Методичні вказівки щодо гігієнічного контролю забруднення морської середи

Подсчитывают количество выпуклых блестящих колоний, которые образовали характерный пигмент (золотистый, палевый, лимонно-желтый, оранжевый, реже белый) и радужную зону вокруг.

При необходимости подтвердить наличие стафилококков, обладающих лецитовителлазной активностью, подозрительные колонии пересевают "пятнами" на чашки, разделенные на квадраты, со средой того же состава, отмечают пигментообразование, радужную зону разложения желтка и зону помутнения среды, а также характерную для стафилококков форму клеток при микроскопировании.

При отсутствии мембранных фильтров можно определить стафилококки титрационным методом, используя в качестве среды накопления солевой бульон. Схема посева должна соответствовать таблице на стр. 17, по которой определяют индекс бактерий. Высев из сред накопления делают на МЖСА с полимиксином, отмечая наличие лецитовителлазоактивных стафилококков.

Приготовление молочно-желточно-солевого агара (МЖСА)

Сухого питательного агара Дагестанского НИИПС - 45 г

Натрия хлористого - 90 г

Дистиллированной воды - до 1000 мл

Расплавляют при нагревании, разливают в сосуды и стерилизуют при 120 град. +- 2 град. C (1,1 кгс/ кв. см) 20 мин.

Перед употреблением в расплавленный и охлажденный до 50 - 55 град. C солевой агар добавляют: стерильное обезжиренное молоко - 60 мл, одни яичный желток, тщательно смешанный с помощью стеклянных бус с 50 мл физиологического раствора, полимиксин М (раствор хранить не более 14 дней) - 300000 ед. Тщательно смешивают и разливают в чашки Петри толстым слоем по 20 - 25 мл для выращивания бактерий на мембранных фильтрах и тонким слоем по 15 мл для подтверждающего этапа.

4.2.6. Выделение патогенных энтеробактерий

Вследствие незначительной концентрации патогенных энтеробактерий в морской воде непосредственный посев воды на плотные питательные среды не даст зачастую возможности выделить эти микроорганизмы из воды. Более надежные результаты можно получить после предварительного концентрирования этих бактерий из воды или накопления в средах обогащения.

Рецептура среды обогащения с охмеленным суслом и способ ее применения

Наиболее результативной для выделения патогенных энтеробактерий из морской воды является среда накопления с охмеленным руслом. Основной питательный субстрат среды - охмеленное сусло - является полуфабрикатом производства пива и может быть приобретен на пивоваренном заводе. Охмеленное сусло отбирают в стерильную посуду; его можно сохранять в холодильнике (+4 град. C) в течение 3 - 4 недель.

Приготовление среды производят ex temporae: к 100 мл охмеленного сусла в плоскодонной колбе добавляют 5 г пептона, подогревают на небольшом огне при перемешивании, доводят до кипения и кипятят в течение 10 минут.

В остуженную среду доливают 400 мл исследуемой морской воды, устанавливают pH 7,3 - 7,5 (для подщелачивания может быть добавлено несколько капель 20% раствора NaOH). Затем добавляют 7 - 9 мл 0,1% раствор (водный) бриллиантового зеленого: при небольшом микробном загрязнении исследуемой воды - 7 мл, при большом - 9 мл. После тщательного перемешивания посев ставят в термостат для подращивання в течение 20 - 24 часов при температуре 37 град. C.

Через сутки инкубации в термостате производят высев на плотные питательные среды, для подращивания сальмонелл используют висмут-сульфитный агар, для подращивания шигелл - агар с эозин-метиленовым синим (ЭМС-агар) или среду Плоскирева.

На висмут-сульфитной среде сальмонеллы образуют черные и зеленые колонии с темным центром, иногда и без центра, под колонией на питательной среде образуется почернение. Шигеллы на ЭМС-агаре и среде Плоскирева образуют мелкие прозрачные круглые нежные колонии.

С каждой чашки снимают для дальнейшего изучения по 4 - 5 колоний, "подозрительных" на сальмонеллы и шигеллы, и засевают на дифференциальные среды Росселя, Олькиницкого и т. п.).

Дальнейшие исследования проводятся по общепринятой методике. Через сутки инкубации при 37 град. C с дифференциальных сред отбирают культуры, имеющие типичные ферментативные реакции в отношении используемых в средах углеводов, а также те культуры, которые имеют некоторые отклонения от типичных свойств, но характеризуются нежным ростом на поверхности скошенного агара. Затем культуру проверяют на фаголизабельность при помощи О-сальмонеллезного и дизентерийного фагов. При наличии фаголизабельности у выделенных культур проводят серологическое определение культур, устанавливают их родовую и типовую принадлежность.

Для определения сальмонелл в сточной воде помимо охмеленного сусла можно использовать магниевую среду накопления (по Калине).

