Про затвердження державних санітарних норм і правил "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I-IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами"

На виконання Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення"

1. Затвердити державні санітарні норми і правила "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I-IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами" (далі - Правила), що додаються.

2. Заступникам головного державного санітарного лікаря України, головному лікарю Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України, головному державному санітарному лікарю Автономної Республіки Крим, головним державним санітарним лікарям областей, міст Києва та Севастополя, на водному, залізничному, повітряному транспорті, Міністерства оборони України, Міністерства внутрішніх справ України, Служби безпеки України, Адміністрації Державної прикордонної служби України, Державного департаменту України з питань виконання покарань, Державного управління справами України, об'єктів з особливим режимом роботи:

2.1. Прийняти затверджені цим наказом Правила до керівництва та використання при здійсненні державного санітарно-епідеміологічного нагляду;

2.2. Довести Правила до відома органів державної влади, підвідомчих установ державної санітарно-епідеміологічної служби, місцевих державних адміністрацій для використання у практичній діяльності.

3. Директору Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренку А.М. забезпечити реєстрацію цього наказу в Міністерстві юстиції України.

4. Скасувати наказ МОЗ України від 24.12.2007 N 852 "Про затвердження державних санітарних норм і правил "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I-IV груп патогенності, молекулярно-генетичними методами".

5. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренка А.М.

1.1. Державні санітарні норми і правила "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I-IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами" (далі - Правила), розроблені на підставі Законів України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення", "Про захист населення від інфекційних хвороб" та постанови Кабінету Міністрів України від 22.06.99 N 1109 "Про затвердження Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні".

1.2. Правила встановлюють вимоги до приміщень лабораторій і порядку організації і проведення в них робіт з патогенними біологічними агентами (далі - БПА) I-IV груп патогенності або матеріалом, підозрюваним на їх вміст, з використанням молекулярно-генетичних методів, заснованих на полімеразній ланцюговій реакції (далі - ПЛР).

1.3. Правила регламентують виконання досліджень методом ПЛР із застосуванням обладнання, реагентів, тест-систем, дозволених до використання на території України відповідно до наказу МОЗ України від 04.08.2005 N 393 "Про затвердження Переліку медичних виробів, що підлягають державній реєстрації (перереєстрації) в Україні", зареєстрованому в Міністерстві юстиції України 19.10.2005 за N 1229/11509.

1.4. Правила поширюються на лабораторії (відділи, відділення) мікробіологічного профілю установ охорони здоров'я (далі - лабораторії), закладів науки та освіти, спеціалізовані лабораторії незалежно від їх підпорядкування та форм власності, що проводять молекулярно-генетичні дослідження з БПА I-IV груп патогенності або матеріалом, підозрюваним на їх вміст, дослідження з контролю об'єктів довкілля, харчових продуктів та продовольчої сировини за показниками безпеки, а також на наявність генетично-модифікованих джерел (далі - ПЛР-лабораторії).

1.5. Контроль за виконанням цих Правил здійснює Державна санітарно-епідеміологічна служба України.

1.6. В основі ПЛР лежить багатократне копіювання певного фрагмента дезоксирибонуклеїнової кислоти (далі - ДНК) за допомогою ферменту термостабільної ДНК-полімерази та специфічних праймерів. ПЛР дозволяє виявити специфічну ділянку генома біологічного агента.

1.7. Метод ПЛР має високу чутливість, специфічність, забезпечує можливість роботи практично з будь-яким видом біологічного матеріалу, пробами з об'єктів довкілля, включаючи харчові продукти, є експрес-методом, який дозволяє виконувати аналіз протягом 4-8 годин.

Специфічність ПЛР визначається здатністю праймерів точно "розпізнавати" певну ділянку нуклеїнової кислоти (далі - НК) і зв'язуватися з нею за принципом компліментарності.

1.8. За способом детекції продуктів ампліфікації розрізняють декілька форматів реакції:

- класичний (облік результатів реакції за допомогою електрофорезу);

- ПЛР з детекцією за допомогою гібридизаційно-імуноферментного аналізу (далі - ГІФА);

- ПЛР з флуоресцентною детекцією у "кінцевій точці" (після закінчення реакції);

- ПЛР з флуоресцентною детекцією у режимі "реального часу" (Real-Time PCR).

1.8.1. При використанні ПЛР в класичному форматі детекцію ампліконів здійснюють за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Результат детекції фотографують або сканують і архівують в пам'яті комп'ютера. Метод не передбачає кількісного визначення.

1.8.2. ПЛР з детекцією ГІФА виконується за допомогою специфічних тест-систем з внутрішніми ДНК-зондами. Метод дозволяє в ряді випадків значно підвищити чутливість і специфічність детекції ПЛР-продуктів.

1.8.3. ПЛР з флуоресцентною детекцією у "кінцевій точці" дозволяє реєструвати результат ампліфікації за допомогою детекторів типу "Джин" або "Ала 1/4" після закінчення реакції ("end-point detection") не відкриваючи пробірок. Цей метод також не є кількісним.

1.8.4. Для ПЛР у "реальному часі" також використовують флуоресцентно мічені олігонуклеотидні зонди. Цей метод дозволяє проводити моніторинг і кількісний аналіз накопичення продуктів реакції, оскільки кінетика накопичення пов'язана із вихідною кількістю матриці НК. Використання математичних методів аналізу результатів дослідження дозволяє автоматизувати їх інтерпретацію, тим самим зняти проблему суб'єктивної оцінки результатів електрофореграм.

