МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ
Н А К А З
| N 371 від 05.12.2002 |
Про затвердження ГСТУ 46.024-2002 "Препарати ветеринарні. Методи визначення нешкідливості"
З метою заміни нормативних документів, затверджених відповідними органами колишнього Союзу РСР, на вітчизняні
НАКАЗУЮ:
1. Затвердити галузевий стандарт України ГСТУ 46.024-2002 "Препарати ветеринарні. Методи визначення нешкідливості", що додається, і ввести його в дію з 1 січня 2003 року.
2. Установити, що цей стандарт поширюється на всю територію України і є обов'язковим до застосування всіма суб'єктами господарювання незалежно від форм власності та видів діяльності, за погодженням з Мінагрополітики України.
3. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника Державного секретаря Шмідта Р.М.
| Міністр | С.Рижук |
ГСТУ 46.024-2002
ГАЛУЗЕВИЙ СТАНДАРТ УКРАЇНИ
________________________________________________________
ПРЕПАРАТИ ВЕТЕРИНАРНІ
Методи визначення нешкідливості
Видання офіційне
Міністерство аграрної політики України
| Київ 2002 |
ГСТУ 46.024-2002
ГАЛУЗЕВИЙ СТАНДАРТ УКРАЇНИ
________________________________________________________
ПРЕПАРАТИ ВЕТЕРИНАРНІ
Методи визначення нешкідливості
ПРЕПАРАТЫ ВЕТЕРИНАРНЫЕ
Методы определения безвредности
________________________________________________________
| Дата введення: 2003-01-01 |
1. Галузь використання
Цей стандарт установлює порядок, вимоги до методів, принципи визначення нешкідливості препаратів ветеринарних (імунобіологічних, рослинних, хімічних, хіміко-фармацевтичних тощо) та кормових добавок на стадіях розробки, виробництва, транспортування, зберігання, реалізації, використання, а також у спірних випадках.
Вимоги цього стандарту є обов'язковими для підприємств, організацій, установ на території України, а також для суб'єктів підприємницької діяльності незалежно від форм власності.
2. Нормативні посилання
У цьому стандарті наведені посилання на такі стандарти і нормативні документи:
3. Терміни та визначення
У цьому стандарті подані такі терміни та визначення
4. Загальні положення
4.1. Препарати за своїм призначенням, біологічними, фізичними, хімічними властивостями, об'ємом упаковки і агрегатним станом дуже різноманітні.
4.2. Цим стандартом передбачається встановити основні загальні принципові положення визначення нешкідливості препаратів для оцінки їх якості.
4.3. Для розроблення НД і проведення перевірки препарату на нешкідливість визначають:
доцільність перевірки на нешкідливість будь-якого препарату;
біологічний об'єкт, за допомогою якою перевіряється препарат (вид, порода, стать, вік, маса тіла тварини, ембріони, клітини тощо);
спосіб уведення і доза препарату, який вводиться;
терміни спостереження,
показники, за якими оцінюється препарат, критерії оцінки.
4.4. Визначають нешкідливість усіх препаратів, які застосовуються на біологічних об'єктах, у тому числі на спермі, ембріонах тощо, якщо це передбачено НД.
Показники визначення нешкідливості
Примітки:
1. Стерильність та пірогенність препаратів визначається обов'язково за умови парентерального їх введення.
2. Залежно від специфіки препаратів визначення додаткових показників нешкідливості проводиться згідно з вимогами нормативних документів.
5. Методи відбору проб (зразків)
5.1. Відбір проб проводять згідно з вимогами нормативного документа на препарат або вимогами Державної фармакопеї України, або цього Галузевого стандарту України
5.2. Для визначення токсичності відбір проб здійснюють згідно з Державною фармакопеєю України, вид. I, с. 109 "Аномальна токсичність".
5.3. Для проведення досліджень фасованого препарату відбирають не менше 2 одиниць (флакони або ампули) кожної серії, яка містить не більше 10000 одиниць. Якщо кількість одиниць у серії препарату більша ніж 10000, то відбирають по 3 одиниці кожної серії із відібраних проб готують об'єднану пробу.
Загальна кількість відібраного препарату повинна бути достатньою для проведення трьох повних досліджень.
5.4. Для визначення пірогенності відбір проб здійснюють згідно з вимогами Державної фармакопеї України, вид. I, с. 107 "Пірогени".
Для проведення досліджень відбирають не менше 2 одиниць (флакони або ампули) кожної серії, яка містить від 1000 до 10000 флаконів або ампул. Якщо кількість одиниць досліджуваної серії більша ніж 10000, то відбирають по 3 одиниці. Якщо серія містить менше 1000 одиниць, для досліджень відбирають по 1 одиниці. З відібраних проб готують об'єднану пробу.
