МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
Н А К А З
| 22.12.2003 N 598 |
Про удосконалення лабораторної діагностики рикетсіозів
Ефективність діагностики рикетсійних інфекцій залежить від організації роботи лабораторій та правильності проведення досліджень.
В Україні у 2002 р. зареєстровано 86 випадків захворювань на рикетсіози, в тому числі 1 випадок захворювання на хворобу Бриля та 85 - на марсельську гарячку.
Високі показники ураженості населення педикульозом, потенційні джерела інфекції - хвороба Бриля свідчать про існування реальної загрози виникнення та розповсюдження захворювань на епідемічний висипний тиф. У лютому 2003 року в Миколаївській області у жінки 35 років з педикульозом та її дитини 10 років за результатами серологічних досліджень Львівським НДІ епідеміології і гігієни ретроспективно встановлено перенесену раніше висипнотифозну інфекцію.
Аналіз якості лабораторної діагностики в областях проводиться без урахування даних імунологічних досліджень, правильності та ефективності використання методів лабораторного контролю.
Залишається незадовільним забезпечення імунобіологічними діагностичними препаратами, оскільки більшість з них виробляється за кордоном. З 2000 р. в країні були припинені дослідження на волинську гарячку, між тим, при дослідженні в реакції зв'язування комплементу у трьох осіб із 41 обстеженого (Запорізька, Львівська, Черкаська області) були виявлені позитивні результати (титр 1:10).
З метою оптимізації лабораторної діагностики рикетсіозів, запровадження єдиної системи організації і проведення діагностики
НАКАЗУЮ:
1. Затвердити Методичні рекомендації з лабораторної діагностики рикетсіозів (додається).
2. Призначити керівником Українського центру з рикетсіозів завідувача лабораторії рикетсійних інфекцій Львівського науково-дослідного інституту епідеміології та гігієни (Курганова І.І.).
3. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Севастопольської міської державних адміністрацій, Головного управління охорони здоров'я та медичного забезпечення Київської міської державної адміністрації, головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя, водного, залізничного, повітряного транспорту:
3.1. Забезпечити своєчасну імуносерологічну діагностику хворих з підозрою на рикетсійні захворювання відповідно до наказів МОЗ України від 21.12.93 N 246 "Про удосконалення заходів профілактики епідемічного висипного тифу та хвороби Бриля" та від 14.04.97 N 115 "Про заходи щодо профілактики та виявлення захворювань на гарячку Ку".
3.2. Забезпечити організацію роботи лабораторій та дослідження на рикетсіози з урахуванням відповідно до затверджених Методичних рекомендацій.
3.3. Координацію роботи з лабораторної діагностики рикетсіозів та організаційне-методичне керівництво покласти на лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій закладів держсанепідслужби.
3.4. Забезпечити лабораторії лікувально-профілактичних закладів та установ санепідслужби необхідним переліком діагностичних імунобіологічних препаратів.
4. В.о. директора Львівського науково-дослідного інституту епідеміології та гігієни МОЗ України (Тарасюк А.А.), керівнику Українського центру з рикетсіозів (Курганова І.І.):
4.1. Здійснювати консультативні та підтверджуючі дослідження сироваток крові хворих, диференціацію первинної та повторної висипнотифозної інфекції, гострих та хронічних форм інших рикетсіозів, визначення класів імуноглобулінів.
4.2. Проводити індикацію та ідентифікацію збудників рикетсіозів в біологічних об'єктах з вогнищ інфекцій.
5. Директору ДП "Центр імунобіологічних препаратів" (Сельнікова О.П.) звернутися до НВО "Мікроген" (Росія) з метою перереєстрації препаратів для діагностики збудників рикетсіозів.
6. Головним державним санітарним лікарям санепідстанцій Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя:
6.1. Забезпечити організаційно-методичне керівництво з лабораторної діагностики рикетсіозів, аналіз стану і ефективності її по регіону та підготовку спеціалістів.
6.2. Проводити щорічно аналіз наявності та використання діагностичних імунобіологічних препаратів в закладах охорони здоров'я, що проводять лабораторну діагностику рикетсіозів.
7. Головному лікарю Центральної санепідстанції МОЗ України (Некрасова Л.С.):
7.1. Здійснювати організаційно-методичне керівництво з лабораторної діагностики рикетсіозів в країні та контроль за її ефективністю.
7.2. Щорічно проводити аналіз стану лабораторної діагностики та надавати відповідні рекомендації.
8. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Бережнова С.П.
| Перший заступник Міністра, Головний державний санітарний лікар України | О.В.Лапушенко |
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
22.12.2003 N 598
МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
з лабораторної діагностики рикетсіозів
Рикетсійні інфекції являють серйозну загрозу здоров'ю людей і потребують ефективного епідеміологічного нагляду. Небезпека виникнення цих захворювань, можливість локальних спалахів зумовлена наявністю потенційних джерел інфекції (рецидивні форми - хвороба Бриля) і значним розповсюдженням переносників збудників рикетсіозів.
Складність клінічної діагностики хвороби Бриля, нераціональне використання лабораторних методів досліджень, відсутність єдиних регламентацій щодо вибору методів лабораторної діагностики цієї інфекції, призводять до того, що більшість захворювань на хворобу Бриля не діагностуються і реєструються під іншими діагнозами.
