Інструкція з проведення тестування племінних тварин за ДНК-маркерами

1.1. Ця Інструкція, розроблена на виконання Закону України "Про племінну справу у тваринництві", визначає порядок проведення тестування за ДНК-маркерами у тваринництві, яке є невід'ємною частиною генетичної експертизи походження та аномалій племінних тварин.

1.2. Тестування за ДНК-маркерами - визначення генотипу тварини за окремими генами або локусами геному на основі аналізу ДНК.

Аналіз ДНК - визначення алельного стану локусу. Генотипи можуть визначатися за окремими генами, важливими в біологічному та господарському відношенні, за високополіморфними локусами ДНК та за будь-якими іншими локусами геному сільськогосподарських тварин.

1.3. Мета тестування - виявлення тварин із спадковими вадами розвитку та особливостями генотипу за окремими локусами.

1.4. Тестування за ДНК-маркерами проводять один раз за життя тварини.

1.5. Організацію та проведення відбору зразків біоматеріалу для тестування за ДНК-маркерами здійснюють ветеринарні спеціалісти господарств/власників тварин.

1.6. Тестування за ДНК-маркерами здійснюють на підприємствах (лабораторіях) генетичного контролю атестовані фахівці із спеціальною освітою, які пройшли спеціальну підготовку щодо проведення ДНК-тестування.

У цій Інструкції наведені нижче терміни вживаються в такому значенні:

алель - одна з альтернативних структурних форм стану гена;

біоптат - частка тканини (органа), отримана прижиттєво для дослідження;

генотип - сукупність генів організму;

ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота, речовина спадковості, молекула, яка кодує генетичну інформацію і здатна до самовідновлення;

ДНК-ампліфікація - множинне копіювання певної ділянки ДНК за допомогою ПЛР;

електрофореграма - результат розділення біополімерів в електричному полі;

електрофорез - фізичний метод розділення біополімерів в електричному полі;

ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція;

праймер - коротка послідовність нуклеотидів, яка використовується в ПЛР;

рестрикт - фрагмент ДНК, отриманий у результаті обробки ДНК рестриктазою;

рестриктаза - бактеріальний фермент, що розщеплює молекулу ДНК у специфічних ділянках (сайтах пізнавання);

скринінг - метод або комплекс методів, що дає змогу ідентифікувати окремий об'єкт шляхом перегляду великої кількості об'єктів;

супернатант - надосадова рідина;

BLAD - (Bovine Leucocyte Adhesion Deficiency) синдром дефіциту адгезійності лейкоцитів великої рогатої худоби;

RYR - (rianodine receptor gene, ріанодин-рецепторний ген). Виконує головну роль у контролі стресчутливості свиней.

3.1. Як біопробу для тестування за ДНК-маркерами використовують будь-який біологічний матеріал тварини: кров, сперму, біоптат тощо.

3.1.1. Відбір крові

Проводять в антикоагулянт або на марлевий тампон. За умови використання марлевого тампона його просякують відібраною кров'ю та висушують на повітрі. Для ДНК-аналізу достатньо 0,5 мл рідкої крові або кров'яної плями на марлевому тампоні розміром 5х5 мм.

Умови зберігання крові:

рідкої - 5-7 діб при температурі 4 град.С або декілька місяців при температурі -20 град.С;

висушеної - у герметично закритому сухому пакеті до 5 років за кімнатної температури або в холодильнику при температурі 4 град.С. Висушену кров можна пересилати поштою до підприємства (лабораторії) генетичного контролю.

3.1.2. Відбір та зберігання сперми

Відбирають 0,5-2 мл нативної сперми. Сперму для виділення ДНК зберігають за умов, аналогічних для зберігання рідкої крові.

3.1.3. Відбір біоптатів

Біоптати можуть мати різне походження. Для ДНК-аналізу можна використовувати вищипи з вуха, які залишаються при міченні тварин. Термін зберігання шматочків розміром від 5х5 мм при температурі 4 град.С - 3-4 доби, у замороженому стані (-20 град.С і нижче) - необмежений час.

3.1.4. Під час відбору кожну пробу маркують індивідуальним номером. Складають акт про відбір проб у довільній формі, у якому вказують повну назву господарства/власника, де зроблено відбір біоматеріалу, час відбору, його вид, записують номери тварин та відповідні номери проб.

3.2. Виділення ДНК проводять за декількома методиками в залежності від мети дослідження.

