Про затвердження галузевих стандартів

На виконання вимог Закону України "Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людині" та відповідно до ДСТУ 1.0-93 "Державна система стандартизації. Основні положення"

1. Затвердити галузевий стандарт "Органна культура ендокринної частини підшлункової залози новонароджених поросят. Критерії визначення якості та методика одержання", що додається.

2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних державних адміністрацій, Головного управління охорони здоров'я Київської міської державної адміністрації та управління охорони здоров'я Севастопольської міської державної адміністрації, керівникам закладів охорони здоров'я, що підпорядковані МОЗ України, прийняти галузевий стандарт до відома та виконання.

3. Головному спеціалісту відділу охорони праці, стандартизації та метрології Головного управління стратегічного планування та нових медичних технологій (головному метрологу МОЗ України) Ніколенко А.М. забезпечити подання затвердженого в п. 1 галузевого стандарту на державну реєстрацію в Державний комітет України з питань технічного регулювання та споживчої політики.

4. Контроль за виконанням наказу покласти на Першого заступника Державного секретаря Гойду Н.Г.

Відтворювати, тиражувати і розповсюджувати цей документ повністю чи частково на будь-яких носіях інформації без офіційного дозволу Координаційного центру трансплантації органів, тканин і клітин МОЗ України заборонено.

Цей стандарт розроблено на виконання статті 3 Закону України "Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людині" від 16.07.99 N 1007-XIV (1).

Цей стандарт поширюється на органну культуру ендокринної частини підшлункової залози новонароджених поросят і встановлює методику одержання та критерії якості органної культури ендокринної частини підшлункової залози новонароджених поросят. Органна культура ендокринної частини підшлункової залози новонароджених поросят (далі - органна культура) використовується в експериментальних дослідженнях та медичній практиці.

Вимоги цього стандарту є обов'язковими для закладів, установ і організацій охорони здоров'я, незалежно від форми власності, що виконують роботи, пов'язані з трансплантацією відповідно до Закону та постанови (1, 2).

У цьому стандарті є посилання на такі нормативні документи:

У цьому стандарті подані такі терміни та визначення:

ксенотрансплантація - пересадка анатомічного матеріалу особині, яка належить до іншого виду;

ксенотрансплантат - анатомічний матеріал, призначений для трансплантації особині, яка належить до іншого виду;

органна культура ендокринної частини підшлункової залози новонароджених поросят - суспензія тканин, отримана певним чином;

культивування - утримання клітин і тканин в певних умовах з метою збереження їх структури, життєздатності та властивостей;

живильне середовище - середовище, у якому клітини і тканини зберігають структуру, властивості, життєздатність;

критерії якості - сукупність вимог, яким повинен відповідати трансплантат;

екстирпація - радикальне видалення органу;

стерильність - відсутність живих мікроорганізмів;

заключення щодо якості ксенотрансплантата - документ встановленої форми, який засвідчує якість трансплантата;

посвідчення лікаря на право видачі заключення щодо якості ксенотрансплантата-документ встановленої форми, виданий атестаційною комісією Координаційного центру трансплантації органів, тканин і клітин МОЗ України;

реципієнт - особа, для лікування якої застосовується трансплантація;

нативний - природний.

КЦТОТіК МОЗ України - Координаційний центр трансплантації органів, тканин і клітин МОЗ України;

СНІД - синдром набутого імунодефіциту;

НД - нормативний документ.

5.1. Критеріями якості органної культури є:

- гормональна активність;

- гістологічна будова;

- імуногенність.

5.1.1. Якість органної культури визначають за наявністю інсуліну у культуральному середовищі, що визначається радіоімунологічним методом. Вміст інсуліну у культуральному середовищі має становити не менше 390 мк од/мл (3).

5.1.2. Важливим показником якості органної культури є її гістологічна будова. При забарвленні альдегід-фуксином фрагментів органної культури визначаються бета-клітини з різним ступенем функціональної активності. Цитоплазма багатьох з них помірно або слабо забарвлюється альдегід-фуксином, при цьому виразно видно контури ядер. Такі клітини складають найбільш активну популяцію.

Частина бета-клітин містять велику кількість альдегід-фуксинофільної зернистості, яка маскує ядро. В процесі культивування відбувається загибель та елімінація частини ендокринних і, особливо, екзокринних клітин, що в середньому складає (14,3 +- 1,2)% загальної маси нативної тканини. Клітинний детрит альдегід-фуксином не забарвлюється (4).

5.1.3. Критерієм якості органної культури також є її імуногенність, яка дозволяє прогнозувати тривалість функціонування трансплантата в організмі реципієнта. Імуногенність не повинна перевищувати показника зворотнього титру, що становить (2,8 +- 0,19) в реакції пасивної гемаглютинації.