5.5. Речовини гістаміноподібної дії визначають згідно з вимогами Державної фармакопеї України, вид. I с. 110 "Депресорні речовини".
Для проведення досліджень відбирають не менше 2 одиниць (флакони або ампули) кожної серії, яка містить не більше 1000 одиниць. Якщо кількість одиниць серії більша ніж 10000, то для досліджень відбирають по 3 одиниці кожної серії із відібраних проб готують об'єднану пробу.
5.6. Для визначення анафілактогенності та місцево-подразнюючої дії проби відбирають наступним чином: якщо препарати запаковані, то для проведення дослідження відбір проб проводиться багатоступеневим способом. Багатоступеневий відбір проб препарату передбачає відбір проб ступенями за принципом випадковості, пропорційно кількості одиниць, які відібрані на попередньому ступені. Число ступенів визначається видом упакування (упаковки).
I-й ступінь: відбір одиниць пакувальної тари (ящики, коробки, мішки тощо).
II-й ступінь: відбір пакувальних одиниць, які знаходяться в пакувальній тарі (коробки, банки, флакони тощо).
III-й ступінь: відбір одиниць первинного упакування (ампули, флакони, туби, контурні пакування тощо).
Для розрахунку кількості препарату на кожному ступені використовують формулу 0,4#п, де п - кількість пакувальних одиниць певного ступеню однієї серії (партії). Дробове число, одержане в результаті підрахунків, заокруглюють у бік збільшення до цілого числа. Воно повинно бути не меншим 3 і не більшим 30.
Якщо відібраної кількості препарату недостатньо для проведення трьох послідовних досліджень, тоді додатково відбирають пакувальні одиниці у такий самий спосіб.
Відібрані проби запаковують та зберігають згідно з вимогами діючого нормативного документу.
5.7. Відбір проб у розфасовці "ангро".
Проба препарату розфасовки "ангро" повинна об'єднувати точкові проби, відібрані приблизно у рівних кількостях.
Точкові проби відбирають з верхнього, середнього та нижнього шарів кожної пакувальної одиниці. Переконуються в однорідності відібраних проб (зовнішній огляд) і змішують їх.
Окремі точкові проби відбирають для перевірки сипучих, в'язких та гетерогенних форм препаратів.
Для відбору проб сипучих та в'язких препаратів проби відбирають за допомогою пробовідбірника, виготовленого з нейтрального до цього препарату матеріалу.
Рідкі препарати перед відбором точкових проб ретельно перемішують. Точкові проби відбирають за допомогою трубок, виготовлених з твердого матеріалу, який не взаємодіє з досліджуваним препаратом.
У випадках, якщо рідкий препарат неможливо перемішати, точкові проби відбирають без перемішування з різних шарів.
Загальна кількість відібраного препарату повинна бути достатньою для проведення трьох послідовних досліджень.
6. Матеріали та біологічні об'єкти
6.1. Для проведення випробувань використовують:
пінетки мірні ємністю під 1 до 10 куб. см згідно з ГОСТ 29230;
шприци ємністю від 1 до 5 см3 згідно з ГОСТ 22967;
голки ін'єкційні згідно з ГОСТ 25366;
голки з наплавленим оловом діаметром 1 мм (для перорального введення);
спирт ректифікований згідно з ТУ У 46.15.398-99
розчин натрію хлориду 9 г/л (фізіологічний розчин);
корки гумові згідно з ТУ У 6.00152253.014-96 або ватно-марлеві згідно з ГОСТ 22379;
флакони скляні ємністю згідно з ТУ У 00480945.006.98, ТУ У 00333888.003-98, ТУ У 00480810.001-98
корки скляні згідно з ГОСТ 25336;
піпетки очні;
олію соняшникову згідно з ГОСТ 1129;
крохмаль згідно з ГОСТ 10163;
молоко згідно з ГОСТ 13264;
яєчний жовток (яйце куряче згідно з ГОСТ 27583);
ОП-7, ОП-10 згідно з ГОСТ 8433;
зонд шлунковий;
воду дистильовану згідно з ГОСТ 6709;
воду питну згідно з ГОСТ 2874;
миші білі;
свинки морські;
щурі білі;
кролі;
поросята;
курчата;
норки;
цуценята;
нутрії;
підсвинки;
вівці;
тхорофретки;
телята;
сперму та ембріони тварин тощо.
6.2. Для дослідження використовують лише клінічне здорових тварин. Необхідно враховувати добові та сезонні біоритми організму піддослідних тварин. Препарат вводять в організм досліджуваних тварин у один і той же час доби.
