Про удосконалення протихолерних заходів в Україні

4.3.5. Нетоксигенні (які не містять ген холерного токсину vct-) варіанти холерних вібріонів 01 та інших серогруп можуть викликати спорадичні (поодинокі) або групові захворювання (при спільному джерелі інфікування), які не схильні до широкого епідемічного розповсюдження.

4.3.6. Попередню ідентифікацію проводять по комплексу ознак, включаючи морфологію колоній, морфологію і рухливість мікробних клітин, пробу на оксидазу і аглютинацію на склі (слайд-аглютинація) з сироватками 01 (1:100), RO (1:50) і 0139 (в розведенні, відповідно позначенню на етикетці). Для культур, які позитивно реагують з сироваткою 01, RO, встановлюють належність до серологічного варіанту (Інаба і Огава) також в слайд-аглютинації.

4.3.7. Остаточну ідентифікацію виділених на полівуглеводному середовищі або лужному агарі культур, які аглютинуються на склі, проводять по скороченій або повній схемі.

4.3.7.1. Скорочена ідентифікація передбачає вивчення культури в розгорнутій реакції аглютинації з холерними сироватками 01, Інаба, Огава і RO, визначення чутливості до діагностичних монофагів належність до біохімічної групи Хейберга. Культури, які аглютинуються не менше ніж до 1/2 титра сироватками 01 і однією із варіантоспецифічних сироваток, відносяться до V.cholerae 01 серовара Огава або Інаба. Культури, які аглютинуються сироватками обох сероварів не менше 1/2 титра, відносять до серовару Гікошима.

Для підтвердження виділеної культури холерних вібріонів до 0139 серогрупи досить позитивного результату в слайд-аглютинації з відповідною сироваткою.

4.3.7.2. При проведенні масових досліджень у вогнищі захворювання холерою, коли перші культури холерних вібріонів вже були ідентифіковані, позитивні результати тестування в слайд-аглютинації з холерними сироватками 01 або 0139 серогруп у поєднанні з морфологією і рухомістю клітин культур, виділених від хворих діареями або при обслідуванні на вібріоносійство, слід вважати остаточними для вирішення питання про проведення протиепідемічних заходів.

Виділені культури передають для повної ідентифікації у визначену для цієї мети групу або лабораторію, фахівці якої при необхідності вносять у відповідь потрібні корективи і доповнення.

4.3.7.3. Повна ідентифікація культур, які аглютинуються холерними сироватками 01 серогрупи, передбачає вивчення їх по додаткових тестах, що визначають належність до біоварів (гемаглютинація, чутливість до поліміксину, реакція Фогес-Проскауера та ін.).

4.3.7.4. У культур холерних вібріонів, які чутливі до монофагу ельтор, вивчають їх відношення до холерних діагностичних фагів - ХДФ 3,4,5.

4.3.7.6. Визначення вірулентності культур холерних вібріонів 01 комплексним методом проводять у відповідності з настановою до препаратів ХДФ.

4.3.7.8. Культури V.cholerae 01, RO і 0139 серогруп вивчають по гемолітичній активності в пробі Грейга і чутливості до антибіотиків, які використовуються в клінічній практиці для лікування холери.

4.3.7.7. На культури, що мають характерні для вібріонів морфологічні і культуральні ознаки, які відносяться до 1 групи по Хейбергу, що аглютинуються 01, RO і однією з варіантоспецифічних сироваток не менше ніж до 1/2 титру, які лізуються і не лізуються холерними і ельтор фагами, а також на культури, що аглютинуються сироваткою 0139, видають остаточну відповідь. указавши чутливість до антибіотиків і гемолітичну активність.

Позначення: () в дужках вказані варіанти, які рідко зустрічаються.

Умовні позначення: х - немає даних; + позитивний результат в 90 %; - негативний результат в 90 %; + - позитивний і негативний результати зустрічаються з однаковою частотою; +(-) або -(+) в дужках рідко спостережений результат.

Позначення: див. позначення до табл. 6.

Токсигенні штами холерних вібріонів 01 і 0139 серогруп, як правило, не лізують еритроцити барана.

Для холерних вібріонів 01 серогрупи, крім того, вказують біовар на основі чутливості до одного з діагностичних фагів (ельтор або класичного) і/або по допоміжних ознаках для фагорезистентних культур.

4.3.7.8. Для повної характеристики культур холерних вібріонів 01 в спеціалізованих лабораторіях, які забезпечені необхідними індикаторними штамами холерних вібріонів і набором типуючих холерних фагів, визначають фаговар.