Захворювання на волинську (п'ятиденну) гарячку останні роки в Україні не реєструються, однак, епідемічний процес цієї інфекції характеризується активним формуванням імунного прошарку серед населення, в тому числі серед дітей та молоді, виявленням збудника в переноснику та ретроспективною діагностикою спорадичних захворювань. Це вимагає налагодження епідеміологічного нагляду і, в першу чергу, лабораторної діагностики.
Широке розповсюдження Ку-рикетсійної інфекції в країні, наявність ензоотичних територій, неповна і несвоєчасна діагностика гострих захворювань, неадекватне лікування хворих, зумовлюють зростання затяжних та хронічних форм гарячки Ку з важкими ураженнями органів кровообігу, сечостатевої системи, печінки та ін. Тільки лабораторно можна діагностувати ці захворювання.
Потребує удосконалення лабораторна діагностика рикетсіозів групи кліщової плямистої гарячки, як на ензоотичних територіях, так і при виникненні завізних випадків.
Характеристика рикетсіозів
Рикетсіози об'єднують велику групу антропонозних і зоонозних (з природною вогнищевістю) інфекцій, збудниками яких є внутрішньоклітинні мікроорганізми - рикетсії. Трансмісія збудника цих захворювань здійснюється комахами і членистоногими. Це гострогарячкові захворювання різного ступеня важкості з наявністю, як правило, висипу на шкірі і ураженням ендотелію судин. При Ку та волинській (п'ятиденній) гарячках висип на шкірі у більшості хворих відсутній.
Відомі на сьогодні рикетсійні захворювання людини, з урахуванням біологічних (антигенних) ознак збудника, особливостей епідеміології, патогенезу та клінічного перебігу, розділені на п'ять головних груп. Об'єднані в групи рикетсійні захворювання, характеризуються наявністю перехресного імунітету, обумовленого спільністю антигенної структури збудників. Окремі нозологічні форми в групах диференціюються методом серологічного аналізу із застосуванням специфічних рикетсійних антигенів. Необхідно враховувати наявність внутрішньогрупових серологічних реакцій при діагностиці рикетсіозів серологічними методами. Міжгрупових перехресних серологічних реакцій при рикетсіозах не спостерігається.
Основні групи рикетсіозів:
I. Група висипного тифу
1. Епідемічний або вошивий висипний тиф. Збудник Rickettsia (R.) prowazekii. Джерело інфекції - людина, хвора на епідемічний або рецидивний висипний тиф, переносник - одежна і головна воші. Захворюваність має епідемічний характер. Перебіг хвороби важкий з розеольозно-петехіальним або петехіальним висипом на шкірі і тифозним статусом. Летальність, особливо серед людей середнього і похилого віку, може становити 20-25%.
Рецидивною формою епідемічного висипного тифу є хвороба Бриля або спорадичний висипний тиф. Виникає в результаті активізації рикетсій Провачека після тривалої латенції в організмі у людей, які раніше перехворіли на епідемічний висипний тиф. Перебіг хвороби легкої або середньої важкості, часто в атиповій формі, що утруднює клінічну діагностику. При наявності завошивленості хворі можуть бути джерелом інфекції з виникненням епідемічного висипного тифу.
2. Ендемічний або щурячий висипний тиф. Збудник - R. mooseri (R.typhi). Джерело інфекції - щурі і миші, переносник збудника щурячі блохи і воші. Захворюваність має спорадичний характер в ендемічних районах: в портах басейнів Балтійського, Північного, Середземного, Чорного, Каспійського морів, на Американському, Австралійському та Азіатському континентах. Перебіг хвороби середньої важкості з розеольозно-папульозним висипом на шкірі.
II. Група кліщової плямистої гарячки
Захворювання цієї групи рикетсіозів характеризуються природною вогнищевістю, розповсюджені на ендемічних для кожного рикетсіозу територіях. Для збудників даних хвороб, об'єднаних в підрід Dermacentroxenus (D.), характерно розмноження не тільки в цитоплазмі, але й у ядрі клітини.
1. Плямиста гарячка Скелястих гір або кліщовий рикетсіоз Америки. Збудник - R.(D.) rickettsii. Джерело інфекції - дикі гризуни, домашні тварини, собаки, кліщі (трансоваріальна передача), переносники збудника - іксодові кліщі. Захворюваність має спорадичний характер в ендемічних районах. Перебіг хвороби важкий з рясним петехіальним, іноді геморагічним, висипом на шкірі; летальність при окремих різновидах рикетсіозу (висипний тиф Сан - Пауло) сягає 70-90%.
2. Марсельська або середземноморська, гарячка. Збудник - R.(D.) conorii, джерело і переносник збудника - південний собачий кліщ - Rhipicephalus sanguineus (трансоваріальна передача). Захворюваність спорадична в ендемічних районах в басейнах Середземного, Чорного, Каспійського морів, Північній Африці, Південно-Східній Азії, може проявлятись епідемічними спалахами. Перебіг хвороби доброякісний з наявністю первинного афекту на місці укусу кліща, регіонарного лімфаденіту, плямисто-папульозного висипу на шкірі.
3. Кліщовий рикетсіоз або кліщовий висипний тиф Північної Азії. Збудник - R.(D.) sibirica. Джерело збудника - кліщі (трансоваріальна передача), дрібні ссавці, переносник - іксодові кліщі. Захворюваність спорадична в ендемічних районах Сибіру, Далекого Сходу, Середньої Азії. Перебіг хвороби доброякісний з наявністю первинного афекту, регіонарного лімфаденіту, плямисто-папульозного висипу на шкірі.