6.1. Медико-біологічні вимоги до тварин, відібраних для одержання ксенотрансплантата

Для отримання ксенотрансплантата використовують органи здорових новонароджених поросят (1,5 +- 0,5) год. від народження від особин, здоров'я яких підтверджено документами санітарно-епідеміологічної та ветеринарної служб.

6.2. Умови утримання тварин

Доставку тварин в організацію-виробника здійснюють в спеціальних стерильних контейнерах з дотриманням санітарно-гігієнічних та ветеринарних вимог, з супровідними документами від ветеринарного лікаря про їх стан.

Тварини, відібрані для отримання ксенотрансплантатів, слід утримувати відповідно до санітарно-гігієнічних та ветеринарних вимог.

6.3. Порядок вилучення підшлункової залози

Забір матеріалу для виготовлення ксенотрансплантатів необхідно здійснювати з додержанням загальних принципів гуманного поводження з тваринами та правил асептики і антисептики.

6.3.1. Обладнання, інструменти, матеріали, посуд, реактиви, середовища, сироватки

Обладнання:

бокс ламінарний за діючим НД,

лампи бактерицидні за ТУ 16-535.273,

мікроскоп МБИ-6 за ТУ3-3.ЭД1.828,

мікроскоп "БИОЛАМ" за ТУ3-3.ЭД1.4004,

апарат для культивування тканин з обертанням пробірок за ТУ 64-1-1468,

центрифуга настільна лабораторна ЦНЛ-6 за ТУ У 29.2-02071010.049,

холодильник NORD за ТУ-3-01 України 005-93,

стерилізатор повітряний ГП-20 за ТУ У 42.76007113.004,

мілівольтметр рН-150М за ТУ 25-7410.603,

шафа сушильна для скляного посуду за ТУ 25.2010.001,

кип'ятильник дезинфікаційний електричний за НД,

горілки спиртові за НД.

Інструменти:

ножиці хірургічні прямі, довжиною 150 мм за ТУ 64-1-64,

ножиці зігнуті для розтину м'яких тканин за ТУ 64-1-64,

ножиці для мікрохірургії за ТУ 64-1-2934,

ножиці гильйотинні за ТУ 64-1-433,

пінцети хірургічні загального призначення за ТУ 64-1-37,

пінцети анатомічні загального призначення за ТУ 64-1-1993.

Матеріали:

вата медична гігроскопічна за ГОСТ 5556,

марля медична ГОСТ 9412-77,

папір обгортковий ГОСТ 8273,

засіб миючий для скла за НД.

Посуд:

пляшки скляні, закриті гумовими пробками за ТУ У 6-0015225014 (далі - пляшки),

чашки Петрі ГОСТ 25336,

піпетки мірні з поділками ГОСТ 29227,

підноси емальовані за ДСТУ 3276-95.

Реактиви:

спирт етиловий ректифікований ГОСТ 18300,

йод ГОСТ 4159,

водню перекись ГОСТ 177,

натрій гідрокарбонат ГОСТ 4201,

кислота сірчана ГОСТ 4204,

калій двохромовокислий ГОСТ 4220,

натрій хлористий ГОСТ 4233,

вода дистильована ГОСТ 5556,

хлорамін Б технічний за ТУ 6.01-4689387-16.

Середовища:

розчин Хенкса ДФ, Х1, вып 2,

середовище 199 ДФ, Х1, вып 2.

Сироватки:

сироватка великої рогатої худоби за діючим НД,

сироватка теляча ембріональна за діючим НД.

6.3.2. Підготовлення посуду:

Посуд закладають на 1 добу у підігрітий до 50 град. C 3%-ний розчин миючого засобу для скла, ретельно промивають проточною водою, після чого посуд переносять у 5%-ний розчин двохромовокислого калію в концентрованій сірчаній кислоті. Знову промивають проточною водопровідною, а потім дистильованою водою. Посуд висушують у сушильній шафі за температури 120 град. C, охолоджують до кімнатної температури, загортають у папір і стерилізують у сушильній шафі за температури 180 град. C протягом (1,35 +- 0,3) год.

Підготовлення боксу:

Перед роботою бокс ретельно миють 3%-ним розчином хлораміну, а потім піддають дії ультрафіолетових променів протягом (1 +- 0,2) год. Бактерицидні лампи слід вимкнути за (30 +- 0,3) хв. до початку роботи. Поверхню столів у боксі безпосередньо перед початком роботи обробляють згідно діючої інструкції. Ріжучі інструменти на (1 +- 0,5) год. до початку роботи кладуть у ємність з 96 град. спиртом, усі інші інструменти стерилізують у кип'ятильнику дезинфікаційному протягом (3 +- 0,3) год.

