Додаткова інформація (наприклад структурна формула, ступіньчистоти, природа та процентне співвідношення важливих домішок,кількість добавок, та коефіцієнт розподілу n-октанолу/води)повинні бути взяті до уваги як в плануванні дослідження, так і вінтерпретації результатів.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Щільність клітин: кількість клітин на мілілітр.
Ріст: зростання щільності клітин протягом періодудослідження.
Темп росту: зростання щільності клітин на одиницю часу.
EC : в цьому методі, концентрація досліджуваної речовини, 50результатом якої є зменшення на 50% або в рості (E C ) або в
b 50
темпі росту (E C ) відносно контрольного зразка.
r 50
КНВ (Концентрація невидимого впливу): в цьому методі, найвищадосліджувана концентрація при якій не спостерігається значногогальмування росту відносно контрольного зразка.
Всі концентрації досліджуваної речовини подаються в масі наоб'єм (міліграм на літр). Вони також можуть виражатись як маса на
-1
масу (мг/кг ).
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Еталонна речовина може досліджуватись як засіб щобпродемонструвати, що за лабораторних умов дослідження чутливістьбіологічних видів значно не змінюється.
Якщо використовується еталонна речовина, то результатипотрібно подавати у звіті про дослідження. Біхромат калію можевикористовуватись, як еталонна речовина, але його колір можевплинути на якість та інтенсивність освітлення доступного дляклітин, а також на спектрофотометричні дослідження, якщо вонивикористовуються. Біхромат калію використовується в міжнародномуміжлабораторному дослідженні (див. посилання (3) та Додаток 2).
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження на граничний вміст може проводитись при 100 мг налітр, для того, щоб продемонструвати, що EC більше ніж ця
50
концентрація. Культури обраних зелених водоростей, які ростуть
експоненціально, піддаються дії різних концентрацій досліджуваної
речовини протягом декількох поколінь за визначених умов.
Досліджуваний розчин інкубують протягом періоду 72 годин, підчас якого щільність клітин в кожному розчині вимірюється принаймнікожну добу. Гальмування росту визначається відносно контрольноїкультури.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Критерії якості повинні застосовуватись як до дослідженняграничного вмісту так і до методу повного дослідження.
Щільність клітин в культурах контролю повинна збільшуватисьна коефіцієнт щонайменше 16 протягом трьох днів.
Концентрації досліджуваної речовини повинні підтримуватись вмежах 80% від початкових концентрацій/протягом періоду, щовідповідає тривалості перебігу дослідження.
Для речовин, які легко розчиняються в досліджуваномусередовищі, утворюють стабільні розчини тобто ті, які не будутьзначною мірою випаровуватись, деградувати, піддаватись гідролізучи адсорбувати, початкова концентрація може розглядатись якеквівалент номінальній концентрації. Потрібно надавати свідченнятого, що концентрація була збережена протягом дослідження такритерії якості були дотримані.
Для речовин які мають наступні властивості:
(i) погано розчиняються в досліджуваному середовищі, або
(ii) можуть утворювати стабільні емульсії чи дисперсії, або
(iii) нестабільні у водних розчинах,
Початковою концентрацією слід вважати концентрацію, яка булавиміряна на початку дослідження. Концентрація повинна визначатисьпісля періоду врівноваження.
В будь-якому з цих випадків подальші вимірювання потрібновиконувати протягом дослідження, щоб підтвердити те, що дійсніконцентрації піддавання дії чи критерії якості були дотримані.
Визнають, що значні кількості досліджуваної речовини можутьвключатися в біомасу водоростей протягом періоду дослідження.Отже, для того, щоб продемонструвати відповідність вищеназванимкритеріям якості, як кількість речовини включеної в біомасуводорості так і речовину у розчині (або якщо це технічно неможливо, то виміряну у водомірній колонці) слід взяти до уваги.Однак, оскільки визначення концентрації речовини в біомасіводорості може викликати значні технічні проблеми, відповідністькритеріям якості може бути продемонстрована через використанняпосудини для дослідження при найвищій концентрації, але безводоростей та вимірювання концентрацій в розчині (або, якщотехнічно неможливо, у водомірній колонці) на початку та в кінціперіоду дослідження.