4. Віспоподібний або везикульозний рикетсіоз. Збудник - R.(D.) akari (murinus). Джерело інфекції - домові миші, чорні та сірі щурі, переносник - гамазові кліщі. Рідко зустрічається в ендемічних районах України, Молдови, Північної Америки. Перебіг хвороби доброякісний з первинним афектом, регіонарним лімфаденітом, плямисто-папульозно-везикульозним висипом.
5. Північноавстралійський кліщовий висипний тиф. Збудник - R.(D.) australis. Зустрічається в Австралії у вигляді спорадичних захворювань з наявністю первинного афекту, регіонарного лімфаденіту, плямисто-папульозного висипу на шкірі.
III. Група пневмотропних рикетсіозів (група гарячки Ку)
1. Гарячка Ку. Збудник - Coxiella burnetii. Розповсюджена повсюдно, особливо в районах інтенсивного тваринництва. Джерело інфекції - дикі і сільськогосподарські тварини, птахи. Зараження людини відбувається аерогенним, аліментарним, контактним і, можливо, трансмісивним (кліщі) шляхами. Клінічна картина поліморфна, інколи спостерігається розеольозно-папульозний висип на шкірі.
IV. Група пароксизмальних рикетсіозів
1. Волинська або п'ятиденна гарячка. Збудник - Rochalimea (Bartonella) guintana. Джерело інфекції - хвора людина або носій збудника (бактеріємія) після перенесеного захворювання, переносник збудника - одежна і головна воші. Захворюваність має спорадичний характер або у вигляді епідемічних спалахів. Перебіг хвороби доброякісний, середньої важкості з рецидивуючою гарячкою, іноді з розеольозно-петехіальним висипом на шкірі.
V. Група цуцугамуші
Японська річкова гарячка або гарячка цуцугамуші. Збудник - R. orientalis. Рикетсіоз зустрічається на Далекому Сході, в Південно-Східній та Центральній Азії. Джерело інфекції - кліщі роду Trombicula (трансоваріальна передача), гризуни, переносник - личинки червонотілкових кліщів. Захворюваність спорадична або у вигляді епідемічних спалахів в ендемічних районах. Перебіг хвороби важкий, з первинним афектом, регіонарним лімфаденітом і генералізованою лімфоаденопатією, плямисто-папульозним висипом на шкірі.
Порівняльна характеристика методів діагностики
В Україні епідеміологічне значення можуть мати рикетсіози всіх груп, окрім гарячки цуцугамуші, яка реєструється в зонах тропічного клімату. Відповідно, лабораторна діагностика повинна здійснюватись відносно рикетсіозів груп висипного тифу, кліщової плямистої гарячки, волинської та Ку-гарячок.
Клінічна діагностика рикетсіозів досить важка. Переважно легкий, а іноді й атиповий клінічний перебіг захворювань, розмаїття клінічних проявів значно утруднюють клінічну діагностику, особливо при виникненні захворювань на територіях, де зовсім або тривалий час рикетсійна інфекція не реєструвалась, а епідеміологічна насторога до цих інфекцій у медичних працівників залишається на низькому рівні. За даними багаторічних спостережень в Україні клінічно діагноз висипного тифу майже не виставляється: 4,5-5,0% хворим при госпіталізації встановлювався діагноз висипного тифу (хвороби Бриля), решті хворим - на основі результатів лабораторного обстеження. Інші діагнози при госпіталізації були: тифо-паратифозне захворювання - 6,9%, грип та ГРВІ - 62,1%, пневмонія - 13,0%, та інші.
Волинська (п'ятиденна) гарячка при значному поширенні в Україні не реєструється через труднощі в клінічній діагностиці, а лабораторні методи практично не застосовуються.
Гарячка Ку має строкату, поліморфну клінічну картину. Виділяють різні форми: грипоподібну, септичну, бронхопневмонічну, нервову, субфібрильну, латентну та інші. Діагностичні помилки зводяться, в основному, до встановлення діагнозу грипу в 35,9%, черевного тифу - 32,8%. Діагностика спорадичних випадків, при відсутності епідеміологічних даних, практично неможлива без лабораторних досліджень, а хронічні та латентні форми хвороби діагностуються тільки лабораторно. Навіть під час епідемічних спалахів гарячки Ку у раніше невідомих ендемічних вогнищах коксіельозу в західному регіоні України, в жодному випадку не було поставлено клінічного діагнозу, і лише застосування, в ході епідеміологічного обстеження, серологічних методів досліджень допомогло провести етіологічну розшифровку спалахів.
Аналогічна ситуація спостерігалась під час епідемічного спалаху кліщового рикетсіозу (марсельської гарячки) в АР Крим, в невідомому раніше ендемічному вогнищі. Використанням лабораторних методів виявили не тільки клінічно виражені форми захворювань в епідемічних (сімейних) вогнищах інфекції, а й атипові та безсимптомні форми у осіб, які не звертались за медичною допомогою і вважали себе здоровими або перенесли невідоме гарячкове захворювання. Питома вага таких хворих під час епідемічних спалахів становила 25-30% і більше. В епідемічних вогнищах діагностувались захворювання і ретроспективно.
