Про удосконалення організації дозорного епідеміологічного нагляду за бактеріальними менінгітами

Метод дає можливість диференціювати різні види нейсерій і деякі інші види мікроорганізмів (таблиця 1).

Менінгококи ферментують глюкозу і мальтозу з утворенням кислоти. Іноді спостерігають варіабельність сахаролітичної активності у різних штамів одного і того ж виду (3% менінгококів не ферментують глюкозу, 10% менінгококів не ферментують мальтозу.

Визначення серогрупи у менінгококів проводять в реакції аглютинації на склі з набором серогрупових антисироваток, що аглютинують, або в реакції ЛА з відповідним набором реактивів. Реакцію проводять тільки з чистою культурою менінгококів, що пройшла всі етапи ідентифікації. При проведенні реакції необхідно точно слідувати інструкції, що додається до набору антисироваток або латексних реактивів.

Ідентифікація Streptococcus pneumoniae.

Характеристика збудника. Збудником пневмококових менінгітів є Streptococcus pneumoniae (пневмокок), який (згідно "Визначника бактерій Берджі") входить до складу роду Streptococcus (група стрептококів ротової порожнини), включених в 17-у групу "Грампозитивні коки". Це овальні, іноді витягнуті уподовж осі ланцетоподібні коки, діаметром 0,5 - 1,0 мкм, розташовуються парами і оточені загальною капсулою. Пневмококи нерухливі, спор не утворюють, є факультативними анаеробами. Для культивування потребують багатих поживних середовищ, віддають перевагу капнофільним умовам (5 - 10% CO2). Температурний оптимум 37 °C. Пневмококи каталазо- і оксидазонегативні. Розкладають до кислоти глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, не ферментують маніт, саліцин, сорбіт. Ферментують інулін.

Виділення та ідентифікацію пневмококів виконують по наступних тестах:

1. Виявлення в нативному матеріалі (ліквор та/або кров) диплококів, оточених капсулою.

2. Ріст на середовищах, що містять кров, з утворенням альфа-гемолізу.

3. Характерна морфологія культурального мазка за Грамом.

4. Позитивна проба з оптохіном.

5. Чутливість до жовчних кислот (дезоксихолатна проба або тест на розчинність в жовчі).

6. Позитивний тест "Бинакс" (для СМР).

7. Виявлення специфічного антигена в реакції ЛА (при позитивному тесті "Бінакс" ЛА не проводять!).

При посіві на поживні середовища і подальшій інкубації протягом 24 годин при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 виявляють наступні культуральні властивості: ріст на КА та ША у вигляді невеликих, сіруватих, із зеленуватою зоною альфа-гемолізу навколо, колоній. Свіжі колонії опуклі, але у міру старіння центр колонії опускається вниз, і вони набувають характерну форму "шашок". Колонії схильні до аутолізу, що пов'язано з активністю внутріклітинних ферментів.

Біохімічна активність пневмококів багато в чому співпадає з активністю стрептококів, що зеленять. Для диференціальної діагностики використовують пробу з оптохіном і дезоксихолатну пробу (тест на розчинність в жовчі).

Проба з оптохіном (оптохін пригнічує ріст пневмококів): на чашку з КА суцільним газоном засівають досліджувану 18- 24 годинну культуру, вирощену в атмосфері CO2. На поверхню середовища поміщають диск діаметром 6 мм, що містить 5 мкг оптохіна. Після інкубації при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2. протягом 18 - 24 годин навкруги диска утворюється зона інгібіції росту, діаметр якої яку виміряють за допомогою штангенциркуля або лінійки з верхньої сторони чашки c відкритою кришкою.

Позитивний контроль - контрольна культура S.pneumoniae ATCC 49619, негативний контроль - S.mitis ATCC 49456.

Позитивний результат - зона затримки росту більше або дорівнює 14 мм. Мікроорганізм є S.pneumoniae.

Негативний результат - немає зони затримки росту. Мікроорганізм не є S.pneumoniae.

Сумнівний результат - зона затримки росту 9 - 13 мм. Результат має бути перевірений за допомогою дезоксихолатної проби.

Варто пам'ятати, що іноді пневмококи можуть бути оптохін-резистентними.

Дезоксихолатна проба: використовують 2% розчин дезоксихолату натрію. Для цього готують суспензію досліджуваної 18 - 24 годинної культури, вирощеної на КА в атмосфері CO2, в 1 мл фізіологічного розчину до каламутності 1 за стандартом McF. Половину суспензії переносять в пробірку марковану словом "тест", іншу половину залишають в пробірці маркованій словом "контроль". В пробірку "тест" додають 500 мкл 2% розчину дезоксихолату натрію, в пробірку "контроль" - 500 мкл фізіологічного розчину. Пробірки струшують і інкубують 1 - 2 години при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2. Повне прояснення рідини в пробірці "тест" в порівнянні з пробіркою "контроль" свідчить про належність культури до S.pneumoniae. Позитивний контроль - S.pneumoniae ATCC 49619, негативний контроль - S.mitis ATCC 49456.

Часткове просвітлення суспензії (часткову розчинність) не прийнято вважати позитивним результатом тесту. Частково розчинні штами при наявності зон затримки росту оптохіном діаметром менше 14 мм не є пневмококами.