1.6. ОПИС ПРОЦЕДУРИ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Реагенти
1.6.1.1. Розчини досліджуваних речовин
Вихідні розчини з необхідною міцністю готують шляхомрозчинення речовини в деіонізованій воді або воді згіднопункту 1.6.1.2.
Обрані для дослідження концентрації готують додаючивідповідні аліквоти до попередніх культур водоростей (див.Додаток 1).
Речовини потрібно, як правило, досліджувати лише до границірозчинності. Для деяких речовин (наприклад, речовин, які маютьнизьку розчинність у воді, або високий показник P , або ті які
ow
утворюють скоріше стабільні дисперсії, ніж істинний розчин у
воді), дозволяється використовувати тестову концентрацію вищу за
границю розчинності речовини, щоб забезпечити отримання
максимально розчинної стабільної концентрації. Важливо, однак, щоб
ця концентрація не порушувала іншим чином систему дослідження
(наприклад, плівка речовини на поверхні води перешкоджає насиченню
води киснем, та ін.).
Ультразвукова дисперсія, органічні розчинники, емульгатори чидисперсанти можуть використовуватись як допоміжні засоби дляприготування вихідних розчинів з низькою розчинністю у воді абощоб допомогти диспергувати ці речовини в досліджуваномусередовищі. Коли використовуються такі допоміжні речовини, всідосліджувані концентрації повинні вміщувати однакову кількістьтаких допоміжних речовин, та додаткові контрольні зразки повинніпіддаватися дії однакової концентрації допоміжних речовин, як ті,які використовувались в серії досліджень. Концентрація такихдопоміжних речовин повинна бути мінімальною, але ні в якому разіне перевищувати 100 мг на л в досліджуваному середовищі.
Дослідження повинно проводитись без регулювання pH. Якщо єсвідчення відміченої зміни pH, то рекомендується повторнедослідження з регулюванням pH та записом результатів. В такомувипадку, значення pH вихідного розчину повинно узгоджуватись зізначенням pH водного розчину, окрім випадків наявності особливихпричин щоб цього не виконувати. З цією метою надається перевагаHCl та NaOH. Це регулювання pH повинно бути здійснене таким чином,щоб концентрація досліджуваної речовини у вихідному розчині значноне змінювалась. Якщо трапиться так, що хімічна реакція абофізичний випад осаду досліджуваного компоненту буде викликанийрегулюванням, то це потрібно вказати у звіті.
1.6.1.2. Досліджуване середовище
Вода повинна бути дистильованою, належної якості, або -1деіонізованою з провідністю менш ніж 5 мю S.см . Прилади длядистиляції води не повинні містити будь-яких частин, виготовленихз міді.
Рекомендується наступне середовище.
Готують чотири вихідні розчини згідно наступної таблиці.Вихідні розчини стерилізують фільтрацією через мікропористумембрану або автоклавну обробку та зберігають в темряві притемпературі 4 град.C. Вихідний розчин N 4 потрібно стерилізуватилише фільтруванням через мікропористу мембрану. Ці вихідні розчинирозбавляють для того, щоб досягнути кінцевих концентраційнутрієнта в досліджуваних розчинах.
------------------------------------------------------------------
| Нутрієнт |Концентрація у вихідному | Кінцева концентрація у |
| | розчині | досліджуваному розчині |
|----------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин 1: макронутрієнти |
|----------------------------------------------------------------|
|NH Cl | 1,5 г/л | 15 мг/л |
| 4 | | |
|MgCl .6H O | 1,2 г/л | 12 мг/л |
| 2 2 | | |
|CaCl .2H O | 1,8 г/л | 18 мг/л |
| 2 2 | | |
|MgSO .7H O | 1,5 г/л | 15 мг/л |
| 4 2 | | |
|KH PO | 0,16 г/л | 1,6 мг/л |
| 2 4 | | |
|----------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин 2: Fe-ЕДТА |
|----------------------------------------------------------------|
|FeCl .6H O | 80 мг/л | 0,08 мг/л |
| 3 2 | | |
|Na EDTA.2H O| 100 мг/л | 0,1 мг/л |
| 2 2 | | |
|----------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин 3: мікроелементи |
|----------------------------------------------------------------|
|H BO | 185 мг/л | 0,185 мг/л |
| 3 3 | | |
|MnCl .4H O | 415 мг/л | 0,415 мг/л |
| 2 2 | | -3 |
|ZnCl | 3 mg/l | 3 х 10 мг/л |
| 2 | | -3 |
|CoCl .6H O | 1,5 мг/л | 1,5 х 10 мг/л |
| 2 2 | | -5 |
|CuCl .2H O | 0,01 мг/л | 10 мг/л |
| 2 2 | | -3 |
|Na MoO .2H O| 7 мг/л | 7 х 10 мг/л |
| 2 4 2 | | |
|----------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин 4: NaHCO3 |
|----------------------------------------------------------------|
|NaHCO | 50 г/л | 50 мг/л |
| 3 | | |
------------------------------------------------------------------
Рівень pH середовища після врівноважування з повітрямстановить приблизно 8.