Враховуючи труднощі клінічної діагностики, провідне місце в системі епідеміологічного контролю за рикетсіозами займають лабораторні методи досліджень. Вони обов'язкові для підтвердження як спорадичних, так і епідемічних захворювань.
Організація роботи лабораторій
Ефективна діагностика рикетсійних захворювань можлива при забезпеченні єдиної системи організації роботи лабораторій і проведення досліджень в країні.
При діагностиці висипного тифу і хвороби Бриля обов'язкове застосовування реакцій зв'язування комплементу, непрямої гемаглютинації та аглютинації з антигенами рикетсій Провачека. Первинну (скринінгову) лабораторну діагностику висипного тифу (хвороби Бриля) здійснюють за допомогою реакції аглютинації рикетсій у всіх лабораторіях рай(міськ)санепідстанцій, лікувально-профілактичних закладів, інфекційних лікарнях. Для постановки реакції аглютинації використовується антиген рикетсій Провачека, культивований за методом Вейгля, виробництва ДП "Львівдіалік". Природне забарвлення антигену забезпечує більш чіткі результати реакції, що зменшує елемент суб'єктивності при обліку результатів. При відсутності такого антигену може бути використаний безбарвний антиген для реакції аглютинації виробництва НВО "Біомед", м. Перм.
В більш потужних лабораторіях рай(міськ)санепідстанцій, лікувально-профілактичних закладів, інфекційних лікарень та в лабораторіях відділів ОНІ обл(міськ)санепідстанцій поряд з реакцією аглютинації, застосовують реакції зв'язування комплементу та непрямої гемаглютинації; в лабораторіях відділів ОНІ - також метод флуоресціюючих антитіл.
Лабораторна діагностика гарячки Ку, рикетсіозів групи кліщової плямистої гарячки та волинської (п'ятиденної) гарячки здійснюється за допомогою реакції зв'язування комплементу з відповідними рикетсійними антигенами в лабораторіях рай(міськ)санепідстанцій, лікувально-профілактичних закладах, інфекційних лікарнях, при наявності в них відповідних умов та імунобіологічних препаратів, а також лабораторіях відділів ОНІ обл (міськ) санепідстанцій де, крім реакції зв'язування комплементу, застосовують метод флуоресціюючих антитіл.
Усі сироватки з позитивними або сумнівними результатами надсилають в лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій обл(міськ)санепідстанцій для контрольних досліджень.
Лабораторії відділів ОНІ обл(міськ)санепідстанцій здійснюють:
- організаційно-методичну роботу з лабораторної діагностики рикетсіозів в областях, аналіз стану і ефективності її в області та по кожному районі, в тому числі в сільській місцевості, підготовку спеціалістів на робочих місцях;
- діагностичні дослідження на рикетсіози в реакціях зв'язування комплементу, непрямої гемаглютинації, аглютинації рикетсій, методі флуоресціюючих антитіл, а також контрольні дослідження позитивних та із сумнівними результатами сироваток крові хворих, що надсилають рай (міськ) санепідстанції; направлення позитивних сироваток в Український центр з рикетсіозів МОЗ України;
- дослідження (індикація збудника) експресними методами (методи флуоресціюючих антитіл, реакції непрямої гемаглютинації, нейтралізації антитіл - РНАТ) біологічного матеріалу (воші, кліщі, органи тварин тощо) та об'єктів довкілля (при необхідності);
- аналіз забезпечення імунобіологічними діагностичними препаратами лабораторій, що здійснюють діагностику рикетсіозів;
Центральна санепідстанція МОЗ України здійснює:
- організаційно-методичну роботу з лабораторної діагностики рикетсіозів в країні, контроль правильності та ефективності використання методів дослідження, діагностичні дослідження на рикетсіози;
- дослідження (індикація збудника) методами експрес-діагностики (флуоресціюючі антитіла, реакції непрямої гемаглютинації, нейтралізації антитіл - РНАТ) біологічного матеріалу (воші, кліщі, органи тварин тощо) та об'єктів довкілля (при необхідності);
- аналіз стану лабораторної діагностики та підготовку спеціалістів на робочих місцях;
Український центр з рикетсіозів МОЗ України здійснює:
- консультативні та підтверджуючі дослідження сироваток крові хворих, в тому числі для диференціації первинної і повторної висипнотифозної інфекції, гострої та хронічної форм гарячки Ку шляхом визначення класів імуноглобулінів;
- індикацію та ідентифікацію збудників в біологічних об'єктах з вогнищ інфекції;
- контрольні дослідження антигенних діагностичних препаратів та розробку нових ІБП;
- підготовку спеціалістів на семінарах та робочих місцях.
- розробка нових методів лабораторної діагностики рикетсіозів.
Лабораторна діагностика рикетсіозів
1. Серологічні методи діагностики рикетсіозів
Серологічні методи діагностики рикетсіозів, основані на виявленні в крові хворого антитіл, - високо специфічні і чутливі, дозволяють проводити не тільки міжгрупову, але й внутрішньогрупову диференціацію збудників. Серологічні реакції із специфічними рикетсійними антигенами в різних варіантах: реакції зв'язування комплементу (РЗК), непрямої гемаглютинації (РНГА), аглютинації рикетсій (РАР) та методи флуоресціюючих антитіл - прямий (МФА) і непрямий (нМФА), розроблені і апробовані стосовно всіх груп рикетсіозів. Інші серологічні тести, зокрема - реакція нейтралізації токсичної субстанції рикетсій (РНТСР), імуноферментного аналізу (ІФА) та інші, сьогодні не можуть бути рекомендовані для широкого практичного застосування в Україні через відсутність необхідних умов для роботи із збудниками та відповідних тест-систем.