4.3.7.9. Вивчення культур холерних вібріонів 01 і 0139 серогруп на токсигенність

методом молекулярного зондування або в полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) на наявність гену холерного токсину (vct-гену) і на експериментальних тваринах проводять в спеціалізованих лабораторіях.

4.3.7.10. Культури, які мають ознаки вібріонів по морфології колоній і клітин, тесту на індофенолоксидазу і ферментативній активності на полівуглеводному середовищі, які не аглютинуються на склі холерними сироватками 01, RO і 0139 серогруп, виділених від хворих гострими кишковими інфекціями, диференціюють по тестах, які визначають належність до роду Vibrio і виду V. cholerae. Культури, які належать до V. cholerae вивчають в пробі з діагностичними фагами. При виділенні чутливих до холерних діагностичних монофагів, які не аглютинуються холерними сироватками 01, особливе значення має вивчення їх клітинного складу, тому що в популяції таких штамів можуть знаходитись типові холерні вібріони 01 групи.

Якщо культура по сукупності ознак належить до виду холерних вібріонів, її вивчають в реакції аглютинації з набором вібріонних діагностичних сироваток 02-083, що випускає інститут "Мікроб" (Росія).

На культури, що аглютинуються однією з вібріонних сироваток, видають відповідь про виділення V. cholerae 02 . . 05 або іншої серогрупи. Якщо культури не типуються відомими вібріонними сироватками або вони відсутні в лабораторії, то виділену культуру позначають узагальнено - V. cholerae non 01 (так звані НАГ- вібріони).

Штами V. cholerae non 01, крім того, типують набором фагів ТЕПВ і визначають їх чутливість до антибіотиків.

4.3.7.11. При виділенні із навколишнього середовища вібріонів, що не аглютинуються холерними 01, RO і 0139 сироватками, доцільність повної таксономічної характеристики визначається індивідуально для конкретних територій і об'єктів з врахуванням частоти аналогічних варіантів і епідситуації по холері.

4.3.8. Ідентифікація атипових культур холерних вібріонів.

4.3.8.1. До атипових відносять культури холерних вібріонів, що відхиляються по окремих ознаках, які визначають належність до відповідної таксономічної категорії. Це різні антигенні варіанти (з ослабленою або втраченою аглютинабельністю сироватками 01, Інаба, Огава), і R-варіанти, що аглютинуються відповідними сироватками при наявності зниження або відсутності аглютинабельності сироватками 01 серогрупи. В останні роки і серед епідемічних і неепідемічних штамів помітно зросла частота кількості холерних вібріонів, резистентних до холерних діагностичних фагів. В той же час зустрічаються штами, що слабо аглютинуються сироваткою 01 проти зберігшими чутливість до холерних діагностичних фагів.

Антигенна варіабельність нерідко поєднана з мінливістю по тим або іншим культурально-морфологічним, біохімічним ознакам і чутливістю до фагів.

Деякі труднощі для ідентифікації мають штами холерних вібріонів, що змінені по культурально-морфологічним ознакам, які утворюють шорсткуваті, мутні, пігментовані карликові колонії. В мазках, що зроблені з таких культур, виявляються подовжені, спіралевидні, кульовидні клітини. Нерідко зустрічаються штами, які змінені по біохімічним властивостям, у яких відмічається послаблення або втрата можливості розкладати вуглеводи і багатоатомні спирти (мапіт, манозу, сахарозу, крохмаль), амінокислоти (лізин, орнітин, трипто.фан) та ін. субстрати.

4.3.8.2. У всіх випадках ізоляції атипових культур обов'язкове вивчення їх по ряду додаткових ознак, що визначають їх належність до роду Vibrio і виду холерних вібріонів (визначення декарбоксилаз лізину, орнітину, дигідролази аргініну, оксидазної активності, типу розщеплення глюкози на середовищі Хью-Лейфсона та ін.).

4.3.8.3. Культури холерних вібріонів, що мають вказані вище ознаки роду Vibrio і виду cholerae і які аглютинуються сироватками 01 до 1/4 титру, лізуються діагностичними монофагами в діагностичному титрі, належить підносити до серовару 01.

4.3.8.4. Вищезазначені та інші атипові варіанти культур холерних вібріонів необхідно направляти для подальшого вивчення в спеціалізовані лабораторії.

4.3.8.5. Для підтвердження належності до V. cholerae 01 культур, які слабо аглютинуються, дисоциюють та фагорезистенті, необхідно обов'язково використовувати високочутливі серологічні методи (імунофлюоресцентний, специфічної імобілізації вібріонів, РНГА, імунопреципітації в гелі, ПЛР з специфічними праймерами та ін.).