Ідентифікація Haemophilus influenzae

Характеристика збудника. Згідно "Визначника бактерій Берджі" Haemophilus influenzae відноситься до роду Haemophilus, який входить в родину Pasteurellaceae (підгрупа 3), що відноситься до 5 групи мікроорганізмів, що включає всі факультативно-анаеробні грамнегативні палички. З організму людини можна виділити 8 видів гемофілів, причому тільки 2 з них - Haemophilus influenzae і Haemophilus duckreyi є основними патогенами людини. Haemophilus influenzae - невеликі (0,3 - 0,4 х 1 - 1,5 мкм) грамнегативні, сферичні, овальні і паличковидні клітини. Іноді утворюють нитки і мають помітний поліморфізм, особливо в матеріалі від хворих, які одержували бета-лактамні антибіотики. Гемофіли нерухливі, спор не утворюють, повільно забарвлюються аніліновими фарбниками. Каталазопозитивні, оксидазопозитивні.

Haemophilus influenzae - факультативний анаероб, оптимальні умови культивування - температура 37 °C і атмосфера з підвищеним вмістом CO2. Більшість видів Haemophilus при культивуванні вимагає присутності в поживному середовищі X та/або V факторів. Термостабільний фактор росту X (гемін) утворюється з гема шляхом заміни двовалентного іона заліза на тривалентний. Гем, у свою чергу, удосталь міститься в еритроцитах, входить до складу гемоглобіну. Фактор V - це термолабільний кофермент нікотинамідаденіндинуклеотид (НАД), що бере участь в окислювально-відновних реакціях бактеріальних клітин. Фактор V синтезується рядом бактерій (сарцинами, стафілококами, нейсеріями і іншими) і присутній в тваринних клітинах, у тому числі в еритроцитах. Додавання в поживне середовище НАД задовольняє потребу мікроорганізмів в факторі V. Усередині роду мікроорганізми диференціюють по потребі у вказаних факторах росту і на підставі біохімічних властивостей, які наведені в таблиці 2.

Haemophilus influenzae потребує як X, так і в V факторів росту. Температурні межі росту гемофілів 24 - 43 °C, оптимальна температура 37 °C. Виходячи з того, що гемофілам для культивування необхідні фактори росту (X та/або V), оптимальним середовищем є ША, в який входить гріта кров, що містить X і V фактори, що виділяються при термічному руйнуванні еритроцитів.

Капсульовані штами Haemophilus influenzae містять капсульний полісахарид одного з 6 типів (a, b, з, d, e, f), які відрізняються за складом вуглеводів, що входять в нього і антигенним властивостям.

Основну епідемічну небезпеку представляє Haemophilus influenzae типу "b", оскільки викликає найважчі менінгіти, сепсис, пневмонії і інші інфекційні захворювання. Капсульний антиген Hib складається з полірибозилрібітолфосфата (PRP або ПРФ).

-1 H.parainfluenzae орнітиндекарбоксилазапозитивний, тоді як H.paraphrophilus - негативний.

-2 Хоча потреби представників цих видів в геміні і НАД різні, H.aphrophilus і H.paraphrophilus були недавно перекваліфіковані як окремі види, що належать до нового роду - Aggregatibacter aphrophilus.

Визначення потреби в X і V факторах росту за допомогою комерційних дисків з X, V і X + V факторами. Приготувати помірно густу суспензію 18 - 24 годинної культури досліджуваного штаму, вирощеного на ША в атмосфері CO2 (зіставну з стандартом 1,0 за McF) у пептонній воді або бульйоні.

Намагатися не вносити частинок ША в суспензію, оскільки це може викликати хибнопозитивний результат або ріст на всій поверхні агара.

Посіяти бавовняним тампоном "газоном" на поверхню середовища без додавання крові, дефіцитне по X і V факторах (триптиказо-соєвий або колумбійський агар).

На одній чашці можна дослідити два ізолята, але треба забезпечити, щоб культури не стикалися.

Після висихання інокулята розмістити паперові диски з X, V і X + V факторами на поверхні агару у формі трикутника, як мінімум на відстані 3,5 см один від одного, щоб уникнути взаємної дифузії факторів, що дає помилкові результати, а саме - ріст навколо диску, де результат мав бути негативним.

Обережно перевернути чашки догори дном і інкубувати протягом 18 - 24 години при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Після інкубації посіви переглядають, фіксують наявність або відсутність росту навколо цих трьох дисків. Наявність росту навколо диска указує на потребу в даному факторі (див. мал. 1).

Мал. 1. Визначення потреби в ростових факторах: геміні (фактор X) та НАД (фактор V), з використанням діагностичних паперових дисків

Інтерпретація результатів. H.Influenzae та H.haemolyticus будуть рости тільки навколо паперового диска, що містить X + V фактор. З метою диференціації цих двох видів необхідно перевірити наявність гемолізу на агарі з додаванням кінської або кролячій крові.

Інші види Haemophilus spp. будуть рости навколо діагностичних дисків, що містять X, V і X+V фактори.

Штами для контролю якості:

X і V фактори - Haemophilus influenzae;

тільки V фактор - Haemophilus parainfluenzae NCTC 10665.

Тест на сателітизм. У випадку відсутності дисків з X,V і X + V, для визначення потреби в V факторі може бути виконаний тест на сателітизм з Staphylococcus aureus.

1. Посіяти свіжу культуру передбачуваного штаму H.influenzae на КА.

2. Посіяти S.aureus штрихом упоперек посіву H.influenzae.