Готовят 3 раствора:

1. Пептона отечественного производства - 4,2 г

Хлористого натрия - 7 г

Калия фосфорнокислого однозамещенного - 1,5 г

Дрожжевого экстракта - 20 мл

Воды дистиллированной - 890 мл

2. Хлористого магния кристаллического - 36 г

Воды дистиллированной - 90 мл

3. 0,1% водного раствора бриллиантового - 5 мл зеленого

Растворы смешивают, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. При посевах исследуемого материала в количестве более 100 мл концентрацию всех ингредиентов, кроме дистиллированной воды, удваивают. 100 мл сточной воды засевают в равное количество среды накопления удвоенной концентрации, 10 мл сточной воды - в 100 мл среды обычной концентрации, 1 мл сточной воды - в 10 мл среде обычной концентрации.

Навески химических реактивов и растворы ингредиентов можно вносить непосредственно в исследуемую воду и растворять их при встряхивании. На 100 мл сточной воды необходимо добавить 3,9 г хлористого магния кристаллического, 0,8 г хлористого натрия, 0,16 г калия фосфорнокислого однозамещенного безводного, 5 мл 10% раствора пептона, 2,2 мл дрожжевого экстракта и 0,5 мл 0,1% раствора бриллиантового зеленого.

После 24-часовой инкубации в термостате при 37 град. C делают высев на 2 - 3 чашки с висмут-сульфитным агаром. Чашки с посевом инкубируют при 37 град. C 18 - 20 часов.

Подозрительные колонии на сальмонеллы необходимо исследовать общепринятыми методами.

4.2.7. Выделение вирусов с помощью тампонного метода Моора

Стерильные тампоны погружают на глубину 3 - 5 м в воду в точках отбора проб. Сбор тампонов и последующую транспортировку производят в стерильных банках емкостью 0,5 л и до последующей обработки хранят в замороженном состоянии при температуре минус 15 - 20 град. C.

Затем пробы (тампоны) размораживают. В сосуд, где находится тампон, вносят от 10 до 20 мл 0,5 M фосфатного буфера. Тампон тщательно разминают в течение 5 минут и отжимают. Выход каждой пробы составляет 60 - 100 мл. pH жидкости устанавливается 8 - 8,2 путем добавления 1 M NaOH. Затем жидкая фаза отсасывается в центрифужные пробирки и центрифугируется при 2500 об/мин., в течение 20 минут. Надосадочная жидкость отсасывается в стерильные пробирки с резиновыми пробками и замораживается на 1 - 2 суток, после чего пробы снова оттаивают и центрифугируют в том же режиме и добавляют равное количество эфира. Флаконы встряхивают для получения гомогенной эмульсии и, закрытые ватно-марлевыми пробками, помещают в холодильник с температурой 4 - 6 град. C. Через 2 - 3 дня (после испарения эфира) флаконы закрывают резиновыми пробками и хранят в замороженном состоянии до вирусологического исследования на культуре ткани.

4.2.8. Выделение вирусов на ионнообменной колонке

Для концентрирования вирусов используют сильноосновной анионит отечественного производства AB-17, выпускаемый в гидроксильной и Cl-формах. Для адсорбции вирусов могут быть использованы обе формы.

Перед употреблением сухую ионообменную смолу для набухания замачивают в бидистиллированной воде не менее чем на 24 часа. После этого смолу переводят в Cl-форму путем обработки ее в течение 3 - 4 дней соляной кислотой из расчета не менее 1 л раствора кислоты на 100 мл набухшей смолы (1 N раствора - для гидроксильной и 0,5 N раствора для Cl-формы). Затем смолу промывают стерильной бидистиллированной водой до тех пор, пока рН воды не станет нейтральной или равной pH исходной воды. Обработанную смолу вместе с бидистиллированной водой заливают в бюретку на 25 - 50 мл, на дно которой помещают кусочек стеклянной ваты. Высота столбика смолы - 8 - 10 см. До использования смолу необходимо держать под водой.

При исследовании в бутыль с тубусом или сифоном наливают исследуемую воду в объеме 1 - 3 л, pH воды доводят до 5,5. Бутыль ставят выше колонки и вода самотеком стекает по сифону и присоединенной к нему резиновой трубке (тщательно прокипяченной в дистиллированной воде), в колонку с анионитом. Зажимом, надетым на трубку, регулируют подачу воды, в колонку с таким расчетом, чтобы столбик смолы был постоянно под водой, но вода не перетекала через край бюретки. Загрязненную мутную морскую воду, а также сточную воду целесообразно предварительно профильтровать через несколько слоев марли или стекловату.

Последующая обработка проб производится так же, как и при использовании метода Моора. Вирусологическое исследование обработанных проб производится по методикам, принятым в вирусологической практике. Для более полного выделения энтеровирусов из проб природных вод анализ производят параллельно на двух видах культуры ткани: первичной и перевиваемой.

В качестве первично-трипсинизированной культуры ткани используются клетки почек обезьян макака-резус, чувствительные к группе вирусов полиомиелита, Коксаки В, некоторым типам вирусов Коксаки A и ECHO вирусам, а также к группе аденовирусов.