При вивченні культур, атипових за тестами серологічної ідентифікації рекомендуються, крім того, використовувати реакції перехресної адсорбції аглютининів по Кастеляні, реакції аглютинації з культурами убитими кип'ятінням, імунофлюоресценції з відповідними імуноглобуліновими препаратами та пробу з комплементами.

4.3.8.6. Для культур холерних вібріонів, що аглютинуються тільки RO сироваткою, обов'язково додаткове підтвердження специфічності їх взаємодії в реакції імобілізації вібріонів або преципітації в гелі.

4.3.8.7. Для серологічної ідентифікації культур, що аглютинуються спонтанно, застосовуються РНГА, імунопреципітацію або реакцію глютинації з використанням осадженої культури і 0,3 % розчину хлористого натрію для розведення діагностичних сироваток і приготування суспензії вивчаємої культури.

4.3.9. Прискорена ідентифікація культур.

Окрему колонію або чисту культуру висівають в 3 мл поживного бульону і після 3 годин інкубації вивчають за тестами:

- аглютинабельності О-холерними діагностичними сироватками в 1 % пептонній воді;

- чутливості до холерних діагностичних бактеріофагів;

- належності до біохімічної групи (по Хейбергу); при використанні відповідних диференціальних середовищ Гісса в об'ємі 1 мл через 3-6 годин інкубації при (37+/-0,5 град. C) проводять облік результатів.

4.4. Порядок проведення обліку аналізів, оформлення і видача результатів.

4.4.1. Відповідь про позитивний результат може бути попередньою та остаточною.

4.4.2. Попередню позитивну відповідь видають по результатах прискореного дослідження нативного матеріалу і після підрощування його в пептонній воді за допомогою імунофлюоресцентного методу, специфічної імобілізації, РНГА, а також по слайд-аглютинації сироватками 01 і 0139 підозрілих на холерний вібріон колоній.

4.4.3. Остаточну позитивну відповідь видають по результатах повної, скороченої або прискореної ідентифікації виділеної культури через 18-72 годин (при цілодобовій роботі лабораторії).

4.4.4. Негативна відповідь може бути видана тільки по закінченню досліджень по повній схемі через 36-48 годин. В умовах однозмінної роботи лабораторії, при використанні консервантів, тривалість аналізу збільшується до 3-5 діб.

Забороняється давати відповіді при негативних результатах прискореного дослідження (імунолюмінсцентного, РНГА та ін.) до закінчення аналізу.

4.4.5. При здійсненні епідемічного нагляду направлення на аналіз, а відповідно і відповідь на нього оформлюють індивідуально на кожного хворого. При обстеженні здорових людей на вібріононосійство і дослідженні на холеру об'єктів навколишнього середовища групові форми направлення і відповідей допускаються як при епіднагляді, так і у вогнищі холери.

4.4.6. При проведенні великого об'єму досліджень на холеру хворих гострими кишковими захворюваннями у вогнищі направлення на аналізи і відповіді на них оформлюють списком.

4.4.7. Облік аналізів і культур проводять за встановленими формами (додатки 9-12). Обов'язковим є ведення робочих записів дослідження підозрілих культур. При роботі у вогнищі холери використовують спрощені форми реєстрації аналізів, враховуючи, що більш докладні свідчення є в бланках направлень, що знаходяться в лабораторії до ліквідації вогнища. Для зручності роботи направлення за кожний день підшивають окремо.

4.5. Методи прискореної діагностики.

При дослідженні матеріалу від хворих з підозрою на холеру, від осіб, які померли від гострих кишкових захворювань, нарівні з класичними методами використовуються прискорені методи діагностики.

4.5.1. Люмінісцентно-серологічний метод.

Метод дає можливість виявити збудника холери в S-формі при наявності його в досліджуваному матеріалі не менш ніж 10^5 м.кл. в 1 мл (дослідженню підлягає нативний матеріал - випорожнення і блювотні маси, а також матеріал після підрощування).

Порядок приготування мазків, їх люмінісцентне офарблення, мікроскопія та оцінка результатів є загальними для всіх бактерій, які описані в "Наставленні по використанню сироватки діагностичної холерної люмінісцентної".

Позитивний результат може бути отримано через 1,5-2 години від початку дослідження.

Для знищення неспецифічного свічення слід використовувати як "гасник" бичий альбумін, що мічений родаміном. Методика його застосування описана в "Наставленні по використанню сухого альбуміну, міченого родаміном".