7. Підготовка проб препаратів та способи уведення
7.1. Об'єднану пробу рідких форм препаратів, яка не потребує додаткового розведення, вносять у стерильний флакон.
7.2. Об'єднану пробу ліофілізованих препаратів попередньо ресуспензують у стерильному розчиннику, який повинен відповідати робочому розведенню препарату.
7.3. Об'єднану пробу порошкоподібних форм препаратів (таблетки і гранули попередньо подрібнюють) розчиняють у відповідному розчиннику.
7.4. Для дослідження препаратів формують дослідні та контрольні групи клінічно здорових тварин. Тваринам дослідної групи вводять досліджуваний препарат. Тваринам контрольної групи вводять розчинник. Для дослідження вакцин дослідних тварин обов'язково перевіряють на відсутність специфічних антитіл.
7.5. Досліджувану пробу препарату перед уведенням в організм тварини перемішують.
7.6. Уведення препарату в організм тварин здійснюють одним із наведених нижче способів.
7.6.1. Внутрішньовенний.
Тест-дозу препарату вводять у бічну вену хвоста миші, у вену вуха кроля, у будь-яку доступну вену для інших видів тварин.
7.6.2. Внутрішньом'язовий.
Тест-дозу препарату вводять у м'яз стегна тварини.
7.6.3. Внутрішньочеревний.
Тест-дозу досліджуваного препарату вводять у черевну порожнину.
7.6.4. Підшкірний.
Тест-дозу препарату уводять під шкіру, як правило в ділянці спини (допускається в ділянці шиї, стегна).
7.6.5. Пероральний.
Тест-дозу досліджуваного препарату вводять через рот тварини (per os). Для цього використовують шприц і спеціальну голку, з наплавленим оловом, або інше пристосування, яке забезпечить надходження розчину або суспензії препарату в шлунок натще. Птиці тест-дозу випоюють з водою. Мишам перорально вводиться препарат у дозі - 0,5-0,7 куб. см, морським свинкам - 1,0 куб. см, кролям - 3,0 куб. см. Щурам тест-дозу препарату згодовують з кормом, слідкуючи, щоб тварини повністю з'їли всю суміш (препарат з кормом). Випоювати і годувати тварин після ведення тест-дози можна не раніше, ніж через 3-4 години.
7.6.6. Зовнішній.
Препарат у визначених дозах і концентраціях наносять (втирають) на вистрижену або виголену ділянку шкіри.
У розчині препарату певної концентрації і об'єму проводять купання тварин з визначеною експозицією (час).
Нанесення препарату на слизові оболонки шляхом уведення в кон'юнктивальний мішок ока або іншим способом згідно з НД на препарат.
7.7. Спостерігають за дослідними тваринами протягом 48 годин, якщо немає інших вказівок у НД, фіксуючи усі зміни поведінки та клінічного стану тварин.
8. Визначення токсичності препаратів ветеринарних
8.1. Загальний принцип проведення досліджень такий. Вид, маса, вік і кількість досліджуваних тварин визначаються згідно з технічним завданням, планом розробки, нормативним документом, настановою по застосуванню препарату. Якщо відсутні конкретні вказівки у НД токсичність визначають на п'ятьох клінічно здорових білих мишах обох статей, масою 19-21 г кожна.
8.2. Перед проведенням досліджень дослідних тварин утримують на карантині протягом 6-14 діб на збалансованому раціоні.
24 години перед проведенням і під час досліду тварини утримуються у приміщенні з постійною температурою. Дві години перед зважуванням і відбором тварин не годують і не напувають.
Для визначення токсичності препаратів дослідних тварин використовують у досліді лише один раз. Не дозволяється проводити дослідження на тваринах, які використовувалися раніше для контролю інших показників.
8.3. Проведення досліджень.
8.3.1. Розчинник, концентрація розчину (тест-доза) і спосіб уведення повинні відповідати вимогам нормативної документації. Кожну серію препарату досліджують на 5 мишах. Розчин досліджуваного препарату підігрівають до 37 град. C і вводять у хвостову вену миші у дозі 0,5 мл зі швидкістю 0,1 мл/сек. Якщо нормативною документацією передбачений інший шлях введення препарату - внутрішньочеревне, підшкірне або у шлунок, доза може бути збільшена до 1 мл. За тваринами спостерігають протягом 48 годин, якщо не має інших вказівок у НД на досліджуваний препарат.
8.3.2. Препарат вважають нешкідливим, якщо протягом часу спостереження (48 год) після, введення препарату всі тварини залишилися живими та клінічно здоровими.