За умови, якщо метою дослідження є скринінговий експрес-аналіз певної групи тварин на наявність генетичних аномалій чи особливостей, ДНК виділяють експрес-методом у невеликій кількості, термін зберігання проби 1-2 доби.

З метою зберігання проби тривалий час і використання для ряду аналізів - ДНК виділяють відповідним методом, така ДНК-проба може зберігатися декілька років.

3.3. Методи виділення ДНК

3.3.1. Експрес-метод виділення ДНК з різних тканин за допомогою реагента "Chelex-100".

3.3.1.1. Виділення ДНК із крові:

до 2-500 мкл крові або гомогенізованих тромбів додають 1000 мкл стерильної дистильованої води та перемішують на мікрозмішувачі типу "Vortex";

суміш інкубують протягом 15-30 хв за кімнатної температури, періодично перемішують шляхом струшування;

центрифугують протягом 1 хв при 6000 об/хв;

обережно видаляють надосадову рідину, залишають 20-30 мкл рідини над осадом;

додають 170-180 мкл 5%-ного стерильного водяного розчину "Chelex-100";

інкубують протягом 15-30 хв. при температурі 56 град.С;

ретельно перемішують шляхом струшування та витримують 8 хв. на водяній бані при температурі 100 град.С;

ретельно перемішують шляхом струшування;

центрифугують протягом 5 хв. при 6000 об/хв.

Для ампліфікації використовують 5 мкл надосадової рідини, яка містить ДНК. Зберігають зразки при температурі -20 град.С. Після кожного розморожування зразки перемішують та центрифугують протягом 5 хв. при 6000 об./хв.

3.3.1.2. Виділення ДНК із сперми:

до 3 мкл нативної сперми додають 200 мкл 5% стерильного водного розчину "Chelex-100"

до суміші додають 2 мкл протеїнази К концентрацією 10 мг/мл та 7 мкл 1 М дітіотрейтолу;

обережно перемішують шляхом струшування та інкубують зразки 30-60 хв. при температурі 56 град.С;

перемішують уміст пробірок на мікрозмішувачі 5-10 секунд та інкубують 8 хв. при температурі 100 град.C.;

перемішують на мікрозмішувачі 5-10 секунд та центрифугують 2-5 хв. при 8000-10000 об./хв.

Зразки зберігають при температурі -20 град.С. Для ампліфікації використовують 5 мкл надосадової рідини, яка містить ДНК.

Концентрацію та ступінь очищення ДНК визначають спектрофотометрично (спектрофотометр СФ-46) при довжині хвилі 260 та 280 нанометрів. Нативність ДНК визначають шляхом електрофорезу в 1% агарозному гелі за умови відсутності "шлейфу" фрагментів ДНК та інтенсивності флуоресценції бромистого етидію при ультрафіолетовому опромінюванні електрофореграм.

3.3.2. Метод виділення ДНК за Соколовим-Джемелинським (для проведення ряду аналізів і тривалого зберігання препаратів ДНК):

5 мл крові, що містить антикоагулянт змішують з 30 мл холодного (4 град.С) буферу для лізису клітин (0,32 М сахарози, 5 мМ MgCl2, 1% Тритон Х-100, 0,01М трис-HCl (рН 7,6)) і витримують при температурі 4 град.С протягом 30 хв.;

ядра клітин осаджують шляхом центрифугування при 4000 об/хв. Термін осаджування 30 хв. при температурі 4 град.С;

осад ресуспендують у розчині, що містить 1,5 мл солі ЕДТА (75 мМ NaCl, 25 mM ЕДТА (рН 8,0)), 200 мкл 10% SDS, 25 мкл (10 мг/мл) протеїнази К, та інкубують протягом 16 годин при температурі 37 град.С;

до одержаного лізату додають 0,75 мл 5М ацетату калію (рН 4,8), обережно перемішують, витримують 30 хв при температурі 4 град.С та центрифугують (40 хв., 5000 об./хв., 4 град.С);

до супернатанту додають два об'єми холодного (4 град.С) 96% етанолу та вимотують ДНК на скляну паличку;

підсушують за кімнатної температури, ДНК двічі промивають 70% етанолом та розчиняють у 0,5 мл буферу ТЕ (10 мМ Тріс-HCl (pH 7,4)), 1 мМ ЕДТА (рН 8,0) або 0,5 мл деіонізованої води.

Проби ДНК зберігають при температурі -20 град.С.