В качестве перевиваемой культуры используют клетки Hela (опухолевые клетки человеческого происхождения), чувствительные к некоторым типам вирусов Коксаки A, ECHO вирусам, аденовирусам.

Заражение производят на выращенном монослое. Для этого после удаления питательной среды на монослой клеток наносят 0,5 - 1 мл исследуемой воды и флаконы (объемом 50 - 60 мл) помещают в термостат при температуре 37 град. C. После 30-минутного контакта вирусосодержащего материала с клетками пробу сливают и во флаконы доливают 10 мл поддерживающей среды.

Зараженные культуры клеток инкубируют в термостате от 7 до 9 дней для выделения энтеровирусов и 17 - 20 дней - для выделения аденовирусов.

При отсутствии цитопатического действия на культуру ткани проводят два слепых пассажа по общепринятой методике - при заражении не менее 2 флаконов.

4.2.9. Выделение и титрование бактериофагов

Для выделения и титрования бактериофагов применяется метод агаровых слоев по Грация: 1,5% мясопептонный агар разливают на чашки Петри в количестве 25 - 30 мл. Чашки высушивают под бактерицидными лампами. В пробирки разливают 0,7% мясопептонный агар в количестве 2,5 мл и остужают до 47 град. C. Затем 1 мл исследуемой пробы в соответствующем разведении и 0,1 мл взвеси суточной культуры Е. coli помещают в пробирку с 0,7% агаром, быстро перемешивают и выливают на поверхность 1,5% агара. После застывания 0,7% агара чашки Петри (в перевернутом виде) помещают в термостат при 37 град. C для инкубирования. Подсчет колоний фага производят на следующий день.

4.3. Оценка влияния химических веществ на органолептические свойства морских вод

Оценка влияния химических веществ на органолептические свойства морских вод имеет целью определение необходимости корректировки ПДК вредных веществ, установленных для пресных водоемов по органолептическому признаку вредности и производится на основе установления, по методике "закрытого опыта", дифференцированного для прибрежных вод различных морей, практического (интенсивностью не более двух баллов) порога восприятия необычного (постороннего) для этих вод запаха.

Примечание:

Корректировке подлежат также ПДК тех вредных веществ, при нормировании которых в воде определяющим является провоцирование посторонних запахов.

Последовательность проведения опытов по определению практического порога восприятия запаха наиболее распространенных химических загрязнителей в прибрежном охраняемом районе моря следующая:

а) Для ориентировочного представления о пороговых величинах предварительно проводится опыт оценки интенсивности необычного для морской воды запаха путем анализа (по пятибальной шкале) последовательных двукратных разведений наиболее высокой концентрации исследуемого вещества в морской воде в районе водопользования.

б) Затем в интервале пороговых концентраций изучаемого вещества, соответствующих оценке 1 - 2 балла, выбираются 4 - 5 концентраций, отличающихся в 3, а затем в 1,5 раза, и каждая из этих концентраций (опытная проба) группируется с 4 контрольными пробами.

Одораторам предлагается найти опытную пробу в каждом комплексе проб. Предварительно одораторы должны быть ознакомлены с характером запаха вещества. При этом интенсивность органолептических свойств (запаха) демонстрационной пробы не должна быть более 2 - 3 баллов. Необходимо также проверить, не обладает ли исследуемое вещество феноменом последействия, маскировки или привыкания.

Последовательность поиска опытной пробы проводится от большей концентрации вещества к меньшей. В таблице регистрируются результаты опроса (знаками плюс и минус или как-либо иначе).

Общее число наблюдений по каждой концентрации должно быть не менее 30 - 50, результаты первого опыта не учитываются. Далее подсчитывается процент одораторов, правильно указавших опытную пробу из всего числа лиц, принимавших участие в опыте.

Если процент правильных ответов на испытанные концентрации вещества выражается величинами как больше, так и меньше 50%, то опыт закончен. В противном случае необходимо продолжить работу.

Примечание:

При получении для испытанной концентрации примерно 20% правильных ответов нецелесообразно изучать более низкие концентрации вещества.

в) Анализ полученных данных проводится методом пробит-анализа.

Процент правильных ответов (или их пробиты) от каждой испытанной концентрации наносится на график в двойном логарифмическом масштабе и результаты обрабатываются любым приемлемым методом пробит-анализа с вычислением величины среднеэффективной концентрации (EC ) и ее ошибки.

Для получения особо точных результатов и исключения ошибки, связанной с вероятностью случайных правильных ответов, можно из процента правильных ответов вычислить соответственно процент ошибочных ответов, приходящихся в среднем на одну контрольную пробу.

Безупречную точность обеспечивает стандартизация данных по формуле Шнейдер-Орелли:

где Хст. - стандартизированный процент правильных ответов,

Хпр. - экспериментально полученный процент правильных ответов,

Хош. - процент ошибочных ответов, приходящихся в данной групировке проб на одну контрольную пробу.

В известной мере оправданным может быть получение практического порога вещества по влиянию на запах воды в результате простого умножения величины EC на коэффициент 1,5.