3. Інкубувати протягом ночі при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

КА містить достатню кількість X-фактора (геміна), але не достатньо V фактора (НАД). Staphylococcus aureus в процесі росту продукує V-фактор і колонії Haemophilus influenzae ростуть на ділянках, розташованих поряд з штрихами S.aureus (див. мал. 2).

Мал. 2. Тест на сателітизм для визначення потреби в V факторі

Додатково, якщо тест на сателітизм проводиться на КА, можна також спостерігати наявність або відсутність гемолізу поряд з колоніями Haemophilus. Ця інформація може бути використана як підтвердження присутності гемолітичних видів роду Haemophilus.

Виділення та ідентифікацію Haemophilus influenzae, проводять по наступних тестах:

1. Виявлення в СМР поліморфних грамнегативних кокобацил.

2. Ріст тільки на середовищах, що містять X і V фактори росту (ША).

3. Характерна морфологія культурального мазка, пофарбованого за Грамом.

4. Виявлення потреби в X і V факторах росту.

5. Визначення відповідних антигенів в реакції ЛА.

При посіві на поживні середовища і подальшій інкубації протягом 24 годин при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 і підвищеною вологістю виявляють наступні культуральні властивості: на ША Haemophilus influenzae росте у вигляді сірих, слизових, блискучих колоній з рівними краями, діаметром 0,2 - 2 мм. Ріст культури часто супроводжується різким "мишачим запахом" (запах індолу).

При мікроскопії культури (фарбування за Грамом) видно грамнегативні поліморфні палички або кокобацили розміром від точкових до середніх, звичайно менше 1 мкм завширшки і різні по довжині, часто бачать капсулу, розташовані безладно. Іноді знаходять короткі і довгі (ниткоподібні) ланцюжки.

5.1. Загальні вимоги

Для приготування середовищ має використовуватися дефібринована бараняча або кінська кров. Кров людини для приготування поживних середовищ не придатна.

Свіжа людська кров містить: антитіла, комплемент, які негативно впливають на результати досліджень.

Донорська кров з вичерпаним терміном придатності, містить:

цитрат (хелатна добавка) - пригнічує ріст бактерій, видаляючи нутрієнти;

глюкозу (в її присутності b-гемоліз виглядає як a- гемоліз).

Крім того, людська кров може містити такі небезпечні патогени такі як: ВІЛ, віруси гепатитів B, C і ін.

5.2. Зберігання готових поживних середовищ

в сухому, захищеному від світла місці;

оддалік джерел тепла. Середовища, що містять кров, органічні добавки або антибіотики повинні зберігатися в холодильнику при +4 °C;

термін придатності готових середовищ, при їх зберіганні в холодному темному місці залежить від тари, що використовується:

пробірки з ватно-марлевими пробками - 3 тижні;

пробірки з кришками, що не нагвинчуються - 2 тижні;

чашки Петрі в запечатаних пластикових пакетах - 2 тижні.

5.3. Контроль якості поживних середовищ

Кожна партія поживних середовищ повинна бути перевірена на якість перед використанням.

Контроль pH. Якщо pH відрізняється від заявленої більш ніж на 0,2 од., довести до потрібного значення лугом/кислотою, або приготувати нову партію середовища.

Контроль стерильності. Інкубація чашок 2 - 5 діб при (36 ± 1) °C.

Контроль ростових властивостей. Перевірка якості середовищ по їх здатності підтримувати ріст контрольних мікроорганізмів - використовують стандартну посівну дозу і оцінюють результат кількісно і якісно.

Для контролю використовують 18 - 24 годинну культуру контрольних штамів, вирощених на відповідному середовища при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Дату приготування та результати контролю якості поживних середовищ реєструють в формі № 256/о "Журналі приготування та контролю поживних середовищ".

Можливі проблеми при приготуванні середовищ

Перегрів або дуже довге нагрівання -

Руйнує ростові фактори

Викликає розкладання сахарів

Викликає утворення осаду

Змінює pH

Позбавляє агар гелеутворюючих властивостей.

5.4. Приготування поживних середовищ

5.4.1. Кров'яний агар. В якості основи середовища використовують колумбійський, триптиказо-соєвий агари тощо.

До розплавленої і охолодженої до температури 50 °C основи додати 5% дефібрінованої крові.

Ретельно перемішати, уникаючи утворення пухирців і піни, і розлити в чашки Петрі.

Контроль якості. Контроль ростових якостей. 18 - 24 годинну культуру контрольних штамів S.pneumoniae або N.meningitidis, вирощену на КА при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, посіяти на поверхню свіжеприготовленого середовища. Інкубувати 24 год. в атмосфері CO2. Провести облік результатів.

Контроль стерильності: інкубувати незасіяну чашку протягом 48 год. при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Середовище придатне для використання якщо:

колонії S.pneumoniae типові за формою і розміром, мають колір від сірого до сіро-зеленого, їх має оточувати виразна зона a-гемолизу зеленого кольору;

колонії N.meningitidis сірого кольору, крупні, округлої форми, гладенькі, вологи, з блискучою поверхнею, опуклі, мають ідеально рівні краї;

тест на стерильність негативний - після 48 год. інкубації ріст на чашці з досліджуваним середовищем відсутній.