Вірогідність результатів серологічних методів діагностики визначається в значній мірі якістю діагностичних антигенних препаратів та інших інгредієнтів, що застосовуються в цих реакціях. Тому контроль специфічності та чутливості інгредієнтів при відтворенні серологічних тестів, а також термінів їх придатності і умов зберігання є обов'язковим для забезпечення якісної діагностики.
1.1. Реакція зв'язування комплементу
Реакція зв'язування комплементу (РЗК) є високо специфічним і чутливим лабораторним методом діагностики рикетсіозів, дозволяє визначати в крові специфічні комплементзв'язуючі антитіла як при гострому захворюванні, так і анамнестичного характеру - після перенесеного в минулому захворювання. Тому РЗК є придатною для поточної і ретроспективної діагностики рикетсіозів та вивчення імунологічної структури населення при епідеміологічних обстеженнях.
Суть методу полягає у зв'язуванні комплементу специфічним комплексом антиген + антитіло, що визначається в присутності індикатора - баранячих еритроцитів, сенсибілізованих гемолітичною сироваткою. При утворенні специфічного комплексу антиген + антитіло доданий комплемент зв'язується цим комплексом, внаслідок чого після додавання гемолітичної системи не виникає лізис баранячих еритроцитів. Якщо ж комплекс антиген + антитіло не утворюється, вільний комплемент забезпечує лізис сенсибілізованих еритроцитів (гемоліз). При позитивному результаті РЗК спостерігається затримка гемолізу і еритроцити осідають на дно пробірки; при від'ємному результаті РЗК спостерігається феномен гемолізу, рідина забарвлюється гемоглобіном.
Для постановки РЗК необхідно мати такі інгредієнти: досліджувану сироватку; діагностикум; комплемент; гемолітичну сироватку; еритроцити барана.
Реакцію проводять в об'ємі 1,0 мл, тобто по 0,2 мл кожного інгредієнта (класичний варіант реакції) або в об'ємі 0,5 мл - по 0,1 мл кожного інгредієнта.
Обов'язковою умовою постановки РЗК є використання точно відтитрованих інгредієнтів.
Для забезпечення вірогідності одержуваних результатів необхідно користуватись окремим посудом (пробірки, піпетки, колби), добре вимитим і висушеним в сухожаровій шафі. Для кожного інгредієнта реакції використовують окрему піпетку. Для розведення інгредієнтів використовують свіжо виготовлений стерильний ізотонічний (0,9%) розчин хлориду натрію в дистильованій воді (далі в тексті - фізіологічний розчин).
Першу фазу реакції, тобто зв'язування комплементу, можна проводити при температурі 37 град. С або шляхом тривалого зв'язування на холоді (4 град. С). Останній спосіб більш чутливий, ніж перший, однак потребує більш тривалого часу для завершення дослідження (біля 24 г.). Тому для досліджень звичайно застосовують метод постановки РЗК в умовах термостату, що дозволяє завершити дослідження протягом одного дня.
Досліджувані в РЗК сироватки мають бути відділені від еритроцитів, не мати ознак сильного гемолізу і бактерійного забруднення, оскільки будуть проявляти антикомплементарну дію. Напередодні або в день постановки РЗК сироватки необхідно інактивувати у водяній бані при 56 град. С протягом 30 хвилин для звільнення від комплементу; сироватки інактивують не розведені або в розведенні 1:5, 1:10.
Рикетсійні діагностикуми, що використовують для РЗК, повинні відповідати таким вимогам: бути специфічними, містити не менше двох антигенних одиниць в робочому розведенні і не проявляти антикомплементарної дії. Антигени титрують на підприємствах, що виготовляють їх. Тому для РЗК використовують антигени в робочому розведенні згідно паспортних даних підприємства. Кожну нову одержану серію антигена необхідно перевірити на специфічність та чутливість постановкою РЗК із типовою специфічною та гетерологічною сироватками. Антиген повинен реагувати в РЗК до титру сироватки.
Для титрування діагностикум розводять фізіологічним розчином в ряд пробірок 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. В 3 ряди пробірок додають по 0,2 мл кожного розведення антигена (в перші пробірки наливають по 0,2 мл розчиненого, але не розведеного антигена). Потім до антигена додають: в перший ряд пробірок по 0,2 мл специфічної стандартної сироватки в чотирьохразовому титрі (при титрі 1:320 беруть 1:80), в другий ряд - по 0,2 мл неспецифічної протирикетсійної сироватки в розведенні 1:20, в третій ряд - по 0,2 мл фізіологічного розчину. Паралельно ставлять контроль специфічної і неспецифічної сироваток на антикомплементарність: в окремі 2 пробірки наливають по 0,2 мл сироватки (в тому ж розведенні, що і в досліді), а замість антигена додають по 0,2 мл фізіологічного розчину.
Потім у всі пробірки додають по 0,2 мл комплементу в робочій дозі (див. титрування комплементу) і ставлять контроль комплементу (0,2 мл комплементу + 0,4 мл фізіологічного розчину). Пробірки струшують і поміщають на одну годину в термостат (37 град. С). Після експозиції додають гемолітичну систему (див. нижче), пробірки знову після струшування вміщують в термостат на 20-30 хвилин до завершення гемолізу в контролях і враховують результат. За титр антигена приймають його розведення, в якому спостерігається затримка гемолізу не менше ніж на 3+ при 4-плюсовій шкалі оцінки гемолізу. Схема титрування антигена наведена в таблиці 1.