8.3.3. Якщо після введення досліджуваного препарату загинула одна миша, дослід повторюють на 5 мишах масою 20+0,5 г, якщо загинуло дві миші дослід повторюють на 15 тваринах. Вважається, що досліджуваний препарат пройшов випробування, якщо у повторному дослідженні не було загибелі мишей, і у сумі двох дослідів загибель тварин не перевищувала 10%. У всіх інших випадках препарат бракується.
8.3.4. У деяких випадках допускається місцева реакція після введення препарату (почервоніння, набряк, короткочасне підвищення температури тіла, розрідження калу тощо, а також загибель певної кількості тварин), що обумовлюється НД на препарат.
9. Визначення токсичності живих та інактивованих вакцин, анатоксинів
9.1. Для визначення токсичності біопрепаратів використовують лабораторних тварин (білі миші, морські свинки, кролі) та найбільш чутливих до досліджуваного препарату тварин.
9.2. Тест на лабораторних тваринах
Дослідження проводять на 5-10 мишах залежно від вимог НД. Досліджуваний препарат вводять білим мишам (вагою не більше 20 г) у дозі 0,3-0,5 куб. см внутрішньом'язово;
морським свинкам (вагою від 240-260 г) - 1-2 куб. см підшкірне або внутрішньочеревно.
Спостерігають за лабораторними тваринами 10-21 день згідно з вимогами НД. Якщо у результаті досліду гине хоча б одна тварина, тест повторюють на подвійній кількості лабораторних тварин (10-20).
Результати тесту вважаються позитивними, якщо серед вакцинованих тварин немає загибелі або клінічного прояву захворювання.
Якщо дослідження на токсичність проводяться на чутливих до препарату тваринах, тоді на лабораторних тваринах дослідження не проводять.
9.3. Тест на підсвинках.
Для дослідження використовують 3 підсвинків вагою 30-35 кг. Досліджуваний препарат уводять внутрішньом'язово в 2-кратній дозі. За тваринами спостерігають протягом 15 днів. Якщо після введення досліджуваного препарату у дослідних тварин спостерігається сильне пригнічення або загибель хоча б одного підсвинка, тоді проводиться повторне контрольне дослідження на подвійній кількості тварин (6). Результати тесту вважаються позитивними, якщо серед вакцинованих тварин немає загибелі або клінічних ознак захворювання.
9.4. Тест на курчатах.
Тест-доза для визначення токсичності живих вірус-вакцин становить 10 доз, а для інактивованих - 2 дози. Спостерігають за курчатами протягом 21 дня. Відзначають такі показники як загибель курчат, клінічні ознаки захворювання, місцева реакція в місцях введення препарату.
Результати тесту вважаються позитивними, якщо серед вакцинованої птиці немає загибелі або клінічних ознак захворювання.
Одночасно проводять дослідження на токсичність однократної дози вакцини за різних способів уведення згідно з настановою по застосуванню вакцини:
внутрішньом'язово, підшкірне (для інактивованих), перорально, аерозольне, на кон'юнктиву ока та клоакально (для живих вакцин).
9.5. Тест на норках, тхорозофредках.
Тест-доза для визначення токсичності інактивованих вакцин для м'ясоїдних становить подвійну дозу від рекомендованої в НД (2 дози). Для досліджень використовують 4 тварини віком 2-12 місяців. Досліджуваний препарат уводять внутрішньом'язово та спостерігають за тваринами протягом 21 дня. Результати тесту вважаються позитивними, якщо серед вакцинованих тварин немає загибелі або клінічних ознак захворювання.
9.6. Тест на собаках.
Тест-доза для визначення токсичності інактивованих вакцин для собак становить 5 доз від передбачуваної НД дози. Для досліджень використовують 4-х собак віком 2-4 місяці. Досліджуваний препарат уводять внутрішньом'язово або підшкірне та спостерігають за вакцинованими собаками 18-21 день.
Результати тесту вважаються позитивними, якщо серед вакцинованих собак немає загибелі або клінічних проявів захворювання.
10. Визначення токсичності препаратів ветеринарних, призначених для штучного осіменіння
10.1. Токсичність препарату для сперміїв визначають методами перевірки абсолютного виживання (в годинах) згідно з ГОСТ 20909.4-75.
Суть методу полягає у визначенні рухливості сперміїв за кожний послідовний інтервал часу в процесі зберігання сперми після її розбавлення. Виживання сперміїв у годинах визначають за часом, який пройшов від початку зберігання сперми до її загибелі (проміжок часу від моменту розбавлення сперми до моменту загибелі сперміїв).
10.2. Абсолютне виживання і час виживання сперміїв вираховують за допомогою відповідних формул.