1.8.5. У практичних лабораторіях, крім ПЛР, може використовуватись метод виявлення НК, заснований на одночасному застосуванні трьох ферментів: зворотної транскриптази, РНК-ази та РНК-полімерази T7-NASBA (Nucleic Acids Sequence Based Amplification) у "реальному часі". На відміну від ампліфікації в ПЛР, NASBA є ізотермічною реакцією, яка здійснюється при температурі +41 град.С.

1.9. ПЛР використовують як експрес-метод діагностики інфекційних хвороб, індикації БПА в пробах з об'єктів довкілля та продуктах харчування, для визначення епідемічної значимості збудника на підставі виявлення генетичних маркерів вірулентності, визначення молекулярних механізмів резистентності мікроорганізмів до антимікробних засобів, для здійснення епідеміологічного нагляду за інфекційними хворобами, для верифікації сумнівних результатів діагностичних досліджень іншими методами, виявлення модифікованої НК в харчових продуктах, а також у наукових цілях.

1.10. Проведення досліджень методом ПЛР або NASBA вимагає дотримання правил біологічної безпеки, а також певних вимог до організації і проведення аналізу з метою запобігання контамінації досліджуваних проб НК та продуктами ампліфікації і отримання, в наслідок цього, хибнопозитивних або хибнонегативних результатів.

У цих Правилах застосовуються такі терміни, визначення та скорочення:

Ампліфікація - процес багатократного примноження (копіювання) специфічної ділянки ДНК (кДНК) обмеженого (фланкованого) праймерами.

Амплікони - продукти ПЛР, що синтезуються в процесі ампліфікації ДНК-матриці.

Аліквота - (aliquot quantity) - певний, точно виміряний об'єм речовини, що є частиною цілого.

Біологічні патогенні агенти - патогенні для людини мікроорганізми (бактерії, віруси, хламідії, рикетсії, найпростіші, гриби, мікоплазми), генно-інженерно-модифіковані мікроорганізми, отрути біологічного походження (токсини), гельмінти, а також будь-які об'єкти і матеріали (включаючи польовий, клінічний, секційний), підозрілі на вміст перерахованих агентів.

Біологічна безпека - система організаційних, медико-біологічних і інженерно-технічних заходів і засобів, спрямованих на захист персоналу, що працює, населення і місця існування людини від дії патогенних біологічних агентів.

"Брудна" зона ПЛР-лабораторії - приміщення з високою вірогідністю наявності синтезованих ампліконів у повітрі та на об'єктах довкілля (електрофорезна та інші приміщення, де відкриваються пробірки після ампліфікації).

Генетичні маркери - специфічні нуклеотидні послідовності з відомою первинною структурою, які дозволяють проводити ідентифікацію аналізованої НК, оскільки вони характерні для певного виду.

Деконтаминація - будь-який процес видалення або знищення мікроорганізмів, продуктів ПЛР, небезпечних хімічних та радіоактивних речовин.

Зворотна транскриптаза - РНК-залежна ДНК-полімераза, що використовує молекули РНК як матрицю для синтезу комплементарного ланцюга ДНК.

Лабораторна контамінація нуклеїновими кислотами - механічне занесення позитивно реагуючих НК, перш за все ампліконів, у досліджувані зразки, що призводить до хибнопозитивних результатів.

Нуклеїнові кислоти - дезоксирибонуклеїнова (ДНК) та рибонуклеїнова (РНК).

Комплементарна ДНК - молекула ДНК, синтезована на РНК-матриці з участю РНК-залежної ДНК-полімерази (зворотної транскриптази).

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод виявлення специфічної ділянки НК в досліджуваному біологічному матеріалі шляхом ампліфікації in vitro.

"Чиста" зона ПЛР-лабораторії - приміщення, вільні від синтезованих ампліконів (кімнати пробопідготовки, виділення НК, приготування реакційної суміші та ампліфікації).

3.1. Загальні вимоги

3.1.1. Роботу з БПА I-IV груп патогенності методом ПЛР проводять за наявності дозволу Державної санітарно-епідеміологічної служби України на право роботи (далі - дозвіл на роботу) із збудниками I-IV групи патогенності (небезпечності), токсинами, рекомбінантними молекулами ДНК, відповідно до постанови Кабінету Міністрів України від 22.06.99 N 1109 "Про затвердження Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні".

3.1.2. Організацію робіт на етапах прийому, розбору, первинної обробки матеріалу, підготовки проб і виділення НК, а також знезараження проб проводять відповідно до вимог ДСП 9.9.5.035.99 "Безпека роботи з мікроорганізмами I-II груп патогенності", затверджених постановою головного державного санітарного лікаря України від 01.07.99 N 35 (далі - ДСП 9.9.5.035.99), та ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю", затверджених постановою головного державного санітарного лікаря України від 28.01.2002 N 1 (далі - ДСП 9.9.5.-080-2002).

На інших етапах ПЛР-аналізу працюють як із знезараженим матеріалом.

3.1.3. Усі етапи дослідження матеріалу, зараженого або підозрюваного на зараженість вірусами I групи, проводять в умовах максимально ізольованих лабораторій з використанням ізолюючих засобів індивідуального захисту або в боксах біологічної безпеки III класу у захисному протичумному костюмі IV типу, доповненому гумовими рукавичками.

3.1.4. У лабораторіях, що мають дозвіл на роботу з БПА II групи патогенності, допускається проведення досліджень крові/сироватки людини методом ПЛР (без попереднього накопичення мікроорганізма) з метою діагностики інфекцій, збудники яких належать до I групи патогенності.