Комплемент - свіжовиготовлений (сироватка крові від 2-3 морських свинок, взятої напередодні досліду) або консервований - титрують кожний раз в день постановки досліду. Для тривалого зберігання свіжовиготовлений комплемент стерильно розливають у пробірки і заморожують в рефрижераторі при температурі - мінус 10-мінус 20 град. С. Заморожування-розморожування комплементу не допускається, оскільки він втрачає свою активність.
Гемолітичну сироватку, котра являє собою сироватку крові кроля, імунізованого за певною схемою суспензією еритроцитів барана, титрують на підприємстві, що виготовляє цей препарат. На етикетці ампули гемолітичної сироватки вказано її титр. Для постановки РЗК використовують гемолітичну сироватку у робочому титрі, який у три рази менший розведення, вказаного на етикетці. Наприклад, титр гемолітичної сироватки, за паспортними даними, дорівнює 1:1800, робочий титр її має бути 1:600.
При необхідності (тривале зберігання сироватки, одержання нечітких результатів реакції з досліджуваними сироватками) проводять титрування гемолітичної сироватки на місці. Доцільно титрувати гемолітичну сироватку також при одержані нових серій. Для цього готують розведення гемолітичної сироватки 1:100 (0,1 мл гемолітичної сироватки + 9,9 мл фізіологічного розчину), з якого проводять подальші розведення сироватки залежно від титру її, вказаного на етикетці (звичайно від 1:600 до 1:3000).
В ряд пробірок послідовно розливають по 0,2 мл кожного розведення сироватки; користуючись однією піпеткою, відмірювання проводять в зворотному порядку, починаючи з максимального розведення сироватки. В кожну пробірку додають по 0,2 мл комплементу в розведенні 1:10 та по 0,2 мл 3%-ої суспензії еритроцитів барана; потім доливають в кожну пробірку по 0,4 мл фізіологічного розчину. Суміш компонентів старанно перемішують, витримують в термостаті (37 град. С) протягом години і враховують результат. За титр гемолітичної сироватки приймають максимальне її розведення, здатне викликати повний гемоліз еритроцитів барана. Схема титрування гемолітичної сироватки наведена в таблиці 2.
Таблиця 1
Схема титрування антигена
-------------------------------------------------------------------
| Ряд |Інгредієнти, | Розведення антигена | Контролі |
| про-| мл |----------------------------+----------------|
|бірок| | Не |1:2 | 1:4 |1:8 |1:16 |сирова-|компле- |
| | |розве-| | | | | тки |менту |
| | |дений | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 1 |Антиген | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Сироватка | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | 0,2 | |
| |специфічна | | | | | | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Комплемент | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Фізіологічний| | | | | | 0,2 | 0,4 |
| |розчин | | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 2 |Антиген | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Сироватка | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | 0,2 | |
| |неспецифічна | | | | | | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Комплемент | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Фізіологічний| | | | | | 0,2 | 0,4 |
| |розчин | | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 3 |Антиген | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Фізіологічний| 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
| |розчин | | | | | | | |
| |-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| |Комплемент | 0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 | 0,2 | | |
|-----+-----------------------------------------------------------|
| |Поміщають на 1 годину в термостат (37 град. С) |
| |Додають гемолітичну систему по 0,4 мл з 1-3% еритроцитів |
| |Поміщають в термостат (37 град.С) на 30 хвилин |
|-----+-----------------------------------------------------------|
| |Облік результатів: |
|-----+-----------------------------------------------------------|
| 1 |Специфічна | ++++ |++++| +++ | + | - | - | - |
| |сироватка | | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 2 |Неспецифічна | - | - | - | - | - | - | - |
| |сироватка | | | | | | | |
|-----+-------------+------+----+-----+----+-----+-------+--------|
| 3 |Без сироватки| - | - | - | - | - | - | - |
-------------------------------------------------------------------
Титр антигена дорівнює 1:4
Таблиця 2
Схема титрування гемолітичної сироватки
---------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, | Розведення гемолітичної сироватки |
|мл |-----------------------------------------------------|
| |1:600|1:900|1:1200|1:1500|1:1800|1:2100|1:2400|1:3000|
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Гемолітична | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |0,2 |
|сироватка | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Суспензія | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |0,2 |
|еритроцитів | | | | | | | | |
|барана (1-3%)| | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Комплемент в | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |0,2 |
|розведенні | | | | | | | | |
|1:10 | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Фізіологічний| 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 |0,4 |
|розчин | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+------+------+------+------+------+------|
|Оцінка | - | - | - | ++ | +++ | ++++ | ++++ |++++ |
|результатів | | | | | | | | |
---------------------------------------------------------------------
Титр гемолітичної сироватки дорівнює 1:1200.
Еритроцити барана заготовляють заздалегідь. Кров, забрану з яремної вени барана, дефібринують у флаконах з скляними бусами шляхом струшування протягом 10-15 хв., проціджують через стерильну марлю і зберігають у рефрижераторі. Для зберігання еритроцити консервують за допомогою консерванту такого складу: борна кислота - 4 г, глюкоза - 6 г, фізіологічний розчин до 100 мл.