5.4.2. "Шоколадний" агар. До 100 мл розплавленої і охолодженої до 50 °C основи колумбійського агару додати 2,5 мл дефібринованої стерильної крові, ретельно перемішати і помістити на 2 хвилини у водяну баню при 80 - 85 °C. Додати ще 2,5 мл крові ретельно перемішати і знов помістити у водяну баню на 3 - 6 хв. Кров перед використанням бажано прогріти в термостаті при 37 °C. Колір шоколадного агару має бути світло-коричневим. Коли середовище охолоне до 50 °C, можна додати ростові добавки Isovitalex або Vitox (відповідно до інструкції, що додається до упаковки з ростовими добавками).

Середовище розливають в чашки Петрі. Зберігають не більше двох тижнів в целофанових пакетах при +4 ° - +6 °C.

Контроль якості. 18 - 24 годинну культуру контрольних штамів S.pneumoniae, N.meningitidis і H.Influenzae, вирощену на ША при при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 посіяти на поверхню свіжеприготовленого середовища.

Середовище придатне для використання якщо:

колонії N.meningitidis і H.influenzae крупні, округлої форми, гладенькі, опуклі, напівпрозорі, безбарвні або сірі. Не повинне спостерігатися зміни кольору поживного середовища;

колонії S.pneumoniae невеликі, мають колір від сірого до сіро-зеленого, їх повинна оточувати зона альфа-гемолізу слабо-зеленого кольору;

тест на стерильність - негативний - після 48 годин інкубації ріст на чашці з досліджуваним середовищем відсутній.

5.4.3. "Шоколадний" агар на основі сухого гемоглобіну

Розчинити і з дотриманням стерильності розлити на аліквоти (2 мл). Аліквоти можна заморозити при -20 °C і використовувати у міру необхідності.

Коли розчини A і B охолонуть приблизно до 50 °C, обережно змішати їх, уникаючи утворення пухирців.

Додати до отриманої суміші розчинів A і B 2 мл розчину С, перемішати.

Розлити в чашки Петрі. Провести контроль якості згідно протоколу для ША на основі свіжої крові.

Середовище в чашках Петрі зберігати не більше двох тижнів в целофанових пакетах при +4 ° - +6 °C.

5.4.4. Цистин-триптиказний агар (ЦТА) з додаванням 1% вуглеводів (напіврідке поживне середовище) для визначення сахаролітичної активності менінгококів

Наважку сухої основи ЦТА (кількість зазначена на етикетці конкретної серії (лоту) препарату), суспендувати в 900 мл дистильованої води. Ретельно перемішати, підігріти при частому помішуванні і кип'ятити протягом 1 хвилини до повного розчинення порошку.

Автоклавувати при 121 °C протягом 15 хвилин.

Охолодити до 50 °C на водяній бані.

Приготувати 10% розчин глюкози шляхом додавання 10 г глюкози до 100 мл дистильованої води. Стерилізувати фільтруванням (фільтр з розміром пор 0,22 мікрон).

Дотримуючись правил стерильності, додати 100 мл 10% розчину глюкози, приготованого як зазначено вище, до 900 мл середовища ЦТА для отримання кінцевої 1% концентрації глюкози.

Дотримуючись правил стерильності, розлити по 7 мл середовища в скляні пробірки 16 х 125 мм з кришками, що загвинчуються.

Аналогічно приготувати середовища з мальтозою, лактозою і сахарозою.

Зберігати при 4 °C. Перед використанням підігріти до кімнатної температури (25 °C).

Контроль якості. Довести середовища ЦТА з вуглеводами до кімнатної температури (25 °C) і промаркувати пробірки з зазначенням назв контрольних штамів.

Посіяти одноразовою петлею 3 - 5 колоній 18 - 24 годинних культур контрольних штамів N.meningitidis, N.lactamica і N.sicca, вирощених на КА при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, уколом в стовпчик свіжеприготовленого середовища. Для цього приблизно 8 разів ввести петлю з культурою в ЦТА з додаванням вуглеводів, занурюючи її на глибину 10 мм від поверхні середовища.

Для кожного середовища з вуглеводом використовують окремі одноразові петлі.

Нещільно загвинтити кришку кожної пробірки і помістити їх в термостат при температурі (36 ± 1) °C без CO2. Інкубувати посіви від 3 до 5 діб.

При обліку результатів враховують появу видимих ознак каламутності і зміну кольору на жовтий.

Інтерпретація результатів

Поява видимих ознак каламутності і жовтого кольору у верхній частині середовища свідчить про ріст бактерій і продукцію кислоти та інтерпретується як позитивний результат.

N.meningitidis має утилізувати глюкозу і мальтозу, але не утилізує лактозу та сахарозу.

N.lactamica має утилізувати глюкозу, мальтозу і лактозу, але не утилізує сахарозу.

N.sicca має утилізувати глюкозу, мальтозу і сахарозу, але не утилізує лактозу.

5.4.5. Трансізоляційне середовище (TI, Trans-Isolate Medium)

Використовується в готовому вигляді.

Контроль якості. Приготувати суспензії з 18 - 24 годинних культур контрольних штамів N.meningitidis, S.pneumoniae і H.influenzae вирощених на КА або ША при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2. Їх концентрація повинна відповідати 0,5 за стандартом McF (~ 1,5 х 10-8 КУО/мл).

Приготувати їх серійні розведення на серцево-мозковому бульйоні для отримання інокулятів густиною 10-3 КУО/мл.

Зняти стерильним пінцетом алюмінієвий ковпачок з гумової пробки у 3-х флаконів з TI-середовищем і обробити пробки 70% розчином ізопропанолу або етанолу.

Не використовувати для обробки розчин повідон-йоду!