3.1.5. У лабораторіях, що мають дозвіл на роботу з БПА III групи патогенності, допускається проведення досліджень крові/сироватки людини методом ПЛР (без попереднього накопичення мікроорганізма) з метою діагностики бруцельозу, парентеральних вірусних гепатитів, ВІЛ-інфекції, збудники яких належать до II групи патогенності.

3.1.6. Роботу з ПЛР-діагностики організовує і проводить спеціаліст з вищою спеціальною освітою, який має сертифікат лікаря-спеціаліста з лікарських спеціальностей "бактеріологія", "вірусологія" або "мікробіологія і вірусологія" та пройшов курси спеціалізації, стажування або інші види підготовки, має необхідну за програмою теоретичну і практичну підготовку за своєю спеціальністю, відповідно до Положення про порядок проведення атестації лікарів, затвердженого наказом МОЗ України від 19.12.97 N 359, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 14.01.98 за N 14/2454.

Приймання матеріалу, ведення записів у журналах, виконання допоміжних маніпуляцій при проведенні досліджень та деяких етапів аналізу, дезінфекцію, знешкодження матеріалу тощо здійснюють лаборанти, які отримали свідоцтво про проходження підвищення кваліфікації та перепідготовки молодших медичних та фармацевтичних спеціалістів відповідно до Положення про Свідоцтво про проходження підвищення кваліфікації та перепідготовки молодших медичних та фармацевтичних спеціалістів, затвердженого наказом МОЗ України від 07.09.93 N 198, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 31.12.93 за N 208.

Кваліфікаційні вимоги до працівників лабораторій викладені у Довіднику кваліфікаційних характеристик професій працівників. Випуск 78. Охорона здоров'я, затвердженому наказом МОЗ України від 29.03.2002 N 117.

3.1.7. Кожен працівник повинен мати посадову інструкцію, що встановлює вимоги до освіти, функції, обов'язки, права, відповідальність, затверджену керівником установи.

3.1.8. Результати та протоколи досліджень реєструють на паперових та електронних носіях, а також на фотоплівках, фотографіях, які зберігають у лабораторії впродовж трьох років. Електрофореграми є невід'ємною частиною протоколу дослідження.

3.1.9. Відповіді про результати дослідження видають письмово в установленій формі за підписом лікаря, який виконував дослідження.

3.1.10. Лабораторію забезпечують аптечкою стандартної комплектації для надання першої медичної допомоги.

3.1.11. Для виконання досліджень за методом NASBA-Real-Time вимоги до організації роботи такі ж, як і для ПЛР-лабораторій, що використовують флуоресцентну детекцію.

3.2. Вимоги до приміщень ПЛР-лабораторії

3.2.1. Приміщення ПЛР-лабораторії, яка проводить роботи з БПА I-II груп патогенності або матеріалом, підозрюваним на наявність в ньому цих БПА, повинні відповідати вимогам ДСП 9.9.5.035.99; при роботі з БПА III-IV груп патогенності або матеріалом, підозрюваним на наявність в ньому цих БПА, повинні відповідати вимогам ДСП 9.9.5.-080-2002, а також цих Правил.

3.2.2. Проведення досліджень методом ПЛР з БПА I-IV груп патогенності допускається на базі діючих лабораторій мікробіологічного профілю за умови дотримання вимог ДСП 9.9.5.035.99 та ДСП 9.9.5.-080-2002 і організації в лабораторії відокремлених робочих зон, що дозволяють дотримуватись вимог протиепідемічного режиму роботи та відповідають етапам ПЛР-дослідження.

Не допускається проведення досліджень методом ПЛР в приміщеннях, де проводять дослідження з використанням культуральних (накопичення БПА) і генно-інженерних методів.

Приміщення, в яких проводять дослідження, спрямовані на виявлення НК мікроорганізмів, бажано виділити в окремий блок. При будівництві нових або реконструкції існуючих приміщень ПЛР-лабораторію розміщують в окремій будівлі (ізольованій частині будівлі) з дотриманням вимог ДСП 9.9.5.035.99, ДСП 9.9.5.-080-2002 та цих Правил.

3.2.3. ПЛР-лабораторія повинна мати дві умовні зони "чисту" і "брудну" та включати такий мінімальний набір робочих приміщень:

"чиста" зона:

- приміщення прийому, реєстрації, розбору і первинної обробки матеріалу;

- приміщення для виділення НК;

- приміщення приготування реакційних сумішей і проведення ПЛР-ампліфікаційна;

"брудна" зона:

- приміщення детекції продуктів ампліфікації (при застосуванні методів електрофорезу або ГІФА) - форезна;

- секвенаторна.

3.2.4. Робочі приміщення ПЛР-лабораторії повинні бути непрохідними і створеними за типом боксів з передбоксами. Площа кожного із робочих приміщень ПЛР-лабораторії повинна бути не меншою ніж 12 кв.м на одне робоче місце, у тому числі передбокс не менше 2 кв.м. При збільшенні робочих місць площу слід збільшувати на 6 кв.м на кожне робоче місце, тобто S = 12 + 6 x (n-1) кв.м, де n - кількість робочих місць.

3.2.5. ПЛР-лабораторія, що функціонує як самостійна структура, повинна мати додатково такі приміщення - кімнату для роботи з документами (кімнату персоналу), кабінет завідувача лабораторією (може бути об'єднаний з кімнатою персоналу); роздягальні для співпрацівників; кімнату прийому їжі; туалет; душові для "чистої" та "брудної" зон ПЛР-лабораторії окремо, підсобні (складські) приміщення, приміщення для знезараження матеріалу та автоклавну, а також приміщення, вказані в підпункті 3.2.3 пункту 3.2 цих Правил, для проведення ПЛР-аналізу. Примірна схема організації ПЛР-лабораторії наведена на малюнку 1.