3.4. ДНК-ампліфікація локусів геному, вибраних для аналізу

Для ДНК-ампліфікації використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Суть методу - багатократний направлений синтез ДНК із дезоксирибонуклеотидтрифосфатів, in vitro, за допомогою термостабільної ДНК-полімерази. Специфічність синтезу (ампліфікації) вибраної ділянки ДНК визначається синтетичними праймерами-затравками.

3.4.1. Обладнання для проведення ПЛР:

ампліфікатор (інша назва приладу - термоциклер або термостат, що програмується для проведення ампліфікації);

автоматичні мікропіпетки (0,5 - 200 мкл) для відбору зразків;

центрифуга для пробірок типу "Eppendorf" (частота обертання ротора до 14000 об./хв.);

прилади для вертикального (у поліакриламідному гелі) та горизонтального ( в агарозному гелі) електрофорезу;

трансілюмінатор;

система для фото- або цифрової документації результатів.

3.4.2. Реактиви для проведення ПЛР:

термостабільна ДНК-полімераза;

специфічні праймери-затравки;

реакційна суміш для проведення ПЛР (уміщує реакційний буфер для проведення ПЛР з MgCl2 або без нього, оптимізований для конкретної термостабільної ДНК-полімерази, та суміш чотирьох дезоксинуклеотид-трифосфатів);

високоочищена (деіонізована) вода.

Реактиви поставляються у готовому вигляді фірмами-виробниками.

3.4.3. Проведення реакції

В ампліфікаційну пробірку (0,5 мл) уносять компоненти реакції: реакційну суміш, праймери-затравки для синтезу вибраної ділянки ДНК, термостабільну ДНК-полімеразу, зразок ДНК тварини і воду, доводячи до кінцевого об'єму 25 мкл.

Конкретна кількість реактивів (мкл) залежить від концентрації, у якій вони поставляються фірмами-виробниками. Реакційна суміш завжди вміщує 1-кратний реакційний буфер, а кількість у ній іонів Mg ++ може коливатися в діапазоні від 1,5 до 3 мМ. Кількість полімерази, що вноситься, залежить від її активності. Уносять 1-2 одиниці активності фермента (0,1-0,5 мкл). Загальну кількість реактивів розраховують у відповідності до числа зразків, які ампліфікують. Збирають в окрему пробірку всі компоненти реакції, крім зразка ДНК, після ретельного перемішування розносять в окремі пробірки. Пробірки заздалегідь маркують відповідно до зразків ДНК. Для запобігання випаровуванню на реакційну суміш до кожної пробірки наносять шляхом нашаровуванню мінеральне масло.

Для ДНК-діагностики стрес-синдрому у свиней як один з можливих варіантів використовують праймери:

RYR 1: 5' - GTGCCTGATGTCCTGTGTTCCCT - 3';

RYR 2: 5' - CTGGTGACATAGTTGATGAGGTTTG - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 134 пари нуклеотидів (п.н.).

Для ДНК-аналізу синдрому дефіциту адгезійності лейкоцитів великої рогатої худоби (BLAD) використовують праймери:

F - 5' - TGAGACCAGGTCAGGCATTGCGTTCA - 3';

R - 5' - CCCCCAGCTTCTTGACGTTGACGAGGTC - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 132 п.н.

В ампліфікаційній суміші під час ДНК-тестування великої рогатої худоби за геном гормону росту використовують праймери:

F - 5' - CCGTGTCTATGAGAAGC - 3';

R - 5' - GTTCTTGAGCAGCGCGT - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 428 п.н.

Для свиней використовують праймери:

BG3M - 5' - ACCGGCTGTGATGGCTGCAGGCAA - 3';

BG4 - 5' - AGGTACTCCATCCAGAACGCCCAG - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 659 п.н.

Під час ДНК-тестування за геном капа-казеїну використовують праймери:

Bocas A: 5' - ATGTGCTGAGCAGGTATCCTAGTTATGG - 3';

Bocas B: 5' - CCAAAAGTAGAGTGCAACAACACTGG - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 883 п.н.

Для ампліфікації фрагмента гена рецептора естрогена використовують праймери:

ESR 3: 5' - СССTCTATGACCTGCTGCTG - 3';

ESR 4: 5' - TCAGATTGTGGTGGGGAAGTTC - 3'.

У результаті ПЛР синтезується фрагмент ДНК розміром 185 п.н.