1.6.2. Прилади
- Стандартне лабораторне обладнання.
- Пробірки для дослідження відповідного об'єму (наприклад,конусні пробірки ємністю 250 мл придатні, якщо об'єм досліджуваноїречовини становить 100 мл). Всі пробірки для дослідження повиннібути однакові в плані матеріалу та розмірів,
- прилади для культивування: кабіна або камера в якійтемпература в межах від 21 град.C до 25 град.C може підтримуватисьна рівні +- 2 град.C, та забезпечувати безперервне однаковеосвітлення в спектральному діапазоні 400-700 нм. Якщо водорість укультурах контролю досягає рекомендованого темпу росту, то можнаприпустити, що умови росту, включаючи інтенсивність освітлення єадекватними.
При середньому рівні досліджуваних розчинів рекомендуєтьсявикористовувати, інтенсивність освітлення в межах
-2 -1 -2 -1
60 - 120 мю E.м .s (35 - 70 x 1018 фотонів.м .s ), якщо
вимірюється в межах значенням 400-700 нм з використанням
відповідного рецептора. Для інструментів, що вимірюють освітлення,
каліброваних в люксах, еквівалентним та прийнятним є значення від
6000 до 10000 лк.
Інтенсивність освітлення можна отримати використовуючи відчотирьох до семи 30 W флуоресцентних ламп універсального білоготипу (з кольоровою температурою приблизно 4300 K), на відстані0,35 м від культури водорості.
- Вимірювання щільності клітин повинні здійснюватись звикористанням прямого методу обрахунку живих клітин, наприклад,мікроскопом з камерами для рахування. Однак, інші процедури(фотометрія, нефелометрія, ...) можуть використовуватись, якщовони достатньо чутливі, та якщо показано, що вони у достатній міріпов'язані зі щільністю клітин.
1.6.3. Піддослідні організми
Рекомендується, щоб біологічні види зелених водоростей, яківикористовуються, були видами, які швидко ростуть, що є зручнимдля культивування та дослідження. Перевага надається наступнимвидам:
- Selenastrum capricornutum, наприклад, АКТК 22662 orЦКВН 278/4,
- Scenedesmus subspicatus, наприклад, 86.81 ККВ,
Примітка:
АКТК = Американська колекція типових культур мікроорганізмів(США)
ЦКВН = Центр культур водоростей та найпростіших (СполученеКоролівство Великобританії)
ККВ = Колекція культур водоростей (Геттінген, ФРН)
Якщо використовуються інші біологічні види, то у звітіпотрібно зазначити сорт.
1.6.4. Процедура дослідження
Діапазон концентрації, в якому можуть з'являтись впливи,визначається на основі результатів досліджень на визначеннядіапазону.
Дві одиниці виміру росту (біомаса та темп росту) можутьдавати результати із широко не зіставними одиницями значеньзатримки росту, обидві повинні використовуватись в дослідженні навизначення показників, для того, щоб забезпечити, щоб геометричнапрогресія концентрацій надала можливість оцінити як E C , так і
b 50
E C .
r 50
Початкова щільність клітин
Рекомендується, щоб початкова щільність клітин становила 4приблизно 10 клітин/мл для Selenastrum capricornutum таScenedesmus subspicatus. Якщо використовуються інші біологічнівиди, то біомаса повинна бути зіставною.
Концентрації досліджуваної речовини
Для дослідження готують щонайменше п'ять концентрацій вгеометричній серії відповідно до коефіцієнта концентрації, який неперевищує 2,2. Найнижча досліджувана концентрація не повинна матипомітного впливу на ріст водоростей. Найвища концентрація повиннаперешкоджати росту щонайменше на 50% відносно контрольного зразката, бажано, повністю зупиняти ріст.