За допомогою стерильного шприца з голкою посіяти у флакони з TI-середовищем по 100 мкл суспензій контрольних штамів густиною 10-3 КУО/мл (посівна доза 100 КУО). Суспензії мають бути засіяні не пізніше 15 хвилин з моменту їх приготування.

Для кожного флакона з TI-середовищем використовують новий стерильний шприц з голкою. Після засіву і витягання голки шприца з гумової пробки флакон з TI-середовищем кілька разів перевертають для перемішування вмісту.

В кожний засіяний флакон з TI-середовищем ввести стерильну вентиляційну голку. Вентиляційна голка не повинна занурювалася в бульйон.

Інкубувати вентильовані флакони з TI-середовищем 18 - 24 годин при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Після закінчення часу інкубації флакони дістати з термостату, витягнути і утилізувати вентиляційні голки. Перевернути кожний флакон з TI-середовищем кілька разів для перемішування вмісту.

За допомогою стерильних шприців з голками відібрати по 10 мкл цього бульйону нанести на поверхню поживного середовища у чашці Петрі і розсіяти стерильною петлею штриховим методом для отримання ізольованих колоній контрольних штамів на КА для N.meningitidis і S.pneumoniae, а також на ША для культури H.influenzae.

Чашки з посівами інкубують 18 - 24 годин при температурі (36 ± 1) °C в атмосфері CO2.

Інтерпретація результатів

Колонії N.meningitidis на КА мають бути сірого кольору, крупними, округлої форми, гладкими, вологими, з блискучою поверхнею, опуклими, мають ідеально рівні краї.

Колонії S.pneumoniae на КА мають бути невеликими, мати колір від сірого до сіро-зеленого, їх повинна оточувати виразна зона альфа-гемолізу зеленого кольору.

Колонії H.influenzae на ША мають бути крупними, округлої форми, гладкими, опуклими, напівпрозорими, безбарвними або сірими. Не повинне спостерігатися зміни кольору поживного середовища.

Внутрішньолабораторний контроль якості досліджень - це процес ефективного та систематичного внутрішнього спостереження за робочим процесом в лабораторії з метою належного дотримання вимог нормативної документації, яка регламентує всі аспекти діяльності лабораторії.

Внутрішній контроль якості є складовою системи управління якістю в лабораторії і гарантує, що результати, отримані в даній лабораторії, є точними, достовірними та відтворюваними.

Повинні бути розроблені стандартні операційні протоколи (СОП) для всіх методик, що використовуються.

Контроль температури в термостатах, холодильниках та морозильних камерах проводять щоденно перед початком роботи. Результати вимірів реєструють у контрольному листі і завіряють підписом виконавця. У випадку перевищення припустимих відхилень температури (див. нижче), співробітник, що проводить реєстрацію, повинен повідомити про це керівникові підрозділу і провести регулювання температури для компенсації виявлених відхилень. Якщо врегулювати температуру не вдається, викликають сервісну службу.

холодильник +4 °C, допустимий діапазон відхилень +(2 - 8) °C;

морозильна камера: -20 °C, допустимий діапазон відхилень - (17 - 23) °C;

морозильна камера: -70 °C, допустимий діапазон відхилень >-65 °C;

термостат: +36 °C, допустимий діапазон відхилень + (35 - 37) °C.

Листи обліку температури в холодильнику/морозильнику, термостаті мають бути прикріплені на зовнішній поверхні обладнання.

Контроль роботи автоклавів проводять фізичним (кожну закладку), хімічним (кожну закладку) та біологічним (1 раз на місяць) методами. Використовують максимальні термометри, хімічні та біологічні індикатори. Результати фіксують у формі первинної облікової звітності № 257/о "Журнал контролю роботи стерилізаторів повітряного парового (автоклаву)".

Оцінку загального стану центрифуг проводять візуально при кожному використанні. Про будь-які виникаючі несправності слід повідомляти негайно. Несправне обладнання не повинне використовуватися.

Лабораторія має вести облік отриманих наборів реагентів, барвників, поживних середовищ в спеціальному журналі із зазначенням дати отримання, кількості, терміну придатності, дати відкриття упаковки.

Реагенти, поживні середовища готують у відповідності до затверджених методик та інструкцій щодо їх застосування.

Приготовлені розчини реактивів зберігають в герметично закритих ємкостях з темного скла. На кожній ємкості повинен бути напис з зазначенням: назви розчину; дати його приготування, (стерилізації, якщо необхідно), терміну придатності і зазначення прізвища фахівця, який готував розчин.

Всі вихідні розчини зберігаються не більше терміну придатності та постійно поповнюються.

Всі контейнери (флакони, упаковки) з поживними середовищами, реактивами і барвниками комерційного виробництва повинні мати на етикетках інформацію про дату виготовлення, термін придатності та відмітку про дату отримання в лабораторію і дату розкриття упаковки.

Будь-які неякісні матеріали або із простроченим терміном придатності не повинні використовуватись.

Всі поживні середовища повинні піддаватись контролю якості після приготування. Результати контролю якості реєструють у формі первинної облікової звітності № 256/о "Журнал приготування і контролю поживних середовищ".

Дезінфікуючі засоби мають готуватися відповідно до інструкцій виробника. На всіх ємностях з дезрозчинами має бути зазначена назва, концентрація та дата приготування.

7.1. Загальні положення

Ведення еталонних культур має забезпечувати максимальне збереження типових властивостей штамів, що досягається дотриманням принципів їх культивування, контролю і зберігання.

