МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР
ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Заместитель Главного
санитарного врача МЗ СССР
В.Е.Ковшило
20.10.1976 N 1514-76
Методические рекомендации об определении свободного формальдегида в биосредах методом тонкослойной хроматографии
ВВЕДЕНИЕ
Формальдегид H*COH, молекулярный вес 30,03. Бесцветный газ с резким запахом. Порог восприятия запаха 0,2 мг/куб.м. Температура плавления 92 град.С, температура кипения - 21 град.С. Хорошо растворим в воде; 35-40% водный раствор формальдегида называется формалином. Он легко полимеризуется с образованием параформальдегида, легко конденсируется с аммиаком, аминами и фенолами. Формальдегид находит большое применение при производстве полимерных материалов на основе мочевино-формальдегидной, феноло-формальдегидной и др. смол.
Для определения формальдегида в биосредах в литературе описан метод, основанный на способности формальдегида восстанавливать окраску бесцветного раствора фуксинсернистой кислоты [1]. Однако он оказался недостаточно чувствительным при определении H*COH в органах подопытных животных, подвергавшихся длительной затравке формальдегидом на уровнях, соответствующих его выделению из полимерных материалов. По этой же причине оказался неудовлетворительным метод, описанный в работе [2].
Настоящий метод предназначен для определения формальдегида в печени, почках, легких, мозге подопытных животных. Извлечение формальдегида из органов животных делалось так, как описано в работе [1], синтез формдимедона по прописи, представленной в руководстве [3], условия хроматографирования и количественного определения формдимедона разработаны авторами.
Принцип метода
1. Метод основан на извлечении формальдегида из органов, его взаимодействии с димедоном (5,5-диметилдигидрорезорцином) с последующим выделением продукта взаимодействия (формдимедона) в тонком слое сорбента. В качестве алюента применяется хлороформ. Проявление пластины осуществляется хлороформенным раствором йода.
2. Открываемый минимум - 0,2 мкг в пробе.
3. Веществ, мешающих определению, не установлено.
Реактивы, растворы
1. Соляная кислота (d=1,19), "хч", ГОСТ 3118-67; Ін; 0,1н р-ры.
2. Димедон, "ч", ГОСТ 6622-53, перекристаллизованный; 5% спиртовый р-р, свежеприготовленный.
3. Гидроокись натрия, "хч", ГОСТ 4328-66; 0,1н; 0,05н и 20% р-ры.
4. Спирт этиловый, ректификат, ГОСТ 5962-67; перегнанный.
5. Вода, бидистиллат.
6. Бромфеноловый синий, "чда", ГОСТ ТУ 6-03-311-70.
7. Ацетат натрия, "ч", ТУ 6-09-246-70.
8. Нитрат серебра, "хч", ГОСТ 1277-63; 0,1н р-р.
9. Хлороформ, "хч", ГОСТ 3160-51.
10. Трихлоруксусная кислота, "ч", МРТУ 6-09-2299-65; 5% р-р.
11. Йод, "чда", ГОСТ 4159-64.
12. Крахмал растворимый, для йодометрии, ГОСТ 10163-62.
13. Формалин медицинский, ГФ-10.
14. Буферный р-р: смешивают 2 объема Iн р-ра ацетата натрия с 1 объемом Iн р-ра HCl, pH=4,0.
15. Бромфеноловый синий: 0,1 г индикатора растворяют в 3 мл 0,05н p-pa NaOH в мерной колбе емкостью 250 мл, добавляют горячей бидистиллированной воды, остывший р-р взбалтывают в мерной колбе, затем доводят до метки водой и хорошо перемешивают.
16. Проявляющий р-р: 0,5% р-р йода в хлороформе и 1% р-р крахмала.
17. Синтез формдимедона: в стакан вносят 5 мл 4% р-ра
формальдегида, прибавляют 0,5 мл 5% спиртового р-ра димедона,
подкисляют несколькими каплями 0,1н р-ра HCl в присутствии
бромфенолового синего. Затем прибавляют несколько капель 0,1н р-ра
NaOH до изменения окраски в красно-фиолетовую и 5 мл буферного
р-ра. Содержимое стакана оставляют стоять на 12 часов, после чего
фильтруют через стеклянный фильтр с пористой пластинкой N 4.
Осадок промывают бидистиллированной водой до отрицательной реакции
на ион хлора (проба с р-ром AgNO ) и сушат до постоянной массы в
3
течение 4,5 часов при температуре 100 град.С.
18. Стандартный р-р формдимедона концентрацией 50 мкг/мл готовится обычным способом.
Приборы и посуда
1. Центрифуга.