Повтори та контролі
План дослідження повинен включати три повтори при кожнійдосліджуваній концентрації. Проводяться три контролі бездосліджуваної речовини, якщо це суттєво, проводяться три контроліз допоміжними речовинами. Якщо це виправдано, то план дослідженняможе змінюватись для того, щоб збільшити число концентрацій тазменшити число повторів при кожній концентрації.
Проведення дослідження
Досліджувані культури, які містять бажані концентраціїдосліджуваної речовини та бажану кількість інокулянту водоростей,готуються методом додавання аліквот вихідних розчинівдосліджуваної речовини до відповідних кількостей попередніхкультур водоростей (див. Додаток 1).
Пробірки з культурами струшують та поміщають у апарат длякультивування. Клітини водоростей зберігають в суспензії черезструшування, збовтування та барботування повітрям, для того, щобпокращити обмін газами та зменшити варіювання pH в досліджуванихрозчинах. Культури повинні зберігатись при температурі в межах від21 до 25 град.C, контрольованих при +- 2 град.C.
Щільність клітин в кожній пробірці визначається принаймніпісля 24, 48 та 72 годин після початку дослідження. Відфільтрованесередовище водоростей, що містить відповідну концентраціюдосліджуваного хімікату, використовується для визначення основи,під час використання вимірювань щільності клітин за непрямихметодів обрахунку.
Рівень pH вимірюється на початку дослідження та після72 годин. Рівень pH в контрольних зразках не повинен, як правило,відхилятись більш ніж на 1,5 одиниці під час дослідження.
Дослідження летких речовин
На даний момент не існує загально прийнятого способудослідження летких речовин. Якщо відомо, що речовина маєсхильність до випаровування, то можуть використовуватись закритітестові пробірки зі збільшеним вільним простором над поверхнеюрідини. Можливість дефіциту CO потрібно взяти до уваги під час
2
підрахунку вільного простору над поверхнею рідини в закритих
пробірках. Варіанти цього методу були запропоновані (див. в
посиланні (4)).
Потрібно робити спроби визначити кількість речовини, яказалишається у розчині, та рекомендується бути надзвичайнообережним під час інтерпретації результатів досліджень леткиххімікатів з використанням закритих систем.
Дослідження на граничний вміст
Використовуючи процедури, описані в цьому методі, дослідженняна граничний вміст може здійснюватись при 100 мг на літр для того,щоб показати, що EC є більшим ніж ця концентрація.
50
Якщо природа речовини така, що не можливо досягнутиконцентрації 100 мг на літр у воді для дослідження, то дослідженняграничного вмісту повинно здійснюватись при концентрації, якадорівнює розчинності речовини (або максимальній концентрації, якаутворює стабільні дисперсії) в середовищі, яке використовується(див. також в пункті 1.6.1.1).
Дослідження на граничний вміст повинно здійснюватисьпринаймні в трьох екземплярах, з таким же числом контрольнихзразків. Для дослідження на граничний вміст повиннівикористовуватись дві одиниці вимірювання росту (біомаса та темпросту).
Якщо у досліджені на граничний вміст зменшення середньогозначення різниці між дослідженням на граничний вміст таконтрольним зразком досягає 25% або більше у біомасі або темпіросту, то необхідно проводити повне дослідження.
2. ДАНІ ТА ОЦІНЮВАННЯ
Виміряна щільність клітин в досліджуваних культурах таконтрольних зразках подаються у формі таблиці разом зконцентраціями досліджуваної речовини та часом вимірювань. Середнєзначення щільності клітин для кожної концентрації досліджуваноїречовини та для контрольних зразків наноситься на графіквідповідно до часу (0-72 години), щоб побудувати криві росту.
Для того щоб визначити співвідношення концентрації/впливу,потрібно використовувати два наступних підходи. Деякі речовиниможуть стимулювати ріст при низьких концентраціях. Потрібно братидо уваги лише базові точки, що вказують на затримку між 0 та 100%.