Основні принципи ведення еталонних бактеріальних культур:

- кількість пасажів тестового мікроорганізму на поживних середовищах з моменту його відновлення до моменту його цільового використання повинна бути, по можливості, мінімальною;

- рух культури з моменту її відновлення після ліофилізації до цільового використання повинен бути однонаправленим, тобто запаси еталонної культури не повинні поповнюватися за рахунок (з) запасів робочої культури. Небажано поповнювати запаси робочої культури шляхом отримання її субкультур;

- контроль еталонного штаму на відповідність типовим властивостям проводять перед закладкою на тривале зберігання і перед заповненням запасів робочої культури;

- штами із зміненими властивостями для подальшої роботи не використовують;

- для цільового використання придатні культури еталонного штаму, що пройшли з моменту висіву з середовища для зберігання запасів робочої культури (середовища для кріоконсервації) не більше 3 - 4 пасажів.

Всі роботи з культурами необхідно проводити в боксі біологічної безпеки 2-го класу.

Еталонні культури, заморожені в середовищах для кріоконсервації повинні зберігатися при -70 °C.

Робочі культури повинні зберігатися в аналогічних умовах.

При неможливості забезпечення таких умов для робочих культур, можливо зберігання при - 20 °С. В цьому випадку культури необхідно щомісячно перевивати і знов заморожувати. При зміні основних властивостей еталонного штаму, необхідно заповнити запас робочої культури з еталонної колекції, що зберігається при -70 °C.

Зберігання колекції еталонних (контрольних) культур, а також формування запасів робочої культури здійснюватиметься в ЦРЛ.

В еталонну частину колекції повинно бути поміщено на зберігання, як мінімум, 20 копій кожного штаму.

Запаси робочих культур розподілятимуться у міру необхідності (але не рідше 3-х разів на рік) між бактеріологічними лабораторіями дозорних регіонів.

1. HA9 Haemophilus parainfluenzae NCTC 7857 - негативний контроль в тесті на визначення потреби в XV факторах росту (для росту необхідний тільки V фактор);

2. HA61 Haemophilus influenzae серотип b ATCC 10211 - позитивний контроль в тестах на визначення потреби в XV факторах росту (для росту необхідні фактори X і V) та ЛА;

3. HA65 Haemophilus influenzae серотип f ATCC 9833 - позитивний контроль в тесті на визначення потреби в XV факторах росту (для росту необхідні фактори X і V) і негативний контроль в ЛА;

4. HA72 Haemophilus influenzae ATCC 49247 для контролю якості при визначенні чутливості до антибіотиків дискодифузійним методом;

5. HA73 Haemophilus influenzae NCTC 11315 - позитивний контроль при визначенні активності бета-лактамази;

6. H101 Streptococcus pneumoniae wild type - позитивний контроль (визначення чутливості до оптохіну, дезоксихолатна проба (розчинність в жовчі), ЛА);

7. H102 Streptococcus mitis wild type - негативний контроль (визначення чутливості до оптохіну, дезоксихолатна проба (розчинність в жовчі), контроль ростових якостей КА та агар Мюллера - Хинтона з 5% крові;

8. 10606 Neisseria lactamica - позитивний контроль (визначення активності цитохромоксидази, каталази і сахаролітичної активності).

Для оцінки ростових якостей поживних середовищ ША та НТМ агар (Haemophilus Test Medium) може бути використаний будь-який штам Haemophilus influenzae з колекції.

Еталонні штами HA60, HA62, HA63, HA64 і HA67 можуть бути використані як позитивні контролі в реакції аглютинації на склі. Доцільно продовжувати зберігати ці культури в ліофілізованому вигляді, при необхідності відновити ліофілізат, страхувати і помістити на зберігання в еталонну частину колекції в кількості не менше 20 копій, сформувати робочу частину колекції для цільового використання в ЦРЛ.

7.2. Методика ведення еталонних (контрольних) штамів

Процес ведення штамів в даному варіанті складається з наступних блоків:

- відновлення і контроль ліофілізованої культури;

- створення запасу еталонної культури (зберігання в умовах кріоконсервації);

- створення запасу робочої культури (зберігання в умовах кріоконсервації);

- підготовка культури для цільового використання;

- контроль видових і паспортних властивостей.

На відміну від широко поширеної методики ведення культур мікроорганізмів, заснованої на необмежених послідовних (лінійних) пересівах, дана схема ведення зводить до мінімуму кількість пасажів еталонної культури, що проводяться від моменту відновлення після ліофілізації до цільового використання. Такий підхід дозволяє скоротити вірогідність небажаних мутацій, які ведуть до втрати еталонних властивостей, або випадкового забруднення. Забракована лінія еталонної культури повинна бути у будь-який момент замінена нову.