4.5.2. Метод імобілізації вібріонів під впливом специфічної холерної 01 сироватки.

Метод дає можливість знайти збудника напротязі декількох хвилин при концентрації його в досліджуваному матеріалі не менше ніж 10^5 м.кл. в 1 мл. На предметне скло піпеткою або петлею наносять 2 краплини випорожнень, блювотних мас або верхнього шару I чи II пептонної води.

Першу краплю накривають покровним склом (контроль), до другої додають краплю холерної 01 сироватки в розведенні 1:100, перемішують і також накривають покровним склом. Роздавлену краплю дивляться під мікроскопом при збільшенні 400-600х, використовуючи фазово-контрасний пристрій чи конденсор темного поля.

При наявності в досліджуваному зразку холерних вібріонів в першій краплі спостерігають характерний рух, в другій спостерігається імобілізація окремих мікробних клітин і утворення мікроаглютинатів негайно або протягом 1-2 хвилин. У разі неспецифічної взаємодії з діагностичними сироватками спостерігається утворення дрібних рухомих конгломератів при активній рухомості окремих клітин.

Реакція імобілізації специфічна і дозволяє дати першу сигнальну відповідь через 15-20 хвилин від початку дослідження. При негативному результаті дослідження повторюють після підрощування в 1 % пептонній воді.

4.5.3. Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) з використанням холерного імуноглобулінового еритроцитарного діагностикуму. Порядок підготовки матеріалу, інгредієнтів постановки реакції та її облік викладені в "Настановленні по застосуванню діагностикуму холерного еритроцитарного антитільного", що додається до препарату.

4.6. Методи вивчення властивостей холерних вібріонів.

Можуть вживатися як макро, так і мікротести.

4.6.1. Серологічні властивості вивчають в слайд-аглютинації або розгорнутій реакції аглютинації з холерними сироватками 01, Інаба, Огава і RO, а також з сироваткою 0139 серогрупи.

4.6.1.1. Слайд-аглютинацію ставлять на знежиреному склі, в чашці Петрі, використовуючи підозрілу на холерний вібріон колонію і/або агарову 12-18 годинну культуру і сироватки 01 серогрупи в розведенні 1:50 - 1:100. Сироватку 0139 розводять відповідно даних на етикетці. Реакцію обов'язково супроводжують контролями культури в фізіологічному розчині.

4.6.1.2. Розгорнуту реакцію аглютинації ставлять і враховують за загальноприйнятою методикою відповідно з наставленням до діагностичної сироватки.

4.6.1.3. Розгорнута реакція аглютинації в 0,3 % NaCl з осадженою культурою.

Діагностичні сироватки двократно розводять 0,3 % розтином натрію хлориду в об'ємі 0,5 мл відповідно величині діагностичного титру. Суспензію вивчаємої культури готують в тому ж розчині з концентрацією більше 1 млрд/мл в об'ємі 8-10 мл, витримують при кімнатній температурі на протязі 1-1,5 годин. В реакції використовують поверхневий шар мікробної суспензії, розведеної 0,3 % розчином натрію хлориду до концентрації 1 млрд/мл, додають її по 0,5 мл у всі розведення сироватки і контроль культури (0,5 мл 0,3 % розчину натрію хлориду + 0,5 мл мікробної суспензії). Облік і оцінка результатів аналогічні основному варіанту розгорнутої реакції. Використання 0,3 % розчину натрію хлориду дає можливість виключити спонтанну аглютинацію.

4.6.1.4. До методів експресної серологічної ідентифікації належать: мікроаглютинація та імобілізація за допомогою холерних вібріонів, люмінісцентно-серологічний, РНГА та ін.

4.6.2. Біохімічні властивості.

4.6.2.1. Визначення індофенолоксидази. Реактиви :

- двокомпонентний: - 1 % водний розчин пара- амінодиметиланіліну (гідрохлориду чи оксалату) і 1 % спиртовий розчин альфа-нафтолу;

- однокомпонентні: - 1 % водні розчини диметил-пара- фенілендіаміну, тетраметил-пара-фенілендіаміну (гідрохлориду) чи етилокси-парафенілендіаміну сірчанокислого (з набору для обробки паперу "фотоколір").

Реактиви повинні бути безколірними, їх необхідно зберігати у флаконі з темно-коричневого скла із скляною пробкою без доступу світла, в холодильнику. В разі зберігання реактиву у флаконі світлого кольору їх належить обгорнути алюмінієвою фольгою або темним папером.

