Про удосконалення лікування хворих на ВІЛ-інфекцію та СНІД

Резистентним вважається штам, у якого чутливість до АРВ препаратів знижена в 4 рази в порівнянні з диким штамом ВІЛ.

Методи визначення резистентності

Генотипові тести: аналіз генотипу виявляє мутації, що пов'язані з фенотиповою стійкістю (резистентністю). Генотиповий тест засновано на аналізі мутацій у генах, які кодують ферменти вірусу: зворотну транскриптазу і протеазу. Такі тести значно відрізняються від фенотипових по вартості, кількості мутацій, що виявляються, простоті і точності результатів.

Переваги тесту:

- значно дешевший за фенотиповий;

- можливість отримання результатів достатньо швидко (через 1-2 тижні);

- дозволяє виявляти мутації до того, як вони призведуть до фенотипової резистентності.

Недоліки тесту:

- виявляє стійкість тільки домінантних штамів (>20%);

- потребує певної кваліфікації інтерпретація результатів (трактування результату дослідження засноване на знанні генотипів, мутацій, і оцінки імовірності виникнення перехресної резистентності до інших препаратів тієї ж групи);

- якість аналізу залежить від кваліфікації фахівця, який проводить аналіз;

- може суперечити фенотипу;

- потребує високого вірусного навантаження (не менш 1000 копій РНК/мл).

Фенотипові тести: фенотиповий аналіз виявляє спроможність ВІЛ до реплікації при різних концентраціях препаратів, що тестуються. Тест вимірює чутливість до окремих препаратів, але не до їх комбінацій. Реплікацію ВІЛ враховують при різних концентраціях препарату, результат виражають в одиницях IC (inhibitory concentration) і порівнюють з еталонним штамом вірусу. Співвідношення величин IC еталонного штаму і вірусів, що тестувались, називають ступенем резистентності. Тест схожий з традиційними тестами in vitro на антимікробну чутливість.

Переваги тесту:

- дозволяє оцінити загальний ефект резистентності, у тому числі множинні мутації і мутаційні взаємодії;

- є простішим у виконанні, ніж генотиповий;

- інтерпретація тесту не потребує спеціальної кваліфікації дослідника і аналогічна аналізу на антимікробну чутливість.

Недоліки тесту:

- дорожчий у порівняні з генотиповим;

- результати отримують через 2-3 тижні;

- виявляє стійкість до окремих препаратів, але не до їх комбінацій;

- виявляє резистентність тільки у домінантних штамів (> 20%);

- вірусне навантаження повинно бути не менш 1000 копій РНК/мл.

Віртуальний фенотип: моделювання фенотипу штаму, який тестується, на основі аналізу генотипу. Паттерн мутацій тестованого штаму порівнюється з результатами фенотипового аналізу штамів, що демонструють аналогічні мутації.

Обмеження тестів на виявлення резистентності

1. Аналіз на стійкість, перш за все, визначає препарати, які необхідно уникати, і з меншою вірогідністю визначає препарати, які можуть бути активні.

2. Аналіз має проводитись в присутності антиретровірусного препарату, який викликає підозру на розвиток резистентності, оскільки перерва терапії призводить до швидкого розмноження натурального типу вірусу, який починає перебільшувати за чисельністю резистентні штами. Час між припиненням приймання ВААРТ і зміною резистентних штамів на натуральний вірус знаходиться в значних межах, від кількох днів до тижнів у випадку стійкості до 3ТС, від кількох тижнів до місяців у разі стійкості до інгібіторів протеази, і від кількох місяців до декількох років для деяких мутацій стійкості до ННІЗТ і аналогів тимідіну.

Загальна рекомендація - аналіз повинен проводитись, коли пацієнт знаходиться на терапії або в межах 2-3 тижнів після її відміни.

3. Викликає труднощі інтерпретація результатів у пацієнтів, які раніше приймали антиретровірусну терапію. Важливим фактором при виборі схеми лікування є попередня історія застосування препаратів.

4. Рівень вірусного навантаження має бути не менш 1000 копій РНК ВІЛ/мл.

5. Точність тестів залежить від кількості попередніх схем лікування, які застосовував пацієнт.

3.4. Діагностика ВІЛ-інфекції у дітей раннього віку

Наявність у дітей материнських антитіл до ВІЛ IgG не дозволяє встановити діагноз за методом ІФА в перші 18 місяців життя.

Для визначення наявності вірусу в організмі дитини, яка була народжена ВІЛ-інфікованою матір'ю, використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), спрямований на визначення провірусної ДНК або РНК ВІЛ.

Матеріал для дослідження: кров у кількості 5 мл.