7.2.1. Відновлення і контроль ліофілізованого еталонного штаму

За допомогою пили або різця надрізати вузький кінець ампули по всьому колу, так, щоб надріз знаходився приблизно в середині ватяного тампона, що знаходиться в ампулі. Далі нагріти кінець скляної пастерівської піпетки над полум'ям, поки він не придбає червоний колір, і негайно злегка натиснути їм на надріз на ампулі. Скло повинне тріснути уздовж надрізу. Якщо скло не тріснуло, повторити процедуру. Перед розділенням двох частин розкритої ампули швидко пропалити її над полум'ям. Обережно розділити 2 частини ампули, при цьому ватяний тампон повинен залишитися в тій частині, де знаходиться ліофілізована культура, помістити порожню частину ампули в контейнер для відходів. Дістати ватяний тампон з ампули за допомогою стерильного пінцета і додати в ампулу близько 500 мкл стерильної пептонної води, бульйону або фізіологічного розчину, помістити ватяний тампон назад в ампулу і залишити на декілька хвилин для регідратації. Далі за допомогою стерильної пастерівської піпетки ресуспендувати отриману суспензію і посіяти на щільні і рідкі поживні середовища:

- при роботі з видами роду Haemophilus на ША;

- рід Streptococcus - на КА та триптиказо-соєвий бульйон;

- рід Neisseria - на ША та КА;

Кожну культуру посіяти як мінімум на 2 чашки зі щільним середовищем і за необхідності в пробірки з рідким. Інкубувати посіви протягом 16 - 20 год. при (36 ± 1) °C, в атмосфері 5% CO2.

Посіви на чашках використовують для постановки тестів на відповідність отриманого штаму типовим властивостям еталонної культури. При підтвердженні типових властивостей еталонного штаму культуру розсівають на 20 або більш чашок для створення запасу еталонної культури (кріоконсервація). Ліофілізована культура між відновленням і поміщенням її на зберігання повинна пройти не більш 3 - 4-х пасажів.

Типові властивості:

Види роду Haemophilus - тинкторіальні і культуральні властивості, потреби в X і V факторах росту, аглютинація з відповідною антисироваткою або латексним реактивом;

Види роду Neisseria - тинкторіальні і культуральні властивості, активність цитохромоксидази і каталази, сахаролітична активність, аглютинація з відповідною антисироваткою або латексним реактивом;

Види роду Streptococcus - тинкторіальні і культуральні властивості, чутливість до оптохіну, розчинність в дезоксихолаті натрію, аглютинація з відповідною антисироваткою або латексним реактивом.

Культура із зміненими властивостями в роботу не допускається.

7.2.2. Створення запасів еталонної культури

При задовільному проходженні контрольних тестів, культуру поміщають на зберігання. Як середовище для кріоконсервації доцільно використовувати стерильну дефибріновану баранячу або кінську кров, середовище на основі знежиреного (знятого молока) та гліцерину, а також триптиказо-соєвий бульйон з гліцерином (прописи приготування середовищ наведені нижче).

За допомогою стерильної пластикової мікробіологічної петлі або стерильного ватяного тампона зібрати з чашки з ША або КА весь отриманий ріст, помістити його в промарковану кріопробірку з 1 мл заздалегідь прогрітого до кімнатної температури середовища для кріоконсервації, ретельно перемішати і помістити в кріоштатив. Запас еталонної культури, що рекомендується - мінімум 4 - 5 пробірок з розрахунку на кожний планований рік зберігання. Помістити кріоштатив в морозильну камеру або в судину з рідким азотом.

Закладку запасів еталонної культури на тривале зберігання здійснюють один раз на весь період її використання. Запаси еталонної культури поповненню не підлягають.

Даний блок виконує задачу накопичувача біомаси еталонного штаму, що дозволяє уникнути необхідності поповнювати запаси робочої культури за рахунок повторних пасажів еталонного штаму через поживні середовища і подовжує "термін служби" культури, отриманої з однієї ампули.

7.2.3 Створення запасів робочої культури

Кріопробірку із запасів еталонної культури виймають з морозильної камери і поміщають на сухий лід або хладоелементи, далі, забирають петлею невелику кількість середовища з культурою і проводять посів штрихом на чашку з ША та/або КА, для представників роду Streptococcus доцільний також посів і на триптиказо-соєвий або інший бульйон. Пробірку з еталонною культурою знову поміщають в морозильну камеру. Необхідно уникати повного розморожування культури в кріопробірці, що дозволяє значно продовжити термін використання еталонної частини колекції.

Посіви інкубують в 16 - 20 год. при (36 ± 1) °C, в атмосфері 5% CO2.

Один з посівів на щільному або рідкому середовищі використовують для постановки тестів на відповідність отриманого штаму типовим властивостям. Другий посів використовують для створення запасів робочої культури.

При невідповідності штаму типовим властивостям використання культури не допускається.

В цьому випадку необхідно узяти ще одну порцію еталонної культури і піддати її аналогічному дослідженню.

При задовільному проходженні тестів культуру поміщають на зберігання в середовищі для кріоконсервації згідно методу описаному в п. 7.2.2.

Зберігання колекції еталонних (контрольних) штамів, а також формування запасів робочої культури здійснюватиметься в ЦРЛ.

Запаси робочої культури створюють не рідше ніж 1 раз на 4 місяці, з розрахунку 2 пробірки з кожним контрольним штамом, що підлягає розподілу, на лабораторію і відправляють в бактеріологічні лабораторії дозорних регіонів для цільового використання. Штами призначені для контролю якості всіх лабораторних тестів і ростових якостей поживних середовищ В лабораторіях дозорних регіонів штами повинні зберігатися замороженими в середовищах для кріоконсервації (морозильна камера або рідкий азот), висіватися на відповідні середовища і використовуватися за призначенням.

Культури в середовищах для кріоконсервації повинні перевозитися в замороженому стані, що досягається використанням сухого льоду, спеціальних контейнерів і хладоелементів. Не допускається повторне заморожування і відтавання культури. Якщо матеріал при транспортуванні розморозився, то необхідно знов посіяти культуру на відповідні середовища, а потім заморозити в середовищі для кріоконсервації.