Постановка проби:

а) на поверхню 18-годинної агарової культури, підозрілої колонії або напівзливного росту на чашку наносять 1 краплю 1 % спиртового розчину параамінодиметиланіліну (гідрохлориду чи оксалату) і 1 краплю 1 % водного розчину альфа-нафтолу.

Позитивна реакція на індофенолоксидазу - яскраво синє забарвлення культури через 1-2 хвилини

При використанні однокомпонентних реактивів цим же методом в позитивних випадках - червоне забарвлення культури.

б) для постановки проби на оксидазу можна використовувати спеціальні реактивні папірці З набору СІП або смужки фільтрувального паперу, змоченого 2-3 краплями 1 % водного розчину диметил-пара-фенілендіаміну. Культуру наносять на смужку паперу, змочену реактивом платиновою петлею (але не хромонікелевою), скляною або дерев'яною паличкою і розмазують у вигляді невеликої плями. Через 10-30 секунд з'являється пурпурово-червоне або синє (в залежності від реактиву) забарвлення, що свідчить про позитивну реакцію. Із грамнегативних бактерій позитивну пробу на індофенолоксидазу дають Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Plesiomonas, а негативну - всі Enterobacteriaceae.

Враховуючи можливу нестійкість реактивів і різну здатність вібріонів утворювати оксидазу на різних поживних середовищах, пробу обов'язково супроводжують позитивними та негативними контролями відповідно з культурами Vibrio або Pseudomonas і Enterobacteriaceae, які вирощені на поживному агарі, що використовується в лабораторії.

4.6.2.2. При відсутності реактивів на оксидазу можна використовувати пробу "тяжа". На чашку Петрі наносять краплю 0,5 % водного розчину дезоксихолату натрію або 2,5 % розчину миючого засобу "Прогрес" і суспензують 18-годинну агарову культуру досліджуваного штаму. При позитивній реакції суспензія негайно втрачає мутність, стає слизистою і в'язкою - тягнеться за петлею, що характерно для вібріонів.

Проба дозволяв диференціювати вібріони не тільки від enterobacteriaceae, але і від інших родинних грамнегативних мікроорганізмів, які не утворюють, "тяжа". Виключення складають лише деякі штами Aeromonas, які на протязі приблизно 60 секунд утворюють нитку, яка слабо тягнеться.

4.6.2.3. Визначення типу розкладання глюкози (тест Хью-Лейфсона). В дві пробірки з середовищем Хью-Лейфсона засівають уколом в стовпчик культуру, що вивчають. Поверхню середовища в одній з пробірок заливають 0,5-1 мл стерильного вазелінового масла. Посіви інкубують при температурі (37,0+/-0,5 град. C) 1-4 дні. Окислення визначають по жовтому забарвленню середовища тільки в аеробних, ферментацію - в аеробних та анаеробних умовах росту. Вібріони розкладають глюкозу по ферментативному типу.

4.6.2.4. Визначення декарбоксилазної активності проводять на спеціальних середовищах. В пробірки з середовищами - лізином, орнітином, аргініном засівають по повній петлі 18-годинної культури і заливають 0,5-1 мл стерильного вазелінового масла, включаючи контролі середовищ. Інкубують посіви при (37,0+/-0,5 град. C). Облік результатів проводять щоденно, при негативному результаті спостерігають - 1-4 доби. В результаті ферментації глюкози спочатку відбувається зрушення pH в кислу сторону, а в подальшому при декарбоксилуванні амінокислот нагромаджуються аміни і відбувається залуження середовища.

4.6.2.5. Ферментацію вуглеводів і багатоатомних спиртів (глюкози, лактози, манози, сахарози, арабінози, маніту, саліцину, дульциту, інозиту, крохмалю та інш.) визначають в рідких або напіврідких середовищах Гісса з індикатором бромтимоловим синім, Андреде, ВР. Культуру, що вивчають, вирощують на протязі 12-20 годин на твердому, або 3-4 години на рідкому поживному середовищі. Посіви на середовищах з вуглеводами і спиртами інкубують при 37 град. C і ведуть облік через 6-18 годин.

4.6.2.6. Визначення діастатичної активності. Культуру засівають в середовище з крохмальом і індикатором Андреде, інкубують 12-18 годин при 37 град. C. При розщепленні крохмалю середовище червоніє.

4.6.2.7. Визначення протеолітичних властивостей. В стовпчик желатини уколом засівають 18-годинну культуру і інкубують на протязі 2-3 діб при температурі (22+/-0,5 град. C) або (37+/-0,5 град. C) на протязі 18 годин. Перед обліком результатів пробірки ставлять в холодильник на 20 хвилин. При позитивному результаті желатина залишається рідкою, а при негативному (і в контрольній пробірці) - затвердіває.