Малюнок 1. Примірна схема організації ПЛР-лабораторії

3.2.6. У приміщенні прийому, реєстрації, розбору і первинної обробки матеріалу проводять попередню пробопідготовку (сортування, маркування, центрифугування та інше), зберігання і первинну інактивацію залишків біологічного матеріалу дезінфекційними засобами. Тут же можна проводити прийом і обробку проб для дослідження іншими методами (бактеріологічним, вірусологічним, імунологічним тощо) за умови виділення окремого обладнаного робочого місця для пробопідготовки до ПЛР-аналізу.

Усі маніпуляції, що супроводжуються ризиком утворення аерозолів (струшування, центрифугування тощо), при обробці матеріалу виконують у боксах безпеки II або III класу (в залежності від групи патогенності мікроорганізму, наявність якого підозрюють у досліджуваному матеріалі).

3.2.7. Зону виділення НК розташовують в окремому приміщенні. При організації ПЛР-лабораторії на базі діючої мікробіологічної лабораторії допускається виділення НК в приміщеннях, в яких проводять серологічні дослідження, а в лабораторіях, що працюють із збудниками I-II груп патогенності, - в кімнаті зараження та розтину тварин. У цих випадках в приміщенні організовують робочу зону для виділення НК, в якій встановлюють бокс біологічної безпеки відповідно II або III класу. У робочій зоні розташовують обладнання та предмети, які необхідні тільки для виділення НК. У боксі біологічної безпеки для виділення НК не допускається проведення інших робіт.

Виділення НК з клінічного матеріалу та проб з об'єктів довкілля проводять у іншому боксі безпеки, ніж при дослідженні харчових продуктів на показники безпеки або наявність генетично-модифікованих організмів. Крім того, доцільно розмежувати процеси виділення НК з крові/сироватки та інших видів клінічного матеріалу (в окремих боксах безпеки або в різний час, після попередньої обробки).

3.2.8. Приміщення ампліфікаційної має бути окремим. У ньому проводять приготування реакційної суміші, внесення до пробірки для ПЛР виділених препаратів ДНК або компліментарної ДНК (далі - кДНК), зворотну транскрипцію (далі - ЗТ) РНК та ампліфікацію ДНК або кДНК.

Для приготування реакційної суміші і внесення в реакційну суміш препаратів НК встановлюють окремі ПЛР-бокси.

У ПЛР-лабораторіях з великим обсягом однотипних досліджень для приготування реакційної суміші обладнують окрему боксовану кімнату, яка функціонально, через шлюзове вікно, пов'язана з кімнатою для внесення виділених препаратів НК та проведення ампліфікації.

3.2.9. Кімнату детекції продуктів ампліфікації розташовують в окремому приміщенні, максимально віддаленому від "чистої" зони ПЛР-лабораторії. Створюють усі умови для розмежування персоналу, що працює у "чистій" зоні від персоналу, що працює у "брудній" зоні.

3.2.10. При необхідності використання для детекції продуктів ампліфікації разом з методом електрофорезу і методу ГІФА необхідно виділити окреме приміщення або окрему робочу зону для проведення гібридизаційного аналізу (відповідно площа цього приміщення повинна бути збільшена як для приміщення на 2 робочих місця). Обладнання для кожного виду детекції маркують для кожної зони. Не допускається при проведенні ГІФА використання піпеток і посуду, призначених для електрофорезу.

3.2.11. При використанні в ПЛР-лабораторії методу ПЛР з флуоресцентною детекцією, як єдиного методу, окрему кімнату детекції продуктів ампліфікації не організовують.

3.2.12. Автоклавна кімната може бути спільною для ПЛР-лабораторії та інших підрозділів лабораторії, на базі якої розташована ПЛР-лабораторія, і функціонувати за умови дотримання вимог біологічної безпеки.

3.2.13. Для вивчення послідовності нуклеотидів у ДНК (секвенування) необхідно виділяти окреме приміщення - секвенаторну у "брудній" зоні ПЛР-лабораторії, яке має бути розташоване поруч з приміщенням детекції продуктів ампліфікації. При цьому слід передбачити збільшення площі приміщення детекції продуктів ампліфікації, оскільки в ньому треба буде розмістити додаткове обладнання для секвенування: настільну центрифугу з охолодженням та змінними роторами, облаштувати стіл для проведення очистки та перевірки якості отриманого продукту ПЛР.

3.2.14. Приміщення секвенаторної влаштовують за типом бокса з передбоксником загальною площею не менше 12 кв.м, в тому числі 10 кв.м - робоча кімната. Передбоксник обладнують водопостачанням та каналізацією.

3.2.15. Підготовка зразка для завантаження його у секвенатор складається з кількох основних етапів (та може розрізнятися в залежності від методики, що використовується):

- виділення НК з клінічного матеріалу проводиться у кімнаті виділення НК, як для ПЛР у класичному форматі;

- ампліфікація ділянки НК, що охоплює зону інтересу (якщо це РНК - необхідним є етап ЗТ для отримання кДНК), проводиться в приміщенні ампліфікаційної;

- очистка отриманого ампліфікованого продукту ПЛР-реакції (від праймерів, залишкових дезоксинуклеотидів, ферментів, матричної НК, неспецифічних ПЛР-продуктів) проводиться у форезній. Використовуються такі методи очистки: за допомогою електрофорезу в агарозному гелі; на колонках; ферментативна очистка;

- оцінка якості/кількості ДНК (з наступним розведенням при необхідності) за допомогою агарозного електрофорезу чи спектрофотометрично проводиться у форезній;

- проведення ПЛР з використанням термінаторів проводиться у секвенаторній;

- доочистка отриманого ампліфікованого продукту після реакції з термінаторами (від солей, надлишкових дидезоксинуклеотидів) проводиться у форезній. Використовуються такі методи очистки: очистка етанолом, ізопропанолом, гель-фільтрація, мембранна фільтрація;

- ресуспендування зразка (у формаміді або воді) проводиться у форезній;

- завантаження зразка у секвенатор.