Кров відбирається стерильно в спеціальні системи для забору крові (вакутайнери, моновети) з використанням ЕДТА як антикоагулянту. На пробірці позначають дату, час забору крові і ідентифікаційний код пацієнта.

Цільну кров зберігають при температурі +2-8 град. С не більш 6 годин. Для визначення провірусної ДНК проводять виділення фракції лімфоцитів центрифугуванням в градієнті щільності (фікол-верографін). Для визначення РНК отримують плазму, як було описано вище ( в розділі 3.2.).

Гепарин інгібує ПЛР, тому для забору крові його не використовують (як наслідок - результат реакції може бути хибно негативний).

Полімеразна ланцюгова реакція є надзвичайно чутливим і специфічним методом, який дозволяє виявляти геномні послідовності вірусної РНК або провірусної ДНК. Висока чутливість методу вимагає дотримання певних умов: обов'язково повинні бути три окремі приміщення, відмінна якість тест-систем, кваліфікований персонал.

Необхідне обладнання для проведення ПЛР:

- ампліфікатор;

- ламінарна шафа з вертикальним потоком повітря, II класу безпеки;

- бокс для ПЛР;

- лабораторна центрифуга до 3000 об./хв.;

- центрифуга до 14000 об./хв. для пробірок типу "Епендорф";

- мікроцентрифуги-вортекси (для перемішування реакційної суміші);

- автоматичні дозатори змінного об'єму 1-канальні:

0,5-10 мкл - 2 шт;

5-50 мкл - 3 шт;

50-200 мкл - 2 шт;

200-1000 мкл - 2 шт;

- штативи для автоматичних дозаторів, штативи для пробірок на 2,0 мл і 0,2 мл;

- пробірки на 2,0 та 1,5 мл поліпропіленові, конічні, з маркіровкою "оброблені проти РНК-аз та ДНК-аз";

- пробірки 0,2 мл;

- обладнання для проведення горизонтального електрофорезу (джерело живлення, камера для електрофорезу, трансілюмінатор, система відеодокументації);

- наконечники для автоматичних дозаторів з фільтрами, різного об'єму, оброблені проти РНК-аз;

- дезінфікуючі засоби;

- 70% етиловий спирт;

- ізопропіловий спирт;

- гумові рукавички;

Перший етап - виділення ДНК з лімфоцитів.

Другий етап - ампліфікація певного фрагмента провірусної ДНК (специфічне розмноження геномної послідовності вірусу).

Облік результатів (третій етап) - проводять методом горизонтального електрофорезу у 2% агарозному гелі.

У разі визначення РНК ВІЛ, дослідження проводять так, як було описано вище (в розділі 3.2).

Алгоритм тестування на наявність провірусної ДНК ВІЛ.

Перше обстеження на наявність провірусної ДНК ВІЛ методом ПЛР проводять в 1-2 місяця життя дитини:

- при отриманні негативного результату проводять друге визначення провірусної ДНК у віці 6 місяців;

- при отриманні позитивного результату проводять аналіз другого зразка крові в термін не пізніше 2 тижнів.

Друге обстеження на визначення провірусної ДНК ВІЛ, для підтвердження діагнозу, проводять в віці 6 місяців:

- при отриманні негативного результату - зняття з обліку;

- при отриманні позитивного результату - підтвердження діагнозу ВІЛ-інфекція.

Чутливість та специфічність ПЛР-аналізу для діагностики ВІЛ-інфекції у дітей перших місяців життя становить:

- до 4 тижнів життя - 93%;

- з 4 до 8 тижнів - 98%;

- після 4 місяців приблизно 100%.

При підозрі на антенатальне інфікування для своєчасного початку ВААРТ бажано перше тестування на наявність провірусної ДНК ВІЛ методом ПЛР проводити через 48 годин після народження (забороняється досліджувати пуповинну кров, оскільки вона може бути забруднена кров'ю матері).

У разі отримання негативного результату для остаточного встановлення діагнозу у двомісячному віці слід повторити аналіз на виявлення провірусної ДНК ВІЛ.

Отримання позитивного результату дозволяє встановити попередній діагноз ВІЛ-інфекції. Остаточний діагноз ВІЛ-інфекції встановлюється після отримання повторного позитивного результату ПЛР на наявність ДНК ВІЛ, який проводять при дослідженні другого зразка крові.

1. Наказ МОЗ України від 25.05.2000 р. N 120 "Про удосконалення організації медичної допомоги хворим на ВІЛ-інфекцію/СНІД".

2. А.Г.Рахманова. ВИЧ-инфекция, клиника, лечение. Санкт-Петербург. - 2000 г.

3. Е.И.Змушко, Е.С.Белозеров. ВИЧ-инфекция. Санкт-Петербург. - 2000 г.