4.6.2.8. Визначення утворювання індолу. Холерні вібріони володіють ферментом триптофаназою і при вирощуванні в середовищах, які містять триптофан (пептонна вода, м'ясо-пептонний бульйон, бульйон Хоттингера та інші), розщіплюють його з утворенням індолу, що виявляється за допомогою індикаторних папірців (розділ 6.3.4.) або реактиву Ерліха.

4.6.2.9. Визначення утворення сірководню. Холерні вібріони не утворюють ферменту тіосульфатредуктази, так як не здатні розщіплювати неорганічні сіркоутримуючі сполучення, які є в середовищі Кліглера - це є диференційною ознакою. Однак вони, також як деякі інші ентеробактерії, виробляють фермент цистиндесульфогідролазу, за рахунок якого здатні утворювати сірководень із сіркоутримуючих амінокислот, що є в достатній кількості в бульйоні Хоттингера, Мартена та деяких інших середовищах.

4.6.2.10. Визначення здатності фосфоресцирувати. Штами, які вивчають, засівають в 1 % пептонну воду або на пластинки лужного агару, інкубують при температурі (37+/-0,5 град. C) на протязі 12 годин. Культури, які виросли, переглядають в темній кімнаті. Світіння спостерігають після 5-10 хвилинної адаптації в темноті.

4.6.2.11. Для визначення оксидази, уреази, індолутворення, декарбоксилаз лізину, орнітину, дигідролази аргініну, ферментації вуглеводів і багатоатомних спиртів при ідентифікації вібріонів також можна використовувати Систему індикаторну паперову (СІП) або інші мікротестсистеми.

4.6.3. Визначення чутливості до діагностичних фагів. В лабораторній діагностиці холери використовують бактеріофаги С і ельтор. При оцінці результатів проб з фагами необхідно орієнтуватися на діагностичний робочий титр (ДРТ), який звичайно позначають на етикетках. Визначення чутливості до фагів проводять цільними препаратами, а також з їх 10-кратними розведеннями до ДРТ в м'ясо-пептонному бульйоні.

4.6.3.1. Для постановки реакції в чашки розливають лучний агар. Після, застигання агару і підсушування його на протязі 30 хвилин при 37 град. C дно чашок розподіляють на квадрати по кількості зразків фагів та їх 10-кратних розведень. В пробірку з 5 мл 0,5-0,7 % лужного агару, розплавленого і охолодженого до 45 град. C, додають 0,1-0,2 мл 3-4 годинної бульйонної культури, ретельно перемішують і виливають на поверхню агару. Чашки залишають при кімнатній температурі з напіввідкритими кришками на 30 хвилин. В центр квадратів наносять штампом-реплікатором, стандартною петлею або тонко відтянутою пастерівською піпеткою по краплі фагів в відповідних розведеннях. Після підсихання крапель чашка перевертають догори дном і ставлять в термостат при температурі (37+/-0,5 град. C). Результати враховують через 2-4 і 18-20 годин. Наявність лізису у вигляді однієї "стерильної" плями або групи дрібних негативних колоній оцінюється як позитивний результат.

4.6.4. Допоміжні тести диференціації біоварів V.cholerae 01 серогрупи.

4.6.4.1. Визначення чутливості до поліміксину. В розплавлений і охолоджений до 45-50 град. C поживний агар (pH 7,1+/-0,1) додають поліміксин М або В з розрахунку 30 одиниць на 1 мл середовища. Після ретельного змішування середовище розливають в чашки Петрі. На застиглі агарові пластинки наносять звичайною бактеріологічною петлею 18-ти або 3-годинну бульйонну культуру. Результати враховують після інкубації посівів при (37+/-0,5 град. C) на протязі 18 годин. Холерні вібріони біовару cholerae не ростуть на поліміксиновому агарі, біовару eltor- по-різному.

4.6.4.2. Постановка реакції гемаглютинації. На предметне скло в чашку Петрі наносять краплю фізіологічного розчину і суспензують в ній петлею 18-годинну агарову культуру. Потім додають краплю 2,5 % суспензії курячих еритроцитів, тричі відмитих фізіологічним розчином. Скло коливають до змішування суспензії еритроцитів та вібріонів. При позитивній реакції на протязі 1 хвилини наступає склеювання еритроцитів. Реакцію супроводжують двома контролями: а) в краплю фізіологічного розчину додають краплю 2,5 % суспензії еритроцитів; б) в краплі фізіологічного розчину суспензують культуру, яку досліджують. Контролі повинні бути негативними.