3.2.16. Незалежно від протоколу, що буде використовуватись, необхідним є таке обладнання для секвенаторної:

- низькотемпературні холодильники для зберігання зразків та реагентів;

- ПЛР-бокс;

- дозатори на різні об'єми;

- ампліфікатор (для проведення класичної ПЛР);

- вортекс;

- секвенатор.

В залежності від методики необхідними можуть бути обладнання для проведення електрофорезу з системою документації, спектрофотометр, центрифуги зі змінними роторами та охолодженням.

3.2.17. Планувальні рішення і розміщення обладнання повинні забезпечувати поточність руху досліджуваного матеріалу за технологічним процесом. Слід повністю виключити обмін повітря між приміщеннями "брудної" зони та іншими приміщеннями ПЛР-лабораторії.

Рух матеріалу у зворотному напрямку категорично заборонено.

3.2.18. ПЛР-лабораторія повинна бути обладнана водопроводом, каналізацією, забезпечена електрикою і опалюванням відповідно до чинного законодавства. Усі приміщення лабораторії повинні бути забезпечені достатнім природним і штучним освітленням. В передбокснику кожної робочої кімнати повинна бути раковина для миття рук.

3.2.19. При будівництві нових або реконструкції існуючих ПЛР-лабораторій приміщення слід обладнувати припливно-витяжною або витяжною вентиляцією. Різниця в тиску повітря в приміщеннях ПЛР-лабораторії досягається за рахунок різного за кратністю обміну повітря в них.

Кратність обміну повітря в приміщеннях ПЛР-лабораторії повинна відповідати значенням, наведеним в таблиці 1.

3.2.20. Припливно-витяжна вентиляція повинна бути обладнана окремо для "чистої" та "брудної" (форезна та зона ГІФА) зон ПЛР-лабораторії.

3.2.21. При відсутності системи вентиляції зменшення ризику контамінації проб досягають заходами по обмеженню обміну повітря між приміщеннями ПЛР-лабораторії (територіальне розмежування).

3.2.22. При необхідності в ПЛР-лабораторії можуть бути встановлені кондиціонери за умови використання їх при технологічних перервах. Під час роботи з досліджуваним матеріалом кондиціонери повинні бути вимкнені.

3.2.23. Внутрішнє оздоблення приміщень виконують відповідно до їх функціонального призначення. Поверхні стін, підлоги і стелі в лабораторних кімнатах повинні бути гладенькими, без щілин, легко оброблятись і бути стійкими до дії мийних і дезінфекційних засобів. Підлога не повинна бути слизькою.

3.2.24. Вікна повинні бути щільно закриті. Для захисту робочих місць від сонячних променів рекомендується використовувати світлозахисні плівки, стійкі до дезінфектантів, використання жалюзі в середині приміщень - заборонено.

3.2.25. Лабораторні меблі повинні мати покриття, стійке до дії мийних і дезінфекційних засобів. Поверхня столів не повинна мати тріщин і швів.

3.2.26. Приміщення для усіх етапів ПЛР-аналізу повинні бути обладнані бактерицидними лампами, які встановлюють з розрахунку 2,5 Вт/куб.м. Рекомендується додатково використовувати пересувний ультрафіолетовий бактерицидний опромінювач-рециркулятор.

3.2.27. ПЛР-лабораторія повинна бути забезпечена телефонним зв'язком, комп'ютерною та оргтехнікою, підключена до локальної електронної мережі.

3.2.28. Приміщення ПЛР-лабораторії повинні бути непроникні для гризунів і комах.

3.2.29. ПЛР-лабораторію забезпечують засобами пожежогасіння.

3.3. Вимоги до лабораторного обладнання в ПЛР-лабораторії

3.3.1. Комплектацію лабораторного обладнання для ПЛР-лабораторії визначають з урахуванням функціонального призначення лабораторії, тест-систем, які планується використовувати для виконання досліджень, обсягів та номенклатури досліджень, що плануються.

Прилади, обладнання і засоби вимірювальної техніки повинні бути зареєстровані МОЗ України відповідно до наказу МОЗ України від 04.08.2005 N 393 "Про затвердження Переліку медичних виробів, що підлягають державній реєстрації (перереєстрації) в Україні", зареєстрованому в Міністерстві юстиції України 19.10.2005 за N 1229/11509, технічно справні, мати технічний паспорт і робочу інструкцію з експлуатації. Засоби вимірювальної техніки і обладнання підлягають регулярному метрологічному контролю (повірка/атестація).

Прилади, що використовуються, повинні відповідати нормам безпеки і електромагнітної сумісності. Все лабораторне обладнання повинно бути заземлено, перевага віддається застосуванню трьохконтактних штепсельних вилок.

Мінімальний перелік основного обладнання ПЛР-лабораторії наведений у додатку 1 до цих Правил.