Розчин стерилізують кип'ятінням на водяній бані по 20 хвилин 3 дні підряд. Консервант додають до дефібринованої крові з розрахунку 15 мл на 100 мл крові. Консервовані таким способом еритроцити можна зберігати в рефрижераторі (4 град. С) протягом 2-3 місяців.
В день проведення досліду еритроцити відмивають фізіологічним розчином до зникнення ознак гемолізу центрифугуванням протягом 10-15 хвилин при 1500 об/хв; з осаду готують 1-3%-у суспензію еритроцитів у фізіологічному розчині.
Для виготовлення гемолітичної суміші (гемолітичної системи) беруть рівні об'єми суспензії еритроцитів (1-3%) і гемолітичної сироватки в розведенні, що дорівнює її потрійному титру (робочий титр). Змішані еритроцити і гемолітичну сироватку витримують в термостаті (37 град. С) протягом 30 хвилин для сенсибілізації.
Багаторічні спостереження, проведені Українським центром з рикетсіозів, показали, що при постановці РЗК (титрування комплементу, основний дослід) доцільно використовувати не 3%-у, а 2%-у і навіть 1%-у суспензію еритроцитів барана для гемолітичної системи, що дозволяє при високій чіткості результатів реакції економити використання комплементу в 3,5 рази, а еритроцитів барана - в 3,75 разів.
Порядок постановки РЗК. Перед основним дослідом РЗК проводять титрування комплементу для визначення його робочої дози. Із основного розведення комплементу 1:10 в ряд пробірок розливають мікропіпеткою різні дози розведеного комплементу з інтервалом 0,01 мл. Далі в пробірки з комплементом додають фізіологічний розчин до об'єму 0,6 або 0,3 мл і гемолітичну систему, попередньо сенсибілізовану протягом 30 хвилин в термостаті (по 0,4 або 0,2 мл). Суміш після перемішування поміщають в термостат (37 град. С) на 30 хвилин і проводять облік результатів.
В таблиці 3 наведена схема титрування комплементу в загальному об'ємі реакції 1,0 та 0,5 мл.
Якщо титрування комплементу проводять в присутності антигена, то в кожну пробірку до комплементу спочатку додають відповідну кількість антигена (0,1 або 0,2 мл) в робочому розведенні, а об'єм доповнюють фізіологічним розчином. Суміш реагентів поміщають в термостат на 1 годину, після чого додають гемолітичну систему і через 30 хвилин інкубації в термостаті проводять облік результатів.
При використанні в досліді не одного, а декількох антигенів, титрування комплементу проводять в присутності всіх видів антигенів, після чого вибирають відповідні дози комплементу.
Таблиця 3
Схема титрування комплементу
------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, мл | N пробірок |
| |-----------------------------------------------|
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
|----------------------------------------------------------------|
| Об'єм реакції 1,0 мл |
|----------------------------------------------------------------|
|Комплемент в |0,03|0,04|0,05|0,06|0,07|0,08|0,09|0,10| 0,11 |
|розведенні 1:10 | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Фізіологічний |0,57|0,56|0,55|0,54|0,53|0,52|0,51|0,50| 0,49 |
|розчин | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Гемолітична |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 | 0,4 |
|система | | | | | | | | | |
|(1% еритроцити +| | | | | | | | | |
|гемолітична | | | | | | | | | |
|сироватка) | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Облік |++++|++++| ++ | - | - | - | - | - | - |
|результатів | | | | | | | | | |
|----------------------------------------------------------------|
| Об'єм реакції 0,5 мл |
|----------------------------------------------------------------|
|Комплемент в |0,03|0,04|0,05|0,06|0,07|0,08|0,09|0,10| 0,11 |
|розведенні 1:10 | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Фізіологічний |0,27|0,26|0,25|0,24|0,23|0,22|0,21|0,20| 0,19 |
|розчин | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Гемолітична |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 |
|система | | | | | | | | | |
|(1% еритроцити +| | | | | | | | | |
|гемолітична | | | | | | | | | |
|сироватка) | | | | | | | | | |
| |----+----+----+----+----+----+----+----+-------|
|Облік |++++|+++ | + | - | - | - | - | - | - |
|результатів | | | | | | | | | |
------------------------------------------------------------------
Оцінка результатів титрування комплементу полягає у визначенні ступеня затримки гемолізу: відсутність гемолізу (повна його затримка) оцінюється чотирма плюсами (4+); майже повна затримка (сліди гемолізу) позначається трьома плюсами (3+); часткова затримка гемолізу позначається двома плюсами (2+), сліди затримки (майже повний гемоліз) - одним плюсом (1+). За одиницю комплементу приймають найменшу його кількість, яка викликає повний гемоліз еритроцитів. В наведеному прикладі ця одиниця дорівнює 0,06 мл комплементу, розведеного 1:10. За повну одиницю приймають другу пробірку з повним гемолізом, в наведеному прикладі - 0,07 мл. Робоча доза комплементу дорівнює кількості його, що відповідає одній повній одиниці комплементу - при проведенні зв'язування в термостаті при 37 град. С протягом однієї години, або двом повним одиницям - при проведенні зв'язування при температурі 4 град. С протягом 16-20 годин. В наведеному прикладі робоча доза комплементу при "гарячому" способі зв'язування дорівнює 0,07 мл, розведеного 1:10, на кожну пробірку, при холодному - 0,14 мл (0,07 x 2 = 0,14). Розрахунок кількості комплементу проводять на загальну кількість пробірок в досліді.