4. Г.И.Козинец, В.В.Высоцкий, В.М.Негорелов, А.А.Еровигенков, В.А.Малов. Кровь и инфекция. М. Триада-фарм, 2001 г.

5. Навчальний посібник з лабораторної діагностики. ВІЛ-інфекції/СНІДу, навчально-методичний посібник для лікарів. Київ. - 1999 р.

6. А.Г.Рахманова, Е.Е.Воронин, Ю.А.Фомин. ВИЧ-инфекция у детей. Санкт-Петербург, - 2003 г.

7. А.Я.Лысенко, М.Х.Туроянов, М.В.Лавдовская, В.М.Подольский. ВИЧ-инфекция и СПИД - ассоциируемые заболевания. М. - 1996 г.

8. В.В.Покровский, Т.Н.Ермак, В.В.Беляева, О.Г.Юрин. ВИЧ-инфекция: клиника, диагностика и лечение. М. - 2000 г.

9. А.А.Мельник. Референтные значения лабораторных показателей у детей и взрослых. Киев. - 2000 г.

10. В.С.Камышников. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике, том. 1, 2. Минск. - 2000 г.

11. В.И.Покровский, О.К.Поздив. Медицинская микробиология. М. - 1999 г.

12. Ю.П. Финогеев, Ю.В.Лобзин, Ю.А.Виникмен, С.М.Захарченко, Ю.Н.Громыко, А.Н.Усков. Клинико-лабораторная диагностика инфекционных болезней. Санкт-Петербург. - 2001 г.

13. А.В.Литвинов. Нормы в медицинской практике (справочное пособие). Москва. - 2002 г.

14. Ю.В.Хмелевский, О.К.Усатенко. Основные биохимические контакты человека в норме и при патологии. Киев. - 1987 г.

15. Г.И.Назаренко, А.А.Кишкун. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. Москва. - 2002 г.

16. Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем. Москва: Медицинская литература. - 2003 г.

17. М.А.Базарнова. Руководство по клинической лабораторной диагностике, часть 1, 2. Киев. - 1982 г.

18. А.М. Базарнова, В.Т. Морозова. Руководство по клинической лабораторной диагностике, ч. 3, Клиническая биохимия. Киев. - 1990 г.

19. Н.М.Овчинников, В.Н.Беднова, В.В.Делекторский. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. Москва. - 1987 г.

20. И.И.Мавров. Конктактные инфекции, передающиеся половым путем. Киев. - 1999 г.

21. Иммунологические методы. Перевод с немецкого А.П.Тарасова. Москва. - 1987 г.

22. З.С.Баркогон. Геморагические заболевания и синдромы. Москва. - 1988 г.

23. В.В.Меншиков. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. Москва. - 1987 г.

24. А.В.Шабров и соавт. Профилактика и лечение оппортунистических инфекций, кандидозов и гельминтозов. Книга 1. Санкт-Петербург-Москва, - 2002 г.

25. Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов. Методические рекомендации. Министерство обороны Российской Федерации, Главное военно-медицинское управление. Москва. - 2002 г.

26. В.М.Бондаренко, Н.М.Грачева, Т.В.Мацулевич. Дисбактериозы кишечника у взрослых. Москва. - 2003 г.

27. Т.Я.Свищева. Атлас клеток крови и паразитов человека. Москва-Санкт-Петербург. - 2002 г.

28. В.В.Меншиков. Клиническая лабораторная аналитика. Москва. - 2002 г.

29. Увеличение масштабов применения антиретровирусной терапии в условиях ограниченных ресурсов: Руководство по применению методов общественного здравоохранения. ВОЗ, - апрель 2002 г.

30. John G.Bartlett, Joel E.Gallant. Medical Management of HIV-infection. - 2003. - p. 430.

31. Clinical Management of the HIV-infected Adult. A manual for midlevel clinicians. Originally published September 1993, revised March 2003

32. Guidelines for Performing Single-Platform Absolute CD4+ T-Cell Determinations with CD 45 Gating for Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus. Recommendation and Reports: January 31, 2003

33. Пособие по разработке протоколов лечения ВИЧ-инфекции для Украины и других стран Содружества Независимых Государств, штаб-квартира ВОЗ, 5-6 мая 2003 г.

Хоч кількісні методи визначення ВН у крові дозволяють найточніше оцінювати ефективність проведеного лікування і визначати момент, коли воно стає неефективним, їхнє систематичне застосування в хворих, що приймають антиретровірусні препарати, у початкову програму розширення масштабів застосування АРТ в Україні включено не було. Надалі, при впровадженні в Україні кількісних методик ВН, ця ситуація зміниться.