3.3.2. При застосуванні методики ПЛР з флуоресцентною детекцією використовують спеціальні детектори, наприклад типу "Джин" або "Ала 1/4", який доцільно встановити в ампліфікаційній, з'єднавши його з комп'ютером із системою Windows 3.11, 95, 98, ME, XP і одним вільним COM або USB портом.

3.3.3. Ампліфікатор, що дозволяє працювати у форматі "Real Time", також встановлюють в ампліфікаційній кімнаті разом зі звичайними ампліфікаторами.

3.3.4. Для виконання досліджень за методом NASBA-Real-Time потрібне відповідне обладнання, Примірний перелік якого наведений в додатку 2 до цих Правил, яке також розташовують у приміщенні виділення НК та ампліфікаційній.

3.3.5. Кожне робоче приміщення ПЛР-лабораторії повинне мати свій промаркований працівниками, що в ньому працюють, набір меблів, лабораторного обладнання, реагентів, автоматичних піпеток, наконечників, пластикового та скляного посуду, захисного одягу, гумових рукавичок, інвентарю для прибирання тощо, які використовують тільки в даному приміщенні. Застосування його в інших приміщеннях або для інших видів робіт не допускається.

3.3.6. Для проведення дослідження користуються приладами і витратними матеріалами (пробірки, наконечники до мікродозаторів), що виключають можливість перехресної контамінації вихідного матеріалу, виділених НК і продуктів ПЛР. Для цього необхідно:

- використовувати:

термостати з твердотільним термоблоком;

пробірки з кришками, що щільно закриваються;

одноразові пробірки і наконечники з фільтром до мікродозаторів тільки вільні від ДНК-аз та РНК-аз (з маркуванням "DNase, RNase-free");

наконечники, які точно відповідають за розміром та видом автоматичним піпеткам, а пробірки для ампліфікації - термоциклерам (відповідно до інструкції фірми-виробника приладу);

- встановити на робочих місцях спеціальні контейнери для скидання використаних наконечників і пробірок.

3.3.7. Мікродозатори, робоча і зовнішня поверхня корпусу приладів повинні бути стійкі до дії мийних, дезінфекційних засобів і ультрафіолетового випромінювання.

3.3.8. Для кожного етапу ПЛР-дослідження необхідно передбачити наявність окремих холодильників:

- у кімнаті прийому, реєстрації, розбору і первинної обробки матеріалу - холодильна камера (6+-2) град.С та морозильна камера - мінус (18+-2) град.С (для зберігання досліджуваних проб);

- у кімнаті виділення НК - холодильна камера (6+-2) град.С та морозильна камера - мінус (18+-2) град.С для зберігання набору реагентів для виділення НК; холодильна камера (6+-2) град.С - для нетривалого (декілька годин) зберігання виділених НК і морозильна камера - мінус (18+-2) град.С для зберігання НК впродовж 1 місяця.

Не допускається зберігання препаратів НК в одному холодильнику з компонентами набору для виділення НК.

При необхідності тривалого (біля 1 року) зберігання виділених і підготовлених для дослідження препаратів НК потрібна морозильна камера, яка здатна забезпечити температуру мінус 70 град.С;

- у кімнаті приготування реакційних сумішей і проведення ПЛР - холодильна камера (6+-2) град.С і морозильна камера - мінус (18+-2) град.С - для зберігання наборів ЗТ і ампліфікації НК;

- у кімнаті детекції продуктів ампліфікації (6+-2) град.С - для зберігання реагентів для електрофоретичної детекції (таких як маркер молекулярної маси та інше) та ГІФА.

При зберіганні в холодильниках (морозильних камерах) інфікованого матеріалу необхідно вживати заходи для попередження забруднення камер; розморожування рефрижератора, що передбачене правилами експлуатації, слід об'єднувати з його дезінфекцією.

Усі контейнери, пробірки, що зберігаються в холодильних (морозильних) камерах, повинні мати чіткі написи із зазначенням матеріалу, що міститься у них. Матеріали без чітких написів і реагенти, термін використання яких вичерпано, повинні бути знезаражені шляхом автоклавування і видалені з лабораторії.

Контроль температурного режиму в холодильних (морозильних камерах) проводиться щоденно з відміткою у відповідних температурних листках або журналах.

Рекомендована форма листа обліку температури в холодильнику (морозильнику) наведена у додатку 3 до цих Правил.

Для контролю температурного режиму доцільно використовувати дистанційні термометри, які дозволяють здійснювати контроль температури в камері не відкриваючи холодильника.

4.1. ПЛР-лабораторія повинна мати:

4.1.1. Документацію щодо організації лабораторії:

- положення про лабораторію, затверджене керівником установи;

- паспорт лабораторії, затверджений керівником установи;

- дозвіл на роботу зі збудниками відповідних груп патогенності відповідно до підпункту 3.1.1 пункту 3.1 цих Правил;

- свідоцтво(а) про атестацію/акредитацію ПЛР-лабораторії;

- ліцензію на здійснення медичної практики відповідно до Закону України "Про ліцензування певних видів господарської діяльності".

4.1.2. Організаційно-розпорядчу документацію - накази, інструкції та інші документи, що регламентують діяльність лабораторії.

4.1.3. Нормативну документацію, що регламентує вимоги до об'єктів досліджень та методи досліджень.

4.1.4. Документацію на систему забезпечення якості досліджень:

- настанова з якості;

- інструкція з внутрішнього та зовнішнього контролю якості досліджень;

- інструкції з протиепідемічного режиму, охорони праці та техніки безпеки;

- журнал реєстрації контамінації ПЛР-лабораторії нуклеїновими кислотами;

- форма N 410/о "Журнал внутрішнього контролю якості лабораторних досліджень", затверджена наказом МОЗ України від 11.07.2000 N 160;

- результати зовнішнього контролю якості досліджень.