2. Форвакуумный или водоструйный насос.
3. Стеклянная ловушка.
4. Стеклянные пластинки размером 9х12 см.
5. Поглотитель Полежаева на шлифе с оттянутым концом.
3. Мерные колбы для приготовления стандартного р-ра, микропипетки.
7. Батарейные стаканы.
8. Пульверизатор.
9. Реактивные склянки.
10. Фарфоровые чашки.
Приготовление пластин для хроматографии
Тщательно вымытые хромовой смесью пластины промывают водой, затем дистиллированной водой, сушат в сушильном шкафу, а потом на них наносят слой сорбента. Для приготовления сорбционной массы использовался силикагель марки КСК и медицинский гипс, которые предварительно просеивались через сито с отверстиями с частотой ячеек 100 меш. Адсорбционная масса готовилась следующим образом:
14 г силикагеля + 1 г гипса + 50 мл дистиллированной воды смешивают и интенсивно встряхивают в плоскодонной колбе в течение 20 минут. Однородную массу наносят на 10 пластинок и встряхиванием добиваются равномерного распределения слоя на поверхности каждой пластины.
Стеклянные пластинки после нанесения слоя сорбента сушат на воздухе в течение суток. В дальнейшем пластинки хранят в эксикаторе.
Описание определения
0,5 г органа подопытного животного (печени, почек, легких, мозга) тщательно растирают в ступке, желательно с кварцевым песком. Затем прибавляют 3 мл 5% трихлоруксусной кислоты, перемешивают и переносят в пробирку. Чашку дважды ополаскивают 2 мл бидистиллированной воды и смывы также переносят в пробирку. Содержимое пробирки центрифугируют, жидкость над осадком осторожно сливают в пробирку с притертой пробкой и к фильтрату по каплям прибавляют 20% раствор NaOH до нейтральной реакции (проба с лакмусовой бумажкой). Далее прибавляют 0,2 мл раствора димедона и проводят синтез формдимедона так, как описано выше.
После того как проба была выдержана 12 часов при комнатной температуре, ее переносят в испаритель и упаривают под вакуумом досуха. В качестве испарителя можно использовать поглотитель Полежаева. Чтобы ускорить процесс упаривания, целесообразно между насосом и испарителем поместить ловушку со льдом. Остаток растворяют в 0,1 мл этилового спирта.
В период обработки органа, проведения синтеза формдимедона,
упаривания растворов возможно попадание формальдегида в пробу из
воздуха. Поэтому для контроля в той же постановке опыта проводят
анализ соответствующего органа животного, которое не подвергалось
затравке. Результаты анализа учитываются при окончательном
расчете. Проба и контроль наносятся на середину пластинки на
расстоянии 1 см от нижнего края. Во избежание потерь стенки
испарителей аккуратно споласкивают спиртом и смывы переносят в те
же точки, куда были нанесены проба и контроль. Слева и справа
наносят пятна стандартного раствора формдимедона в количестве 0,2;
0,4; 0,6 мкг, что соответствует 0,004; 0,008; 0,012 мл
стандартного раствора. Для ускорения процесса высыхания пятен на
пластине ее подогревают феном. Разделение вещества производят в
камере с насыщением, представляющей собой сосуд любой формы с
притертой крышкой, на дно которого наливают смесь хлороформа с
ацетоном (ацетон добавляется в количестве 1/10 от объема
хлороформа). После подъема растворителя на высоту 10 см пластинку
вынимают, сушат на воздухе и опрыскивают хлороформенным раствором
йода. На пластинке появляются желтые пятна. После подсушивания
пластинки и обработки ее раствором крахмала пятна приобретают
синий цвет. Непрореагированный димедон дает пятно около старта;
формдимедон - с R = 0,4-0,5.
f
Расчеты
Количество вещества в пробе определяется путем сравнения площади пятна пробы с площадью пятен стандартных растворов. Количество определяемого формальдегида в пробе (в том или ином органе) рассчитывается в мкг/г по формуле:
C1 - C2
g = ------- мкг/г, где
0,5
C1 - количество формальдегида в органе подопытного животного, мкг;
C2 - количество формальдегида в органе контрольного животного, мкг;
0,5 - навеска взятого для анализа органа, г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Перегуд Е.А. Санитарная химия полимеров, Изд-во "Химия", Л., 1967, стр. 60.
2. Розенберг П.Я., Беялко Н.К. Химические методы исследования биологических субстратов в профпатологии. М., Изд-во "Медицина", 1969, стр. 171-173.
3. Nash T., The colorimetric estamation of formaldehyde by means of the Hantrsch Reaction, Biochem. J. 1953.55.3.416.