4.6.4.3. Постановка реакції Фогес-Проскауера (на ацетилметилкарбінол). Досліджувану культуру сіють в глюкозо-фосфатний бульйон Кларка і інкубують при (37+/-0,5 град. C) на протязі 1-3 діб. Потім до 1 мл культури додають 0,6 мл 6 % спиртового розчину альфа-нафтолу і 0,4 мл 40 % розчину їдкого калію. Пробірки зтрушують і ставлять в термостат на 1 годину. При позитивній реакції середовище забарвлюється в рожевий або яскраво-червоний колір.

4.6.5. Оцінка вірулентності холерних вібріонів.

4.6.5.1. Визначення вірулентності холерних вібріонів ельтор по фаговому тесту і гемолітичній активності проводиться відповідно з наставленням, яке прикладається до препаратів діагностичних ХДФ-фагів.

Для постановки проби з фагом використовують 1,5-2,0 % лужний агар pH 7,4+/-0,2, виготовлений на будь-якій основі. Агар розливають в чашки Петрі і підсушують при кімнатній температурі. В пробірку з 4 мл 0,7 % лужного агару, розплавленого на водяній бані і охолодженого до 45 град. C, додають 0,2-0,3 мл 3- 4 годинної бульйонної культури досліджуваного штаму, ретельно імітують і виливають на поверхню агарових пластин Після застигання напіврідкого агару чашки знову підсушують з напіввідкритою кришкою при кімнатній температурі, готують 10-кратне розведення фагів ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5 до ДРТ, вказаного для кожного з них. Петлею або штампом-реплікатором наносять фаги з усіх розведень на поверхню напіврідкого агару. Після підсихання крапель фагів на поверхні агару, чашки закривають, перевертають догори дном і інкубують при температурі (37+/-0,5 град. C) 16-18 годин, в термінових випадках результати враховуються через 3-4 години. Оцінку результатів проводять по чотирибальній системі: 4 - повний лізис; 3 - численні негативні плями, 2 - пляма лізису із значним вторинним ростом або ізольовані негативні колонії. Позитивним вважають лізис культури на 4 та 3 "+" фагом в ДРТ.

4.6.5.2. Визначення гемолітичної активності (по Грейгу).

До 1 мл добової культури, вирощеної в 4-5 мл м'ясо-пептонного бульйону або серцево-мозкового інфузу, додають 1 мл 1 % суспензії тричі відмитих еритроцитів барана в фізіологічному розчині. Суміш мікробів та еритроцитів змішують і ставлять на 2 години в термостат при температурі (37+/-0,5 град. C), а потім в холодильник до наступного дня. Попередній результат враховують через 2 години, остаточний - наступного дня. При позитивній реакції настає повний або частковий лізис еритроцитів (лакова кров). В контролі (бульйон 1 мл + 1 мл суспензії еритроцитів) гемоліз відсутній. Вірулентність культури визначають по сукупності ознаків, вказаних в наставленні до препаратів фагів ХДФ.

4.6.5.3. Визначення вірулентності холерних вібріонів на моделі кроликів сисунців.

Дослідження можуть проводити лабораторії, які мають дозвіл на експериментальну роботу із збудниками I-II груп патогенності.

Внутрішньокишково заражені кролики сисунці є найбільш чутливою моделлю експериментальної холери.

Для зараження тварин використовують 4-годинну агарову культуру, вирощену при температурі (37+/-0,5 град. C), або 18-годинну - при температурі 20+2 град. C Необхідно використовувати дві заражаючі дози 1.10^5 та 1.10^7 м.кл., які вводять внутрішньокишково в об'ємі 0,2 мл двом кроликам. Кроликів, яким 10-12 днів, вагою 130-160 г, фіксують до станка черевом догори, вистригають шерсть на операційному полі і змазують шкіру йодом. Дають ефірний або тіопенталовий наркоз (0,2 мл 1 % розчину на 100 г ваги в/м), накривають стерильною серветкою з розрізом посередині. Після засипання тварин роблять розріз довжиною 1 см по середній лінії живота до рівня пупка.

Через невеликий розріз черевної стінки витягують петлю тонкого кишечника на довгій оточині, фіксують за допомогою м'якого пінцету і вводять суспензію вібріонів.

Петлю занурюють в черевну порожнину, черевну стінку і шкіру пошарово зашивають. Шов змазують йодом. Кроленят, яких оперували, годують за допомогою шприців молоком і спостерігають 48 годин. Всіх загиблих і забитих через 48 годин тварин розтинають.