2.1. ПОРІВНЯННЯ ДІЛЯНОК ПІД КРИВИМИ РОСТУ
Ділянка між кривими росту та горизонтальною лінією N = N 0може бути обрахована за формулою:
N - N N + N - 2N N + N - 2N
1 0 1 2 0 n-1 n 0
A = ------- x t + ------------- x (t - t ) + ... + --------------- x (t - t )
2 1 2 2 1 2 n n-1
Де:
A = ділянка
N = число клітин/мл при часі t (початок дослідження),
0 0
N = виміряне число клітин/мл при t
1 1
N = виміряне число клітин/мл на момент часу
n
t = час першого вимірювання після початку дослідження
1
t = час вимірювання n після початку дослідження
n th
n = кількість проведених вимірювань після початкудослідження.
Відсоток затримки росту клітин при кожній концентраціїдосліджуваної речовини (I ) обраховується за формулою:
A
A - A
c t
I = --------- x 100
A A
c
Де:
A = ділянка між кривою контролю росту та горизонтальною cлінією N = N .
0
A = ділянка між кривою росту при концентрації t та tгоризонтальній лінії N = N .
0
I = значення наносяться на графік на напівлогарифмічний Aпапір, або на напівлогарифмічний пробіт-папір в залежності відвідповідних концентрацій. Якщо вони наносяться на пробіт-папір, товсі одиниці розміщують на одній прямій лінії, або візуально абочерез комп'ютерну регресію.
EC оцінюється з лінії регресії через зчитування 50концентрацій, які еквівалентні 50% затримки (I = 50%). Щоб
A
визначити це значення однозначно відносно цього методу обрахунку,
пропонують використовувати символ E C . Важливо, щоб E C
b 50 b 50
вказувався з посиланям на відповідний період піддавання дії
(наприклад, E C (0-72 години)).
b 50
2.2. ПОРІВНЯННЯ ТЕМПІВ РОСТУ
Середній питомий темп росту (мю) для культур зекспоненціальним ростом може обраховуватись за формулою
ln N - ln N
n 0
мю = -------------
t - t
n 0
де t час на початку дослідження.
0
В якості альтернативи, середній питомий темп росту може бутивизначений з нахилу лінії регресії на графіку ln N відносно часу.
Відсоток затримки значень питомого темпу росту при кожній
концентрації (I ) обраховується за формулою
мю t
мю - мю
c t
I = ----------
мю t мю
c
Де:
мю = середнє значення контролю питомого темпу росту
c
мю = середнє значення питомого темпу росту для досліджуваної tконцентрації t
Зменшення відсотку середнього питомого темпу росту при кожнійдосліджуваній концентрації в порівнянні зі значенням контролюнаноситься на графік відносно логарифму концентрації. EC можна
50
прочитати з отриманого графіку. Щоб визначити однозначно EC
50
отримане цим методом пропонується використовувати символ E C .
r 50
Періоди вимірювань слід вказувати, наприклад, якщо значення
відноситься з періодом часу 0 та 72 годин, то символ стає E C
r 50
(0-72 години).
Примітка: питомий темп росту є логарифмічним терміном, аневеликі зміни темпу росту можуть призвести до великих змін вбіомасі. Отже, значення E C та E C не можна чисельно порівнювати.
b r
2.3. ОБРАХУНОК ВВВК
Відсутність Видимого Впливу Концентрації визначається черезвідповідну статичну процедуру для вибіркового порівняння багатьохвибірок (наприклад, аналіз варіативності та тест Дуннетта), звикористанням значень ділянок кривої росту А окремих реплікантів(див. в пункт 2.1.) або питомий темп росту (див. в пункт 2.2.).
3. ЗВІТУВАННЯ
Звіт про дослідження, якщо можливо, повинен містити наступнуінформацію:
- досліджувана речовина: дані хімічної ідентифікації,
- піддослідні організми: походження, лабораторна культура,номер породи, метод культивування,
- умови дослідження:
- дати початку та кінця дослідження та його тривалість,
- температура,
- склад середовища,
- прилади для культивування,
- pH розчинів на початку та в кінці дослідження (a якщоспостерігаються відхилення від норми pH більше ніж на 1,5 одиниці,то повинно надаватися пояснення),
- розчинник та метод, який використовується для розчиненнядосліджуваної речовини та концентрація розчинника в досліджуванихрозчинах,
- інтенсивність та якість освітлення,
- концентрації, що досліджуються (виміряні або номінальні).