10.3. Тест-дози досліджуваних препаратів та час спостереження визначаються згідно з НД на препарат.
11. Визначення токсичності кормових добавок. Експрес-метод
11.1. Дослідження проводять згідно з ДСТУ 3570 "Зерно фуражне, продукти його переробки, комбікорми. Методи визначення токсичності".
Метод грунтується на екстракції ацетоном або ефіром досліджуваної проби різних фракцій токсичних речовин і подальшій дії водних розчинів цих фракцій на інфузорії тетрахімена піріформіс.
11.2. Підготовка до проведення контролю.
11.2.1. Приготування поживного середовища.
Поживне середовище містить (г): глюкозу - 1,5; морську сіль - 0,1; дріжджовий екстрат - 0,1; дистильовану воду - до 100 куб.см.
Доводять pH поживного середовища до 7-7,1 розчином гідроокису натрію 0,1 або 0,01 куб. моль/дм. Приготовлене водно-сольово-дріжджове середовище (ВСДС) стерилізують 30 хв. на киплячій водяній бані.
11.2.2. Приготування лептонного середовища
До 100 куб. см дистильованої води додають: пептону - 2 г; глюкози - 0,5 г; дріжджового екстракту - 0,1 г; морської солі - 0,1 г. Доводять рН одержаного розчину до 7-7,5. Стерилізують 30 хв. в автоклаві під тиском 0,1 МПа.
11.2.3. Підготовка проби.
Середню пробу кормової добавки за необхідності подрібнюють і просівають крізь сито з отворами діаметром 1 мм.
Для екстрагування токсичних речовин наважку досліджуваної кормової добавки масою 50 г переносять у плоскодонну колбу зі шліфом, доливають 100 куб. см ацетону або ефіру і екстрагують на шутель-апараті протягом однієї години. Потім рідину обережно зливають через паперовий фільтр у колбу або чашку для випарювання. Повторно екстракцію проводять за допомогою 50 куб. см екстрагенту (ацетон або ефір) протягом 30 хв. Рідину зливають через паперовий фільтр і промивають його 10-20 куб. см екстрагенту. Екстракти об'єднують і випаровують на водяній бані. Після випаровування додають 2-3 куб. см ефіру для змиття масляного екстракту зі стінок чашки і промивають, 10 куб. см ВСДС. Перемішують і випаровують вміст до зникнення запаху розчинника, фільтрують у флакони, доводять pH до 7-7,5.
11.3. Проведення контролю.
У пеніцилінові флакони вносять по 1-2 куб. см одержаного екстракту, додають 0,1-0,2 куб. см 3-5 добової культури інфузорії тетрахімена піріформіс, вирощеної на лептонному середовищі за температури 25 град. C.
Вирощують інфузорії за температури 25 град. C. Проби струшують через рівні проміжки часу для аерації.
Через проміжки часу в 30 хв., 1; 3; 6 годин стерильною пастерівською піпеткою беруть краплю змішаного середовища і визначають під мікроскопом (об'єктив 10, окуляр 7) на предметному склі зовнішній вигляд, рухливість, ступінь росту, вакуолізацію інфузорій, підраховують кількість живих і розкладених (у результаті лізису) інфузорій. Одночасно спостерігають за ростом інфузорій в середовищі ВСДС (контроль), де всі інфузорії повинні бути живими.
11.4. Ступінь токсичності кормової добавки визначають за кількістю живих інфузорій.
Нетоксична - не спостерігається загибелі або морфологічних змін інфузорій протягом усього часу дослідження.
Слаботоксична - інфузорії гинуть через 1 годину. Спостерігається зміна форми інфузорій, вакуолізація, сповільнення рухів, атоксія і поступовий лізис.
Токсична - інфузорії гинуть через 30 хвилин.
Нетоксична кормова добавка у подальшому не досліджується і використовується за призначенням.
Слаботоксична і токсична кормові добавки скеровуються на додаткове випробування арбітражними методами, передбаченими НД.
12. Визначення стерильності
12.1. На стерильність досліджуються усі препарати призначені для парентерального введення (ін'єкційні препарати), а також інші препарати, якщо це передбачено у НД.
12.2. Стерильність хіміотерапевтичних препаратів визначають згідно з Державною фармакопеєю України, вид. I, с. 101 "Стерильність".
12.3. Стерильність біологічних препаратів визначають згідно з ГОСТ 28085.
13. Визначення анафілактогенності
13.1. Анафілактичну (алергізуючу) дію препарату визначають способом сенсибілізації морських свинок.