Найбільш виражені зміни спостерігаються в товстому кишечнику, що розтягнений безколірною або світло-жовтою прозорою чи трохи опалесцируючою рідиною. Сліпа кишка і прилеглі відділи товстого кишечника можуть бути настільки розтягнуті, що через них видно підлежачі петлі кишечника, що створює видимість повної прозорості вмісту кишечника. Тонкий кишечник розширений і також має напівпрозорий вміст. Можлива ін'єкція судин оточини. Описані зміни характерні для "синдрому холерогенності" , що спостерігаються при зараженні епідемічно небезпечними штамами, які мають ген холерного токсину.

Вірулентні штами викликають смерть більшості заражених тварин дозами 10^5-10^7 м.кл. на протязі перших двох діб з типовим "синдромом холерогенності".

Слабовірулентні вібріони викликають смерть поодиноких тварин, заражених дозами 10^5-10^7 м.кл. Вміст кишечника мутний, іноді жовтого, коричневого або зеленкуватого кольору.

Авірулентні штами не викликають захворювання, смерть кроленят і макроскопічних змін в кишечнику.

Вірулентні штами виділяються переважно від хворих і носіїв холери, а також з об'єктів навколишнього середовища у вогнищах холери.

Слабо- і авірулентні штами ізолюють головним чином з об'єктів навколишнього середовища і інколи від людей при поодиноких випадках захворювань або вібріононосійства.

Обов'язковій перевірці вірулентності на моделі кроликів-сосунків, підлягають такі штами V. cholerae 01 серогрупи:

а) Виділені від людей:

- гемолізпозитивні штами холерних вібріонів;

- гемолізнегатівні штами холерних вібріонів, атипові по серологічних ознаках і по відношенню до бактеріофагів.

б) Виділені з об'єктів навколишнього середовища:

- гемолізнегативні, вірулентні по фаговому тесту штами холерних вібріонів, виділені при відсутності епідускладнень по холері;

- гемолізнегативні, типові по серологічним властивостям, чутливі до діагностичного фагу ельтор, але слабовірулентні по комплексному методу.

Обов'язковій перевірці вірулентності на моделі кроликів-сосунків підлягають також всі штами холерних вібріонів 0130 серогрупи, виділені від людей та із об'єктів навколишнього середовища.

4.6.5.4. Оцінка холерних вібріонів на наявність гену холерного токсину з метою визначення епідвагомості виділених штамів проводиться методом молекулярного зондування за допомогою ДНК-зонду.

Для одержання відбитків 3-6 годинну культуру холерних вібріонів, що виросла при температурі (37+/-0,5 град. C), наносять бактеріологічною петлею або штампом-реплікатором на поверхню лужного агару і ставлять в термостат при температурі (37+/-0,5 град. C) на 18-24 години для отримання колоній 2-3 мм в діаметрі.

Нітроцелюльозний фільтр (Hybond C або Schlericher a. SchuelGermany) накладають на поверхню агару з колоніями, через 1 хв. (після промокання фільтру) знімають і кладуть відбитками колоній догори на фільтрувальний папір, змочений 0,5 N NaOH, через 5 хв. перекладають на новий папір, змочений тим же розчином, і витримують ще 5 хв. При цьому відбувається лізис клітин (на вигляд - колонії приймають вид крапель слизу) та денатурація ДНК.

Фільтр переносять на фільтрувальний папір, змочений нейтралізуючим буфером 1. Процедуру повторюють 3-4 рази з інтервалом до 5 хв., кожного разу використовують свіжий папір, змочений тим же буфером. Фільтр підсушують на повітрі, на сухому аркуші фільтрувального паперу, на протязі 5-10 хв. і промивають 2-3 рази по 10 хв. при кімнатній температурі в 20-30 мл нейтралізуючого буферу 2. Фільтр спершу кладуть колоніями догори на поверхню розчину і через 1-2 хв. занурюють в нього.

Фільтр висушують на повітрі і прогрівають при температурі 80+/-0,5 град. C на протязі 1,5-2 години для фіксації денатурованої ДНК. Оброблений таким чином фільтр кладуть між двома аркушами фільтрувального паперу в поліетиленовий пакет, герметично запаюють і пересилають в щільній упаковці (бажано картонній) в заклади, які проводять ці дослідження.

Приготування буферних розчинів

Нейтралізуючий буфер 1 (0,2 M трис-HCl, pH 7,5+/-0,1 + 1M NaCl):