4.1.5. Документи на обладнання та засоби вимірювальної техніки:

- реєстраційні документи на обладнання (журнал / картки обліку);

- паспорт на кожну одиницю обладнання та засобів вимірювальної техніки;

- графіки та посвідчення про повірку засобів вимірювальної техніки (можуть знаходитись у метролога).

4.1.6. Документацію щодо персоналу лабораторії:

- посадові інструкції;

- документи на присвоєння (підтвердження) кваліфікаційних категорій, видані відповідно до Положення про порядок проведення атестації лікарів, затвердженого наказом МОЗ України від 19.12.97 N 359, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 14.01.98 за N 14/2454 та Положення про атестацію молодших спеціалістів з медичною освітою, затвердженого наказом МОЗ України від 23.11.2007 N 742, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 12.12.2007 за N 1368/14635;

- дані щодо імунізації працівників;

- документи про страхування працівників на випадок зараження збудниками ВІЛ відповідно до Порядку та умов обов'язкового страхування медичних працівників та інших осіб на випадок інфікування вірусом імунодефіциту людини під час виконання ними професійних обов'язків, а також на випадок настання у зв'язку з цим інвалідності або смерті від захворювань, зумовлених розвитком ВІЛ-інфекції, затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 16.10.98 N 1642;

- журнал реєстрації інструктажів з питань охорони праці на робочому місці, форма якого визначена додатком 6 до Типового положення про порядок проведення навчання і перевірки знань з питань охорони праці, затвердженого наказом Державного Комітету України з нагляду за охороною праці від 26.01.2005 N 15, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 15.02.2005 за N 231/10511;

- журнал реєстрації аварій.

4.1.7. Медичну облікову та звітну документацію.

5.1. Персонал з відповідною професійною підготовкою допускають до роботи з БПА після проведення інструктажу щодо дотримання вимог біологічної безпеки та безпеки праці, про що повинна бути відмітка з підписом проінструктованого у журналі реєстрації інструктажів з питань охорони праці на робочому місці, форма якого визначена додатком 6 до Типового положення про порядок проведення навчання і перевірки знань з питань охорони праці, затвердженого наказом Державного Комітету України з нагляду за охороною праці від 26.01.2005 N 15, зареєстрованого в Міністерстві юстиції України 15.02.2005 за N 231/10511.

5.2. У "чистій" та "брудній" зонах ПЛР-лабораторії повинні працювати різні спеціалісти, а робота повинна бути організована так, щоб працівники цих зон були максимально ізольовані.

5.3. Порядок забору матеріалу визначений нормативними документами МОЗ України, що регламентують виконання відповідних досліджень, інструкціями до тест-систем і ДСП 9.9.5.035.99 та ДСП 9.9.5.-080-2002.

Забір та транспортування матеріалу для досліджень методом ПЛР здійснює персонал, який пройшов інструктаж з цього питання. Матеріал відбирають стерильними одноразовими інструментами в стерильні одноразові флакони, пробірки, контейнери.

Одразу після забору біологічного матеріалу флакони, пробірки щільно закривають, не торкаючись їх внутрішньої поверхні і внутрішньої поверхні кришок. Працюють в одноразових рукавичках.

Відбір проб харчових продуктів та сировини проводять згідно з чинними нормативними документами, що встановлюють порядок відбору для однорідних груп продукції. Проби сипучих продуктів або щільної консистенції відбирають в одноразові поліетиленові пакети розміром не більше 10х15 см, використовуючи одноразові рукавички і стерильні (профламбовані) інструменти. Проби рідких продуктів відбирають в стерильні ємкості з скла або пластика з кришками, що герметично закриваються. Проби опечатують, складають акт відбору проб харчових продуктів (форма N 342/о, затверджена наказом МОЗ України від 11.07.2000 N 160, який разом з відібраною пробою і направленням відправляють в лабораторію.

Транспортування проб харчових продуктів здійснюють при температурі, рекомендованій для зберігання сировини або харчового продукта.

5.4. Доставка в лабораторію матеріалу для дослідження здійснюється у спеціальних контейнерах або сумках-холодильниках стійких до дії дезінфектантів. На дно цих ємкостей поміщають адсорбуючий матеріал (марлева серветка, тканина, вата тощо). Штатив з пробірками поміщають в сумку-холодильник або в контейнер з холодовими агентами. Правила упаковки БПА регламентовані діючими нормативними документами щодо порядку обліку, зберігання, передачі і транспортування мікроорганізмів.

Кожна партія матеріалу повинна супроводжуватись пакувальним листом з описом вкладеного у контейнер (копія пакувального листа зберігається у відправника) та направленнями на дослідження кожного зразка:

для біологічного матеріалу - форма N 200/о "Направлення на аналіз", затверджена наказом МОЗ України від 04.01.2001 N 1;

для проб із об'єктів довкілля - форма N 205/о "Направлення на санітарно-мікробіологічне дослідження", затверджена наказом МОЗ України від 04.01.2001 N 1;

для культур мікроорганізмів - направлення на ПЛР-дослідження оформлюється у вільній формі і супроводжується паспортом штаму.

Ці документи упаковують окремо від проб.

Ємкості з матеріалом повинні бути промарковані відповідно до направлення. Забороняється обертати направлення навколо ємкості з об'єктом досліджень, вкладати в контейнер. Направлення зберігаються в лабораторії протягом терміну, визначеного в установленому порядку.