13.2. Для сенсибілізації морських свинок (200-250 г кожна) використовують різні схеми введення препарату. Якщо вакцинація передбачає декілька введень застосовують наступну схему: перше введення - підшкірне, два наступні (з інтервалом в 1 добу) - внутрішньом'язово. Якщо вакцинація передбачає одноразове введення препарату, дозволяється одноразова сенсибілізація. Дослідження проводять на 10 тваринах. Визначаюча ін'єкція означає внутрішньовенне або внутрішньосерцеве введення препарату через 2-3 тижні або через більший інтервал часу (залежно від властивостей препарату). Якщо препарат є сорбованим, для визначаючої ін'єкції використовують також і несорбований напівфабрикат. Сенсибілізуюча і визначаюча дози препарату, який досліджується, повинні бути близькими до рекомендованих доз для практичного застосування. Однак визначаюча доза не повинна бути меншою за сенсибілізуючу. Кінцеву дозу встановлюють експериментально.
13.3. Після введення визначаючої ін'єкції за дослідними тваринами спостерігають протягом 30 хвилин. Переважно анафілактичний шок настає через декілька хвилин після введення препарату. Його ступінь оцінюють за наведеною нижче шкалою:
А (+) - нечасте почісування лапками морди, скуйовдження шерстяного покриву, зниження температури тіла не більше (в межах), як на 1 град. C.
Б (++) - часте почісування лапками морди, можливе періодичне чхання, зниження температури тіла більше як на 1 град. C.
В (+++) - спазматичний синдром кашлю, можливе падіння на бік, неконтрольовані сечовиділення і дефекація.
Г (++++) - конвульсійні судоми, різке порушення дихання, загибель тварин у перші 5-7 хвилин.
Д - реакція відсутня.
13.4 Індекс синдрому в групі (I) обчислюють за формулою Вейгла (1960):
(А х 1) + (В х 2) + (В х З) + (Г х 4)
I= --------------------------------------
(А + Г)(А + Б)(В + Д)
де: А, В, Б, Г, Д - число тварин з вираженим синдромом; цифрова індексація (1,2,3,4) вводиться для обрахування ступеня важкості реакції в групі. Досліджувані препарати (за виключенням гетерологічних сироваток) не повинні викликати розвитку смертельного шоку.
13.5. Ознаки анафілаксії після внутрішньовенного або внутрішньосерцевого введення визначаючої дози дослідним тваринам препарату необхідно порівняти з результатами, отриманими в групі дослідних морських свинок, які були підготовлені до анафілактичного шоку (сенсибілізовані) нормальною гетерологічною сироваткою (позитивний контроль).
Загибель тварин (100%) у цій групі наступає в результаті попереднього підшкірного введення 0,1 куб. см конячої сироватки, за 2-3 тижні до визначаючої дози (0,1-0,5 куб. см). Якщо сироватка ліофілізована, для сенсибілізації використовують 2,5-3,0 мг на 100 г маси тіла тварини (десенсибілізуюча доза 14-16 мг на 100 г маси). У випадках, коли для виробництва препарату використовують гетерологічний білок, його застосовують для постановки позитивного контролю.
Одночасно десенсибілізуючу дозу досліджуваного препарату вводять тваринам, яким замість сенсибілізуючих ін'єкцій препарату було введено відповідний об'єм розчину натрію хлориду 9 г/л (негативний контроль).
14. Визначення пірогенності
14.1. На пірогенність досліджуються всі препарати, які вводяться в організм парентеральне (внутрішньовенне, внутрішньом'язово, підшкірно та внутрішньочеревне).
Перед проведенням дослідження рекомендується визначити максимальну дозу препарату, яка не викликає пірогенного ефекту.
Для дослідження препаратів, уведення яких потребує попередньої підготовки або спеціальних умов уведення, ці умови повинні бути обумовлені в НД.
14.2. Дослідження проводять на здорових кролях обох статей. Тварини повинні бути клінічно здоровими, масою 2-3,5 кг і утримуватися на повноцінному раціоні. Тварини-альбіноси не можуть бути використані в дослідженнях.
Протягом тижня (7 днів) перед дослідом не допускається втрата маси тіла дослідних тварин. Упродовж 3 днів перед дослідом тваринам вимірюють температуру тіла.
14.3. Розчини досліджуваних препаратів підігрівають до +37 град. C і вводять тваринам в дозах, передбачених НД.