- результати:
- щільність клітин для кожної пробірки, на кожній точцівимірювання та метод вимірювання щільності клітин,
- середнє значення щільності клітин,
- криві росту,
- графічне представлення співвідношення концентраційногоефекту,
- значення EC та метод обрахунку,
- ВВВК,
- інші ефекти, які спостерігаються.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of theCouncil C(81) 30 Final.
(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag'Hemmung der Zellvermehrung bei der Grunalge Scenedesmussubspicatus', in: Rudolph/Boje: bkotoxikologie, ecomed, Landsberg,1986.
(3) ISO 8692 - Water quality - Fresh water algal growthinhibition test with Scenedesmus subspicatusand Selenastrumcapricornutum.
(4) S.Galassi and M.Vighi - Chemosphere, 1981, vol. 10,1123-1126.
Додаток 1
Зразок процедури вирощування водоростей
Загальні спостереження
Метою вирощування, на основі попередньої процедури, єотримання культур водоростей для проведення токсикологічнихвипробувань.
Необхідно застосовувати відповідні методи для попередженнязараження водоростевих культур бактеріями (ISO 4833). Аксенічнікультури є бажаними, проте необхідною умовою є наявністьальголічно чистих культур.
Всі операції повинні проводитися в умовах стерильності зметою уникнення зараження бактеріями та іншими видами водоростей.Заражені культури мають вибраковуватися.
Процедури, необхідні для отримання водоростевих культур
Підготовка поживних розчинів (середовищ):
Необхідне середовище можливо підготувати шляхом розведенняосновного концентрованого розчину поживних речовин. Для отриманнятвердого середовища додають 0,8% агару. Використовуване середовищеповинне бути стерильним. Стерилізація в автоклаві може призвестидо втрати NH .
3
Вихідна культура:
Вихідні культури - це дрібні водоростеві культури, щорегулярно переносяться у свіже середовище у якості матеріалу дляпопередніх досліджень. Якщо ці культури не використовуютьсярегулярно, їх сіють штрихом у пробірках зі скошеним поживнимагарним середовищем. Такі культури переносять у свіже середовищещонайменше раз на два місяці.
Вихідні культури сіються у конічних колбах, що містятьнеобхідне середовище (об'ємом близько 100 мл). Якщо водоростівирощуються за температури 20 град.C при постійному освітленні,необхідно переносити їх щотижня.
В процесі перенесення відбирається певна кількість "старої"культури та переноситься у колбу зі свіжим середовищем задопомогою стерильних піпеток таким чином, що для швидкоростучихвидів початкова концентрація є приблизно у 100 разів меншою, ніж устарій культурі.
Швидкість росту для того чи іншого виду можна визначити задопомогою кривої росту. За наявності таких відомостей можливорозрахувати щільність, за якої певну культуру слід переносити унове середовище. Це необхідно зробити, перш ніж культура досягнефази деградації.
Прекультура:
Прекультура має давати необхідну для посіву тест-культуркількість водоростей. Прекультура вирощується за умов дослідженнята використовується, доки ще продовжується її експоненційнезростання, як правило, після спливання приблизно трьох днівінкубаційного періоду. У разі, якщо водоростеві культури містятьдеформовані або аномальні клітини, такі культури маютьвибраковуватися.
Додаток 2
Стандарт якості води ІСО 8692 - Міжлабораторна перевірка назатримку росту водоростей у свіжій воді для видів Scenedesmussubspicatus та Selenastrum capricornutum, проведена в16 лабораторіях із використанням дихромату калію, дала наступнірезультати:
------------------------------------------------------------------
| | Середні значення (мг/л) | Діапазон (мг/л) |
|-------------------+-------------------------+------------------|
|E C (0-72 год) | 0,84 0,53 | від 0,60 до 1,03 |
| r 50 | | |
|E C (0-72 год) | | від 0,20 до 0,75 |
| b 50 | | |
------------------------------------------------------------------
C.4. ВИЗНАЧЕННЯ "ПОВНОЇ" БІОРОЗКЛАДНОСТІ
ЧАСТИНА I. ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ
I.1. ВСТУП
Описано шість методів дослідження, що дозволяють перевіркухімічної речовини на предмет повної біорозкладності в аеробномуводному середовищі:
(a) Розкладання розчиненого органічного вуглецю (РОВ) (МетодC.4-A)
(b) Модифікована перевірка ОЕСР - Розкладання РОВ (МетодC.4-B)
(c) Виділення вуглекислого газу (CO ) (Модифікований метод 2Штурма) (Метод C.4-C)
(d) Манометрична спірометрія (Метод C.4-D)
(e) Закрита посудина (Метод C.4-E)
(f) ММТП (Міністерство міжнародної торгівлі тапромисловості - Японія) (Метод C.4-F)
Загальні та спільні міркування стосовно всіх шести методівнаведено у Частині I кожного методу. Особливості кожногоконкретного методу наведено в Частинах II-VII. У додаткахмістяться визначення, формули та інструктивна документація.