Після приготування ампліфікаційної суміші пробірку поміщають в ампліфікатор. Для кожної пари праймерів використовують оптимізований температурно-часовий режим ампліфікації.

3.4.4. Два режими ампліфікації

3.4.4.1. Для ампліфікації фрагмента ріанодинрецепторного гена (RYR1) режим ампліфікації:

1-й етап

94 град.С - 4 хв.

2-й етап

94 град.С - 20 сек.

69 град.С - 20 сек.

72 град.С - 20 сек.

Цикли повторюються 30 разів.

3-й етап

72 град.С - 4 хв.

3.4.4.2. Для ампліфікації фрагмента гена гормону росту свиней режим ампліфікації:

1-й етап

94 град.С - 4 хв.

2-й етап

94 град.С - 20 сек.

57 град.С - 20 сек.

72 град.С - 20 сек.

Цикли повторюються 30 разів.

3-й етап

72 град.С - 4 хв.

Після ампліфікації пробірку з реакційною сумішшю зберігають до використання не більше 24 годин при температурі 4 град.С або заморожують для довготривалого зберігання.

3.5. Обробка ампліфікованих фрагментів рестриктазою

Для ДНК-діагоностики стрессиндрому свиней, синдрому дефіциту адгезивності лейкоцитів великої рогатої худоби (BLAD), дефіциту синтезу уридинмонофосфату в худоби, цитрулінемії при ДНК-тестуванні за геном гормону росту, рецептора естрогену та капа-казеїну проводять гідроліз ампліфікованого фрагмента ДНК специфічною рестриктазою.

Рестриктазний гідроліз передбачає інкубування ампліфікованої ДНК із рестриктазою в буфері, склад якого спеціально оптимізований для конкретного ферменту рестрикції.

Детальні умови рестриктазного гідролізу наводяться в паспортах до ферментів і розрізняються в залежності від фірми - виробника цього препарату.

Для рестриктазного гідролізу ампліфікованого фрагмента при діагностиці стрессиндрому свиней використовують фермент рестрикції, який має назву Hha I. При діагностиці BLAD - рестриктази Tag I та Hae III. Для ДНК типування за геном гормону росту у великої рогатої худоби використовують фермент - Alu I, свиней - Bsu RI, Bam HI тощо, свиней - Msp1. Тестування великої рогатої худоби за геном капа-казеїну потребує обробки фрагмента ампліфікації рестриктазою PstI, тестування свиней за геном рецептора естрогену - AvaI. Для кожного з наведених ферментів існують ферменти-прототипи, які мають інше походження та іншу назву, але специфічність їх дії на ДНК така сама.

3.6. Електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації або рестриктів ДНК

Для перевірки якості ампліфікації та аналізу продуктів рестрикції застосовують метод електрофоретичного розділення ДНК-фрагментів в агарозному (2%- та 4%) або поліакріламідному гелях.

3.6.1. Приготування 2% агарозного гелю:

зважують 2 г агарози і вносять у колбу ємністю 200 мл;

інкубують на водяній бані (100 град.С) до повного розплавлення агарози;

готують форму для заливання гелю;

охолоджують розплавлену агарозу орієнтовно до температури 50-60 град.С та заливають у форму;

сформований агарозний гель охолоджують та розміщують у приладі для електрофорезу.

Під час приготування 4% агарозного гелю проводять ті самі маніпуляції, але зважують 4 г агарози.

3.6.2. Приготування поліакриламідного гелю

Готують стоковий розчин акриламіду (30% акриламіду та 1% N,NТ- метиленбісакриламіду), 3% розчин персульфату амонію (розчин зберігають не більше тижня при температурі 4 град.С) та х10 ТВЕ (десятикратний трис-боратний буфер). Готують розчин гелю відповідно до структури поліакриламідного гелю (додаток 1).

У колбу ємністю 200 мл уносять відповідну кількість реагентів для приготування акриламідного гелю вибраної концентрації в такому порядку:

3% персульфат амонію.

Суміш заливають у рамку для електрофорезу, у якій розміщено гребінку для формування слотів для нанесення проб, і залишають за кімнатної температури на 1,5-2 години для полімеризаціїї.

3.6.3. Приготування проби ДНК для електрофорезу:

до 6 частин розчину ДНК додають 2 частини буферу для нанесення проби (буфер для нанесення проби: 0,025% розчин бром-фенолового синього, який готують на 30% гліцерині).