Якщо в роботі виявляється серія комплементу з високою активністю та при використанні гемолітичної системи з 1%-ї або 2%-ї суспензії еритроцитів, комплемент можна титрувати в основному розведенні не 1:10, а 1:20; в основному досліді використовують комплемент також в розведені 1:20.
Постановка основного досліду
Перший етап реакції. Досліджувані сироватки, попередньо інактивовані (56 град. С протягом 30 хвилин), розводять в ряд пробірок в межах 1:10-1:320 і більше (можна починати з 1:5) фізіологічним розчином в об'ємі 0,2 мл. До різних розведень сироваток додають по 0,2 мл антигена і 0,2 мл комплементу в робочій дозі.
Кожний дослід повинен супроводжуватись такими контролями:
1) Контроль усіх досліджуваних сироваток: 0,2 мл сироватки в початковому розведенні + 0,2 мл комплементу в робочій дозі + 0,2 мл фізіологічного розчину;
2) Контроль антигена: 0,2 мл антигена + 0,2 мл комплементу в робочій + 0,2 мл фізіологічного розчину;
3) Контроль комплементу: 0,2 мл комплементу в робочій дозі + 0,4 мл фізіологічного розчину;
4) Контроль гемолітичної системи: 0,6 мл фізіологічного розчину.
Після додавання усіх інгредієнтів суміш в пробірках старанно перемішують і поміщають в термостат при 37 град. С на 1 годину або при "холодному зв'язуванні" - в рефрижератор при 4 град. С на 16-20 годин.
Другий етап реакції. У всі пробірки після одногодинної експозиції в термостаті або зберігання 16-20 годин в рефрижераторі додають по 0,4 мл гемолітичної системи (попередньо сенсибілізованої протягом 30 хвилин в термостаті). Пробірки старанно струшують і поміщають в термостат (37 град. С) на 20-30 хвилин - до проходження гемолізу у всіх контролях, окрім контролю гемолітичної системи.
Облік результатів проводять через одну годину витримування пробірок при кімнатній температурі. Оцінка основного досліду, як і при титруванні комплементу, полягає у визначенні ступеня затримки гемолізу в пробірках з досліджуваними сироватками у порівнянні з відповідними контролями, в яких виник повний гемоліз. Титром сироватки вважають максимальне розведення її, в якому спостерігається затримка гемолізу не менше ніж на 3+ при шкалі оцінки результатів на 4+.
Результати реакції вважають достовірними, якщо в контролях досліджуваних сироваток, антигена і комплементу спостерігається повний гемоліз, а в контролі гемолітичної системи гемоліз відсутній. Для контролю якості інгредієнтів і виконання реакції рекомендується паралельно ставити РЗК з явно позитивною (до її титру) та негативною сироватками. РЗК вважається позитивною з розведення сироватки 1:5-1:10. Схема проведення РЗК в об'ємі 1,0 мл наведена в таблиці 4.
З метою економії препаратів можна виконувати РЗК в загальному об'ємі 0,5 мл (табл.5), а також використовувати 1%-у або 2%-у суспензію еритроцитів барана для гемолітичної системи. Такі модифікації не впливають на кінцевий результат реакції, якщо будуть дотримані однакові умови титрування комплементу і постановки основного досліду РЗК.
Таблиця 4
Схема постановки основного досліду РЗК в об'ємі 1,0 мл
---------------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, | Розведення сироватки | Контролі |
| мл |-------------------------------+---------------------------|
| |1:10|1:20|1:40|1:80|1:160|1:320|сиро-|Анти-|компле-|гемолі-|
| | | | | | | |автки|гена |менту |тичної |
| | | | | | | | | | |системи|
|-------------------------------------------------------------------------|
| Перший етап |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Сироватка |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 | | | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Антиген |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | |0,2 | | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Комплемент |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 |0,2 | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Фізіологічний| | | | | | | 0,2 |0,2 |0,4 | 0,6 |
|розчин | | | | | | | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Інкубація протягом 1 години при 37 град. С |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Другий етап |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Гемолітична |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 | 0,4 |0,4 |0,4 | 0,4 |
|система | | | | | | | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Інкубація протягом 30 хвилин при 37 град. С |
---------------------------------------------------------------------------
Облік результатів після витримування протягом 1 години при кімнатній температурі.
Таблиця 5
Схема постановки основного досліду РЗК в об'ємі 0,5 мл
---------------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, | Розведення сироватки | Контролі |
| мл |-------------------------------+---------------------------|
| |1:10|1:20|1:40|1:80|1:160|1:320|сиро-|Анти-|компле |гемолі-|
| | | | | | | |автки|гена |менту |тичної |
| | | | | | | | | | |системи|
|-------------------------------------------------------------------------|
| Перший етап |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Сироватка |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | 0,1 | | | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Антиген |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | |0,1 | | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Комплемент |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | 0,1 |0,1 |0,1 | |
| |----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-------+-------|
|Фізіологічний| | | | | | | 0,1 |0,1 |0,2 | 0,3 |
|розчин | | | | | | | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Інкубація протягом 1 години при 37 град. С |
|-------------------------------------------------------------------------|
| Другий етап |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Гемолітична |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 |0,2 |0,2 | 0,2 |
|система | | | | | | | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|