Міжлабораторний зіставний аналіз ОЕСР, проведений 1988 року,продемонстрував, що всі ці методи дають надійні результати. Однакзалежно від фізичних характеристик речовини, що підлягаєдослідженню, може бути надано перевагу тому чи іншому методу.
I.2. ВИБІР НАЛЕЖНОГО МЕТОДУ
Для вибору найбільш доречного методу необхідна інформація пророзчинність, тиск пари та адсорбційні характеристики. Необхіднотакож знати хімічну структуру формули для підрахунку теоретичнихта/або отриманих у результаті контрольного вимірювання значеньпараметрів, наприклад, ТПК, ТВГ, РОВ, ЗОВ, ХПК (див. Додатки 1 та2).
Досліджувані хімічні речовини, що розчиняються у водіпринаймні до 100 мг/л, можуть підлягати оцінюванню за допомогоюбудь-якого з методів за умови, що вони не є леткими абоадсорбуючими. Методи, що підходять для хімічних речовин, якіпогано розчиняються у воді, є леткими або адсорбуючими, вказано уТаблиці 1. Спосіб роботи зі слабко водорозчинними та леткимихімічними речовинами описано в Додатку 3. Помірно леткі хімічніречовини можуть підлягати дослідженню за допомогою методурозкладання РОВ за умови, що у дослідних посудинах (закоркованихналежним чином) достатній об'єм для газу. В такому разі необхідневстановлення абіотичного регулювання з урахуванням будь-якихфізичних втрат.
Таблиця 1:
Застосовність методів дослідження
------------------------------------------------------------------
| Дослідження |Метод аналізу | Підходить для речовин, що є: |
| | |----------------------------------|
| | | слабко |леткими|адсорбуючими|
| | | розчинними | | |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Розкладання |Розчинений | - | - | +/- |
|РОВ |органічний | | | |
| |вуглець | | | |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Мод. |Розчинений | - | - | +/- |
|розкладання |органічний | | | |
|ОЕСР |вуглець | | | |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Виділення CO |Спірометрія: | + | - | + |
| 2 |виділення CO | | | |
| | 2 | | | |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Манометрична |Манометрична | + | +/- | + |
|спірометрія |спірометрія: | | | |
| |поглинання | | | |
| |кисню | | | |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|Закрита |Спірометрія: | +/- | + | + |
|посудина |розчинений | | | |
| |кисень | | | |
|--------------+--------------+-------------+-------+------------|
|ММТП |Спірометрія: | + | +/- | + |
| |поглинання | | | |
| |кисню | | | |
------------------------------------------------------------------
Для інтерпретації отриманих результатів необхідна інформаціяпро чистоту або відносні пропорції основних компонентів матеріалудля дослідження, особливо якщо ці результати є низькими абограничними.
Інформація про токсичність досліджуваної хімічної речовинивідносно бактерій (Додаток 4) може бути надзвичайно корисною привиборі необхідної для дослідження концентрації, а також важливоюдля правильної інтерпретації низьких значень біорозкладності.
I.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
З метою перевірки процедури еталонні хімічні речовини, щовідповідають критеріям повної біорозкладності, досліджують шляхомвстановлення відповідної колби одночасно із серією звичайнихдослідів.
Для цього підходять такі хімічні речовини, як анілін(свіжоперегнаний), ацетат натрію та бензоат натрію. Всі ціеталонні хімічні речовини розкладаються при використанні цихметодів навіть без спеціального додавання посівного матеріалу.
Було внесено пропозицію стосовно пошуку еталонної хімічноїречовини, повністю біорозкладної, але водночас такої, щопотребувала б додавання посівного матеріалу. З цією метою булозапропоновано гідрофталат калію, однак необхідно отримати більшеданих стосовно цієї речовини перед визнанням її прийнятноюеталонною речовиною.