6.3.3. Порядок вилучення підшлункової залози

Поросят забивають ножицями гільйотинними. Екстирпацію підшлункової залози здійснюють з дотриманням жорстких правил асептики і антисептики. Забиту тварину старанно миють проточною водою, температура якої становить (45 +- 1) град. C та кладуть на правий бік на стерильний піднос. Шкіру лівого боку обробляють спочатку 96 град. спиртом, а потім 2,5%-ним спиртовим розчином йоду. Стерильним інструментом роблять надріз шкіри на лівій стороні черевини паралельно реберній дузі довжиною (8,0 +- 0,5) см після чого розрізають м'язовий шар, відкривають черево. Видаляють селезінку та обережно вилучають хвостову частину підшлункової залози. Видалену частину підшлункової залози поміщають у пляшки з (3 +- 0,05) мл розчину Хенкса та пеніциліном 100 од/мл і подрібнюють ножицями до фрагментів розміром 1 мм х 1 мм.

6.3.4. Приготування органної культури

Подрібнений матеріал відмивають шість разів охолодженим до (4 +- 0,1) град. C розчином Хенкса з антибіотиком і вміщують у пляшки з (5 +- 0,1) мл повного живильного середовища.

Примітка. Склад повного живильного середовища: середовище 199 у кількості (450 +- 0,5) мл, сироватка великої рогатої худоби (45 +- 2) мл, сироватка теляча ембріональна (23 +- 1) мл, пеніцилін 100 од/мл 5%-ним розчином натрію гідрокарбонату доводять рН до 7.

Суспензію поміщають у холодильник за температури (4 +- 0,1) град. C, на (60 +- 1,5) хв, після чого пляшки вставляють у апарат для культивування тканин з швидкістю обертання 2 об/хв та поміщають для культивування у термостат, де витримують за температури (24 +- 0,2) град. C.

Перші три дні культивування заміну живильного середовища слід проводити вранці та ввечері через кожні (12 +- 0,1) год., а надалі - 1 раз на добу ввечері, в один і той же час. Необхідно щоденно контролювати стерильність органної культури. Загальний час культивування становить (5 +- 0,1) діб.

Перед введенням в організм реціпієнта органну культуру слід 7 разів відмити від живильного середовища фізіологічним розчином за температури (24 +- 0,3) град. C, додати (10 +- 0,2) мл фізіологічного розчину та утримувати в ньому до підсадки в організм реципієнта, але не більше (15 +- 0,5) хв.

За добу до використання органної культури в клініці обов'язково проводять її морфо-гормонально-імунологічний та бактеріо-вірусомікологічний контроль.

- бактеріологічний;

- вірусологічний;

- мікологічний.

Органна культура проходить тестування на стерильність згідно з діючою інструкцією. Бактеріологічний контроль проводиться з метою виключення забруднення органної культури грампозитивними та грамнегативними аеробними та анаеробними бактеріями згідно з діючою інструкцією (5, 6, 8).

Також здійснюють контроль за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, яка дозволяє визначити та вилучити органну культуру, заражену мікроорганізмами мікоплазми, блідої трепонеми (сифиліс), токсоплазми, вірусами СНІДу (HIV-1/HIV-2), гепатиту (В і С), краснухи, цитомегаловірусу і герпеса (5, 6).

Усі наведені вище роботи проводяться в умовах акредитованої лабораторії та за наявності атестованих методик виконання вимірювань відповідно до Закону України "Про метрологію та метрологічну діяльність" (7).

До виконання робіт з вирощування та визначення якості органних культур допускаються особи з вищою медичною чи біологічною освітою.

Вирощені органні культури реєструють в обліковому журналі установи-виробника органної культури.

Якість органної культури засвідчується заключенням щодо якості ксенотрансплантата.

Форма заключення щодо якості ксенотрансплантата наведена у додатку А.

Заключення щодо якості ксенотрансплантата видає фахівець з вищою медичною освітою, що атестований на право видачі такого заключення атестаційною комісією Координаційного центру трансплантації органів, тканин і клітин МОЗ України.

Форму посвідчення лікаря на право видачі заключення щодо якості ксенотранспланта наведено у додатку Б.

Посвідчення лікаря-ксенотрансплантолога видане на підставі рішення атестаційної комісії КЦТОТіК МОЗ України

від "___" _______________ 200 р.

1. Закон України "Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людині" від 16.07.99 N 1007-XIV.

2. Постанова Кабінету Міністрів України від 24.04.2000 року N 695.

3. Методические рекомендации МЗ Украины "Использование трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы новорожденных поросят при лечении сахарного диабета", 1993.

4. Gabe M. Sur guelques applications de la coloration par la fuchsine - paraldehyde // Bull. microsc appl.- 1953.- N 3, V. 11-12, - P. 153-162.

5. Технологічний регламент, МОЗ України, 1995.

6. Наказ МОЗ СРСР від 03.09.1991 N 254.

7. Закон України "Про метрологію та метрологічну діяльність" від 11.02.98 N 113/98-ВР.

8. Наказ Міністерства охорони здоров'я України від 25.09.2000 року N 226.

Ключові слова: ксенотрансплантат, органна культура, ендокринна частина підшлункової залози, новонароджені поросята, критерії якості, методика одержання.