14.4. Для випробування на пірогенність води для ін'єкцій з неї попередньо готують розчин натрію хлориду 9 г/л. Натрій хлорид повинен бути стерильним та непірогенним. Доза розчину становить 10 мл на 1 кг маси кроля. Досліджуваний розчин перевіряють на 3 кролях. Групу дослідних тварин складають тварини однакової маси (різниця не більше 0,5 кг). Перед уведенням препарату дослідним тваринам двічі вимірюють температуру тіла з інтервалом у 30 хв. Різниця показів температури не повинна бути більшою 0,2 град. C. Результат останнього вимірювання приймають за вихідну температуру. Досліджуваний розчин уводять через 15-30 хвилин після останнього вимірювання температури.
Після внутрішньовенного введення досліджуваного препарату температуру тіла вимірюють 3 рази з інтервалом у 1 годину. Після інших введень (внутрішньом'язове, підшкірне, внутрішньочеревне) - 5 разів з інтервалом у 1 годину.
14.5. Вода для ін'єкцій або розчин препарату вважаються непірогенними, якщо сума підвищень температури тіла у 3 піддослідних кролів менша або дорівнює 1,4 град. C. Якщо сума перевищує 2,2 град. C, то ці досліджувані розчини вважаються пірогенними. У випадках, коли сума підвищень температури тіла у 3 піддослідних кролів знаходиться в межах 1,5-2,2 град. C, дослідження повторюють додатково на 5 кролях. Результат досліду в таких випадках оцінюють за сумою підвищень температури тіла у 8 (3+5) кролів. Якщо сума підвищень не перевищує 3,7 град. C, препарат вважається непірогенним. Якщо ж ця сума дорівнює 3,8 град. C або більша, препарат вважають пірогенним.
Якщо в НД не обумовлено випадків зниження температури тіла у кролів внаслідок введення досліджуваного препарату, то таке зниження приймають за нуль. Кролі, які використовувалися в досліді, можуть бути використані для визначення пірогенності повторно, але не раніше ніж через 3 доби за умови непірогенності попереднього препарату. Якщо попередній препарат за результатами досліджень був пірогенним, піддослідні кролі можуть використовуватися для подальших досліджень лише через 2 тижні.
15. Визначення місцевоподразнюючої дії
15.1. Досліджуваний препарат уводять у дозі (концентрації) і способом, передбаченими настановою або НД.
15.2. Якщо досліджуваний препарат уводиться в організм внутрішньошкірно, підшкірне або внутрішньом'язово, місця введення оцінюють після одноразового введення. В інших випадках (внутрішньовенне, пероральне, інгаляційне введення, введення в кон'юнктивальний мішок) - оцінку проводять після проведення певної кількості введень, передбачених настановою до застосування або НД. Кількість дослідних тварин, дози і способи введень визначають відповідно до НД.
15.3. Оцінюють препарат на місцевоподразнюючу дію за результатами спостережень, які проводять під час уведення препарату і протягом наступних 7 діб.
Місцевоподразнююча дія препарату характеризується появою на місці введення гіперемії або потовщення шкірної складки. На початкових стадіях розвитку дерматиту рекомендується визначати pH, температуру шкіри. Ознаки поверхневого дерматиту без утворення кірочок і тріщин свідчать про слабку місцеву дію. Виражена місцевоподразнююча дія препарату характеризується утворенням кірочок та такими реакціями на місці введення як набряк, еритема, тріщини, випадіння шерсті, зміна пігментації тощо. Сильна місцевоподразнююча дія характеризується різким набряком та гіперемією, утворенням геморагічних кірок.
Якщо досліджуваний препарат вводиться в кон'юнктивальний мішок місцевоподразнюючу дію визначають за такими показниками як гіперемія, набряк судин, склери та рогівки, збільшення зіниці.
Дію препарату на слизові оболонки оцінюють за характером розвитку кон'юнктивіту, кератиту.
16. Визначення речовин гістаміноподібної дії
16.1. Вміст речовин гістаміноподібної дії визначають у препаратах, які призначені для парентерального введення і якщо це передбачено нормативними документами.
16.2. Дослідження проводять на котах обох статей масою не менше 2 кг. Дослідні тварини під час досліду повинні перебувати у стані наркозу. Рекомендується використовувати такі наркотичні засоби як уретан, етаміналнатрію, гексанал. Уретан уводять внутрішньочеревне з розрахунку 1-1,2 г на 1 кг маси тварини розчиненого в 3-5 мл дистильованої води. У випадку недостатньої глибини наркозу уретан вводять додатково внутрішньовенне з розрахунку 1 г на тварину (розчинений в 3 мл води) або 2% розчин етаміпал-натрію у дозі 0,2 мл/кг. Швидкість введення вказаних речовин 0,1 мл за секунду. Гексенал уводять у дозі 350-400 мг/кг в 2-3 мл води підшкірне або внутрішньом'язово.