3.6.4.Проведення електрофорезу:

у слоти сформованого агарозного або поліакриламідного гелю вносять 2-20 мкл готової проби ДНК (після ампліфікації або після рестрикції ампліфікатів);

в одну з кишень слотів уносять маркерну ДНК, за допомогою якої визначають розміри ДНК-фрагментів;

умикають блок живлення для електрофорезу (напруга 5 В/см) та проводять електрофоретичне фракціонування ДНК протягом 1,5-4 годин, вимикають блок живлення;

переносять гель у ванночку для фарбування розчином бромистого етидію (0,5 мкг/мл) на 4-6 хв.;

багатократно відмивають гель проточною водою та розміщують на трансілюмінаторі для візуальної детекції результатів.

За необхідності отриману електрофореграму фотографують.

Для визначення розмірів ДНК у пробах, що аналізуються як маркерна ДНК, використовують:

ДНК бактеріофага (лянда), яка гідролізована рестриктазою Pst I або EcoRI, Hind III;

гідролізовану рестриктазою ДНК однієї із плазмід: pBR322, pUC 19 тощо;

так звану ледерну ДНК, яка вміщує фрагменти ДНК розміром, що є кратним 100 п.н.

Під час діагностики стрес-синдрому свиней після обробки рестриктазою Hha I ампліфікований ДНК-фрагмент може розділятися на два фрагменти розміром 81 та 53 п.н., що відповідає гомозиготному домінантному генотипу RYR T/RYR T, на три фрагменти розміром 134, 81 та 53 п.н., що відповідає гетерозиготному генотипу RYR T/RYR С, і залишатися нерозділеним - генотип RYR С/RYR С - гомозиготний рецесивний.

Під час діагностики синдрому дефіциту адгезійності лейкоцитів великої рогатої худоби (BLAD) після рестриктного гідролізу ампліфікату можуть виникати такі варіанти фрагментів рестрикції:

за умови використання рестриктази Tag I - 71 та 61 п.н. генотип NN; 132, 71, 61 п.н. - NB; 132 п.н. - ВВ;

за умови використання рестриктази Hae III - 87 та 45 п.н. генотип NN; 87, 68, 45, 19 п.н. - NB; 68, 45, 19 п.н. - ВВ.

При тестуванні свиней за геном гормону росту можливі такі варіанти фрагментів рестрикції:

374, 137п.н. - генотип АА; 374, 137, 274 п.н. - АВ; 374, 274 п.н. - ВВ.

Під час тестування великої рогатої худоби за геном гормону росту при використанні ферменту Alu I можливі такі варіанти фрагментів рестрикції:

265, 96, 51 п.н. - генотип LL; 265, 147, 96, 51 п.н. - LV; 265 та 147 п.н. - VV.

Під час ДНК-тестування за геном капа-казеїну виникають такі варіанти фрагментів рестрикції:

106, 306 та 471 п.н. - генотип АА; 106, 306, 471 та 777 п.н. - АВ; 106 та 777 п.н. - ВВ.

При тестуванні свиней за геном рецептора естрогену: фрагменти рестрикції 76 та 109 п.н. відповідають генотипу -/-; 76, 62 та 47 п.н. - +/+; 109, 76, 62 та 47 п.н. - -/+.

Результати тестування тварин за ДНК-маркерами заносяться до форми N 7-ГЕН "Протокол тестування тварин за ДНК-маркерами" (додаток 2).

У формі вказують:

вид тварин - у графі "Вид тварин";

ідентифікаційний номер тварини - у графі "Ідентифікаційний N";

марку і номер у Державній книзі племінних тварин (за наявності) - у графі "Марка і N у ДКПТ";

повну назву породи, до якої належить тварина, - у графі "Порода";

породність тварини - у графі "Породність";

кличку тварини - у графі "Кличка";

стать тварини - у графі "Стать";

число, місяць та рік народження тварини - у графі "Дата народження";

назву господарства/власника та поштову адресу - у графі "Місце народження";

назву господарства/власника та поштову адресу - у графі "Власник".

висновки щодо результатів досліджень - у графі "Висновок".

У графі "Підприємство (лабораторія) генетичного контролю" зазначають повну назву підприємства (лабораторії) генетичного контролю, яке видає протокол.

Форма N 7-ГЕН підписується керівником підприємства (лабораторії) генетичного контролю та завіряється печаткою підприємства.