5.5. Матеріал, що надходить для дослідження, приймають в кімнаті прийому, реєстрації, розбору і первинної обробки матеріалу, де його розбирають і сортують дотримуючись вимог біологічної безпеки.

Розпаковування матеріалу проводиться з дотриманням запобіжних заходів, з використанням маски та гумових рукавичок.

Первинні транспортні контейнери або сумки-холодильники, в яких доставлено зразки, після розвантаження, обробляють дезінфікуючими розчинами, після чого вони можуть бути повернені закладу (власнику), що направив матеріал.

Зразки і посуд, в якому матеріал надходить для дослідження, поверненню не підлягають.

Ємкості, що містять матеріал, зовні обробляють дезінфектантом, ставлять на металеві підноси або в штативи і переносять на стіл для реєстрації і сортування.

Зразки біологічного матеріалу реєструють відповідно до форми N 252/о "Журнал реєстрації мікробіологічних та паразитологічних досліджень", затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.2001 N 1; проби з об'єктів довкілля - відповідно до форми N 379/о "Журнал реєстрації санітарно-мікробіологічних та санітарно-паразитологічних досліджень", затвердженої наказом МОЗ України від 11.07.2000 N 160.

Кожний зразок маркують відповідно до реєстраційного журналу.

5.6. При проведенні досліджень методом ПЛР неухильно дотримуються таких правил послідовної обробки матеріалу:

5.6.1. Після реєстрації промарковані зразки передають на робочі місця для підготовки матеріалу для дослідження методом ПЛР, де проводять їх первинну обробку (центрифугування проб, їх об'єднання або розділення тощо).

5.6.2. При перенесенні біологічного матеріалу із флаконів (пробірок) в інші та виконанні маніпуляцій з ним використовують тільки окремі одноразові наконечники з аерозольним бар'єром.

5.6.3. При роботі з біологічним матеріалом важливо не здійснювати різких рухів, обережно відкривати пробірки, флакони, враховуючи можливість аерозольних викидів, які можуть привести до контамінації проб і робочих поверхонь.

5.6.4. Передачу і доставку аліквот проб обробленого і знезараженого матеріалу, препаратів НК, пробірок з продуктами ПЛР із одного приміщення всередині лабораторії в інше здійснюють через шлюзові передаточні вікна або переносять у щільно закритих металевих або пластмасових контейнерах. Контейнери після кожного використання піддають дезінфекції.

5.6.5. У приміщення виділення НК матеріал доставляють тільки в закритих одноразових пробірках у вигляді маркованих аліквот. Після виділення НК передають для постановки реакції у кімнату приготування реакційних сумішей і проведення ПЛР або зберігають у холодильній чи морозильній камері.

5.6.6. У кімнаті приготування реакційних сумішей і проведення ПЛР готують компоненти реакційної суміші та складають власне реакційну суміш (якщо не використовуються готові тест-системи), додають виділені препарати НК. Всі маніпуляції проводять у окремих настільних ПЛР-боксах. Реакційні суміші готують до початку роботи з виділеними НК.

В ПЛР-лабораторіях з невеликим обсягом різноманітних досліджень допускається об'єднати виконання етапу приготування реакційної суміші і внесення виділеної НК в одному ПЛР-боксі в різний час після попередньої обробки ПЛР-боксу.

Перед початком роботи та після її закінчення ПЛР-бокси та обладнання, що в них знаходиться, обробляють 70 град.С спиртом та опромінюють ультрафіолетом 1 годину.

Усі маніпуляції у ПЛР-боксах, перенесення реакційних сумішей і препаратів НК, заповнення ампліфікаторів пробірками із реакційною сумішшю і НК та звільнення від них проводять в одноразових гумових рукавичках.

5.6.7. При використанні праймерів з флуорофорами - після постановки реакції проводять детекцію, облік та реєстрацію результатів дослідження. Відпрацьовані пробірки з дотриманням вимог підпункту 5.6.4 пункту 5.6 цих Правил видаляють з приміщення, де проводилась ампліфікація, у форезну або спеціально виділене приміщення для первинної дезінфекції відпрацьованого матеріалу, де проводять їх знезараження.

5.6.8. При використанні класичного формату реакції або ГІФА-реакційні пробірки з дотриманням вимог підпункту 5.6.4 пункту 5.6 цих Правил передають у "брудну" зону до кімнати для детекції продуктів ампліфікації для подальшого електрофорезу або ГІФА.

5.6.9. Робота з розчинами, що містять бромистий етидій (гель для електрофорезу, буферні розчини тощо), проводиться в гумових рукавичках (одна або дві пари), оскільки речовина вибірково комплексується з ДНК і має мутагенну та тератогенну дію.

5.6.10. Ультрафіолетове опромінення, що застосовується для візуального обліку результатів електрофорезу, небезпечне для зору, тому необхідно користуватися захисними окулярами, маскою або щитком.

5.6.11. Після проведення детекції і обліку результатів дослідження класичним методом (електрофореграма) або ГІФА пробірки з продуктами ПЛР та використані наконечники до мікродозаторів піддають первинній обробці дезінфікуючими розчинами, що спричинюють деградацію ДНК, дозволеними до застосування в установленому порядку. Процедуру проводять безпосередньо у форезній або спеціально виділеному приміщенні для первинної дезінфекції відпрацьованого матеріалу, яке розташоване як можна далі від "чистої" зони. Остаточне знезараження використаних витратних матеріалів і реагентів проводять в автоклавній кімнаті.

5.6.12. Результати досліджень оформляють і зберігають в ПЛР-лабораторії згідно з підпунктом 3.1.8 пункту 3.1 цих Правил.