Можливі також і інші способи транспортування еталонних штамів в дозорні регіони.

8.1. Транспортування культур в пакетах з силікагелем

1. Отримати культуру на ША агарі (для H.influenzae, H.parainfluenzae і нейсерій) або КА (для стрептококів і нейсерій). Для цього інкубувати посів при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2 протягом 18 - 20 год.

2. Перевірити чистоту культури.

3. Обробити (протерти) пакет з силікагелем 70% спиртом.

4. Розкрити пакет з силікагелем за допомогою продезінфікованих ножиць.

5. Оглянути силікагель, що знаходиться усередині пакету. Він повинен мати білий колір з голубими вкрапленнями. Наявність рожевих вкраплень указує на порушення цілісності пакету, такий силікагель не придатний до використання.

6. Зібрати стерильним сухим тампоном всю культуру з чашки.

7. Помістити тампон всередину пакету з силікагелем.

8. Переконатися, що тампон повністю занурений в силікагель.

9. Зігнути край пакету і клейкою стрічкою ретельно запечатати пакет навкруги дерев'яної рукоятки тампона.

10. Вказати на пакеті номер зразка.

11. Помістити запечатаний і промаркований пакет в пластиковий пакет з абсорбуючим матеріалом і запечатати його.

12. Транспортувати при температурі не нижче +4 °C.

13. Співробітник лабораторії, що отримав посилку, повинен розкрити пакет з силікагелем, обережно видаливши клейку стрічку, вийняти тампон і посіяти культуру на відповідне середовище (ША або КА).

14. Посів інкубують при (36 ± 1) °C або в атмосфері CO2 протягом 18 - 20 год. За наявності росту перевіряють чистоту отриманої культури. Далі культуру можна використовувати за призначенням і заморозити в середовищі для кріоконсервації для подальшого використання (методику див. п. 7.2.2).

8.2. Транспортування культур на скошеному шоколадному агарі

ША для транспортування культур розливають у флакони або пробірки з кришками, що загвинчуються і скошують.

Колонію чистої культури відповідного мікроорганізму, вирощену на чашках з ША або КА, зняти з чашки і посіяти:

S.pneumoniae - на скошену поверхню ША. Інкубувати протягом ночі при (36 ± 1) °C в атмосфері 5% CO2, після інкубації щільно закрити кришку;

H.influenzae - на скошену поверхню ША. Інкубувати протягом ночі при (36 ± 1) °C в атмосфері 5% CO2, після інкубації упевнитися, що кришка щільно закрита;

N.meningitidis на скошену поверхню ША. Інкубувати протягом ночі при (36 ± 1) °C 5% CO2. При зберіганні кришка не повинна бути щільно закрита. Під час транспортування її бажано закрити для запобігання контамінації.

Транспортують свіжі посіви при кімнатній температурі.

Одразу після отримання штамів роблять висів на ША і КА інкубують при (36 ± 1) °C в атмосфері CO2, перевіряють чистоту культури і заморожують в середовищі для кріоконсервації для створення запасу робочої частини колекції. Використовують за призначенням (методику див. п. 7.2.2).

8.3. Транспортування культур на чашках Петрі з кров'яним або шоколадним агаром

Культури збудників S.pneumoniae, H.influenzae і N.meningitidis залишаються життєздатними не більше 3 - 4 днів (зберігання при кімнатній температурі). Рекомендується транспортувати свіжі посіви штамів також при кімнатній температурі. Одразу після отримання культур лабораторіями дозорних регіонів, їх необхідно пересіяти на свіжі середовища. Далі культуру можна використовувати за призначенням і заморозити в середовищі для кріоконсервації для подальшого використання (методику див. п. 7.2.2).

За 1 - 2 дні до використання робочу культуру висівають на відповідні середовища згідно методу, наведеному в п. 7.2.3, далі використовують за призначенням.

10.1. Дефібринована бараняча кров. Для кріоконсервації може бути безпосередньо використана стерильна дефібринована бараняча кров. Перед використанням кожної партії крові проводять тест на стерильність. Для цього повну бактеріологічну петлю крові засівають на КА, приготований з кров'ю вже перевіреної партії, а також на м'ясопептонний бульйон в співвідношенні 1:10 і інкубують при (36 ± 1) °C протягом 24 год.

Будь-який ріст повинен розглядатися, як контамінація і дана партію крові утилізують.

10.2. Середовище для кріоконсервації з 10% знятого молока / 10% гліцерину (V/V)

Змішати 10 г знятого молока (знежиреного) і 90 мл дистильованої води (флакон A).

Проавтоклавувати в окремому флаконі 10 мл гліцерину при 115 °C протягом 10 хв (флакон B).

Змішати вміст флаконів A і B відразу після автоклавування, поки рідини ще гарячі.

Отримане середовище повинне мати світло-молочний колір (не повинно бути карамелізації молока).

Розлити отриману суміш по кріопробіркам (1 мл) поки вона ще тепла.

Зберігати кріопробірки з готовим до використання середовищем при -20 °C.

Перед використанням кожної нової партії приготованого середовища його перевіряють на стерильність. Для цього повну петлю готового середовища посіяти на КА і інкубувати при (36 ± 1) °C протягом 24 год. Будь-який ріст розглядається, як контамінація і дана партія має бути утилізована.