Під час проведення спірометричних досліджень сполуки, щомістять азот, можуть вплинути на поглинання кисню черезнітрифікацію (див. Додатки 2 та 5).
I.4. ПРИНЦИП МЕТОДІВ ДОСЛІДЖЕННЯ
Розчин або суспензія досліджуваної речовини у мінеральномусередовищі засівається та інкубується в аеробних умовах у темрявіабо при розсіяному освітленні. Кількість РОВ у розчині дляаналізу, пов'язана з посівним матеріалом, має підтримуватися наякомога нижчому рівні порівняно з кількістю РОВ, пов'язаною здосліджуваною речовиною. Враховується також ендогенна активністьпосівного матеріалу, для чого паралельно проводяться "сліпі"досліди із використанням посівного матеріалу, але бездосліджуваної речовини, хоча ендогенна активність клітин занаявності такої речовини не буде точно відповідати активності приендогенному контролі. Паралельно аналізується еталонна речовина зметою перевірки дії процедур.
В цілому, після розкладання відбувається визначення такихпараметрів, як РОВ, виділення CO поглинання кисню; при цьому
2
через достатньо невеликі проміжки часу робляться заміри для
визначення початку та кінця процесу біорозкладання. За допомогою
автоматичних респірометрів постійно проводиться вимірювання. Іноді
РОВ вимірюється на доповнення до іншого параметру, але це, як
правило, робиться лише на початку та наприкінці дослідження. З
метою оцінювання первинного розкладання досліджуваної речовини та
визначення концентрації будь-яких утворених проміжних речовин
також можливе проведення спеціального хімічного аналізу
(обов'язково для дослідження ММТП).
Як правило, дослідження триває 28 днів. Однак дослідженняможуть завершитися і швидше, ніж за 28 днів, щойно кривабіорозкладання сягне плато щонайменше для трьох замірів.Дослідження можуть також продовжуватися і по закінченні 28 днів,якщо крива демонструє, що процес біорозкладання почався, алестаном на 28-й день плато досягнуто не було.
I.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
I.5.1. Відтворюваність
З урахуванням природи біорозкладання та змішаних популяційбактерій, що використовуються як посівний матеріал, заміри маютьпроводитися щонайменше по два рази.
Досвід підтверджує, що чим більша концентраціямікроорганізмів, початково доданих у досліджуване середовище, тимменше буде розбіжність між репліками. Кільцеві дослідження такожпродемонстрували, що можливі суттєві розбіжності між результатами,отриманими в різних лабораторіях, але для сполук, що легкобіорозкладаються, як, правило, рівень узгодженості доволі високий.
I.5.2. Достовірність дослідження
Дослідження вважається достовірним, якщо різниця між крайнімиповторюваними відщеплення досліджуваної хімічної речовини настадії плато наприкінці дослідження або наприкінці 10-денногопроміжку часу, відповідно, менша за 20%, а також якщо процентрозкладання еталонної речовини сягнув рівня повної біорозкладностіна 14-й день. Якщо не виконується будь-яка з цих умов, дослідженнянеобхідно повторити. З огляду на високу точність вищезгаданихметодів низькі значення не обов'язково означають, що досліджуванаречовина не є біорозкладною в умовах навколишнього середовища;вони можуть вказувати на те, що необхідно провести додатковідослідження для встановлення біорозкладності.
Якщо при проведенні токсикологічного дослідження, що включалов себе як досліджувану речовину, так і еталонну хімічну речовину,рівень розкладання протягом 14 днів склав менш ніж 35% (за ознакоюРОВ) або менш ніж 25% (за ознакою ТПК або ТВГ), можна припустити,що досліджувані хімічні речовини є інгібуючими (див. також Додаток4). В такому разі необхідно повторити серію дослідів, заможливості зменшивши концентрацію досліджуваної хімічної речовинита/або підвищивши концентрацію посівного матеріалу, але не більше,ніж до 30 мг сухих речовин на літр.
I.6. ЗАГАЛЬНІ ПРОЦЕДУРИ ТА ПІДГОТОВКА
Загальні умови дослідження підсумовані у Таблиці 2. Матеріалидля дослідів та інші умови експериментів, що стосуютьсябезпосередньо конкретних дослідів, описані нижче під заголовкамивідповідних дослідів.
Таблиця 2
Умови дослідження
