweenthe Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated RatHepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS).Mutation Res., 291, p. 21-27.
(6) Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E., (1982)Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In VitroHepatocyte DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, p. 553-562.
B.40. РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ IN VITRO: ТЕСТ НА ОПІР ДІЇ
ЕЛЕКТРИЧНОГО СТРУМУ ЧЕРЕЗ ШКІРУ (ТОДЕСЧШ)
1. МЕТОД
Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 430(2004).
1.1. ВСТУП
Під роз'їданням шкіри розуміється виникнення необоротногопошкодження шкіри одразу після застосування досліджуваногоматеріалу (за визначенням Глобальної Гармонізованої СистемиКласифікації та Мічення Хімічних Речовин та Сумішей (ГГС) (1). Цейметод забезпечує процедуру, за якої оцінка роз'їдаючої дії нашкіру не проводиться на живих тваринах.
Оцінка роз'їдаючої дії на шкіру, зазвичай, включалавикористання піддослідних тварин (2). Через стурбованість болем тастражданням, якого тварини зазнавали під час проведення цьогодослідження, було переглянуто метод B.4, який надає можливістьвизначити роз'їдання шкіри шляхом використання альтернативнихметодів in vitro, що дозволяють уникнути спричинення болі тастраждань тваринам.
Першим кроком для визначення альтернативних методівдосліджень, які можна було б використовувати для дослідженняроз'їдаючої дії на шкіру, в регулятивних цілях, було проведенняпопереднього аналізу неупередженої вибірки (3). Після цьогоофіційний аналіз неупередженої вибірки методів оцінки роз'їданняшкіри in vitro (4)(5) було проведено (6)(7)(8). Результатипроведення цих аналізів та іншої опублікованої літератури призвелидо появи рекомендацій про те, що наступні тести можутьвикористовуватись для оцінки роз'їдання шкіри in vivo (9)(10)(11):тестування на моделі людської шкіри (див. метод дослідження B.40другу частину) та тест на опір дії електричного струму через шкіру(цей метод).
Аналіз неупередженої вибірки та інші матеріали опублікованихдосліджень повідомляють, що дослідження дії електричного струмучерез шкіру щурів (ТОДЕСЧШ) (12)(13) надають можливість чіткорозрізняти відомимі роз'їдаючі і не роз'їдаючі шкіру речовини(5)(9).
Дослідження, описане в цьому методі, надає можливістьвизначити роз'їдаючі шкіру хімічні речовини та суміші. Окрім того,дослідження надає можливість визначити речовини та суміші, які незавдають роз'їдаючого впливу на шкіру, за умови підтвердженняцього факту іншою наявною інформацією (наприклад, pH,взаємозв'язок між структурою та роз'їдаючою дією, дані щодо людинита/чи тварини) (1)(2)(11)(14). Дослідження не надає інформаціїщодо подразнення шкіри, а також не дозволяє вивестипід-класифікацію роз'їдаючих шкіру речовин, що дозволяєтьсяГлобальною Гармонізованою Системою Класифікації (ГГС) (1).
Для проведення детальної оцінки місцевих впливів на шкірупісля одноразової дії на шкіру, рекомендується дотримуватисьпослідовної стратегії проведення тестувань, що додається до методупроведення дослідження B.4 (2) і надається ГлобальноюГармонізованою Системою (1). Ця стратегія проведення тестуваньвключає проведення досліджень щодо роз'їдання шкіри in vitro (якописано в цьому методі) та щодо подразнення шкіри перед тим, якрозглядати можливість проведення тестування на живих тваринах.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Роз'їдання шкіри in vivo: це виникнення необоротних ушкодженьшкіри, а саме видимого некрозу крізь епідерму та у дермі, впродовжчотирьох годин після застосування досліджуваної речовини. Реакціїроз'їдання характеризуються язвами, кровотечами, кривавимиструпами та наприкінці спостереження на 14-ий день, знебарвленнямшкіри через відбілювання шкіри, ділянками повного облисіння, ташрамами. З метою оцінки підозрілих ушкоджень, слід враховуватирезультати гістопатологічних досліджень.
Опір дії електричного струму через шкіру (ОДЕСЧШ): цепоказник опору шкіри дії електричного струму, виражений в кілоОмах. Простий та надійний метод оцінювання функції бар'єру шляхомфіксування проходження іонів через шкіру з використанням приладуМісту Уітстона.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Таблиця 1
Еталонні хімічні реагенти
------------------------------------------------------------------
| Назва | N ЄРІКХР | N РСХ | |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|1,2-Діамінопропан |201-155-9 |78-90-0 |Сильно роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Акрилова кислота |201-177-9 |79-10-7 |Сильно роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|2-трет. Бутилфенол |201-807-2 |88-18-6 |Роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Гідроксид Калію (10%) |215-181-3 |1310-58-3 |Роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|