Наявність речовин гістаміноподібної дії у досліджуваному препараті оцінюють за показниками артеріального тиску. Для реєстрації артеріального тиску у відпрепаровану сонну артерію вставляють канюлю заповнену розчином препарату, який попереджує згортання крові (насичений розчин натрію гідрокарбонату, 25% розчин магнію сульфату, розчин гепарину, який містить 50 ОД в 1 мл та ін.) та з'єднують її з ртутним манометром. Показники артеріального тиску записують на стрічці кімографа.
Досліджувані розчини вводяться в організм лише внутрішньовенне.
Перед дослідом необхідно перевірити дослідних тварин на чутливість до гістаміну. Для цього готують основний розчин гістаміну, який містить 1 мг основи в 1 мл води, 138,1 мг (точна наважка) гістаміну фосфату або 82,8 мг (точна наважка) гістаміну дигідрохлориду розчиняють в 50 мл дистильованої води.
Основний розчин гістаміну можна зберігати не більше 1 місяця в темній склянці з притертим корком у захищеному від сонячних променів місці за температури 4-10 град. C.
Як основний розчин гістаміну можна застосовувати 0,1% розчин гістаміну дигідрохлориду в ампулах, в 1 мл якого міститься 0,6038 мг гістаміну-основи. З основного розчину гістаміну безпосередньо перед дослідом готують стандартні розчини, які містять 0,5 і 1 мкг. мл гістаміну-основи, методом послідовних розведень у воді або у розчині натрію хлориду 9 г/л для ін'єкцій залежно від розчинника або препарату, який досліджується.
16.3. Для перевірки тварин на чутливість до гістаміну у вену послідовно вводять указані стандартні розчини гістаміну з інтервалами у 5 хв. у дозах 0,1 і 0,2 мкг гістаміну-основи (0,2 мл розчину) на 1 кг маси. Швидкість введення розчину 0,1 мл за секунду. Тварини, в яких доза гістаміну 0,2 мкг на 1 кг маси знижує показники артеріального тиску на 20 мм рт. ст., до досліду непридатні.
Після перевірки тварин на чутливость до гістаміну, визначають величину гіпотензивної реакції методом повторного введення стандартного розчину гістаміну в дозі 0,1 мкг (0,2 мл розчину) на 1 кг маси зі швидкістю 0,1 мл за секунду. Гістамін вводять з інтервалом у 5 хв. стільки разів, доки після двох послідовних введень не буде зареєстровано однакове зниження артеріального тиску, яке приймається за стандартне в цих умовах досліду.
Далі з інтервалом у 5 хв. тварині вводять розчин досліджуваного препарату з тією ж швидкістю, з якою вводили розчин гістаміну
Розчинник та концентрація розчину (тест-доза) препарату, який випробовується, повинні бути узгоджені з вимогами нормативних документа на препарат.
16.4. Препарат вважають таким, що пройшов випробування, якщо зниження артеріального тиску після введення тест-дози не перевищує реакції на введення 0,1 мкг/кг гістаміну в стандартному розчині.
Для дослідження в одному досліді різних препаратів необхідно проводити додаткове визначення реакції тварини на введення стандартного розчину гістаміну в дозі 0,1 мкг/кг. Визначена у цьому дослідженні величина реакції приймається як стандартна у подальшому дослідженні препарату.
У випадку значного зменшення величини реакції порівняно з тією, що спостерігалася на початку досліду, необхідно повторно перевірити чутливість тварини до дії гістаміну у дозі 0,2 мкг.кг. Якщо зниження артеріального тиску у цьому випадку буде у межах 20 мм.рт.ст., дослідження препаратів продовжують відповідно до вказаних вимог.
| Голова Технічного комітету Держстандарту України "Засоби захисту тварин, корми і кормові добавки" Косенко М.В. Відповідальний секретар Технічного комітету | Музика В.П. |
ГСТУ 46.024-2002
Додаток А
Бібліографічні дані А
1. Біологічні випробування. Стерильність. Державна Фармакопея України, Харків, 2001, вид. I, с. 101
2. Біологічні випробування. Пірогени Державна Фармакопея України, Харків, 2001, вид. I, с. 107
3. Біологічні випробування. Аномальна токсичність Державна Фармакопея України, Харків, 2001, вид. I, с. 109
4. Біологічні випробування. Депресорні речовини Державна Фармакопея України, Харків, 2001, вид. I, с. 110
СТУ 46.024-2002
УДК 658.562:615.9:619
Група Р-31
КНД 11.220
ДКПП
Ключові слова: ветеринарний препарат, нормативний документ, нешкідливість, токсичність, пірогени, стерильність.
