1. Нікотинамід.
2. Піразинамід.
3. Сечовина.
4. Реактив Несслера.
5. Агарове середовище: пептон, натрій хлористий, глюкоза, калій фосфорнокислий однозаміщений (KH2PO4), гліцерин.
Хід дослідження. Приготування агарового середовища: 1,0 г пептону, 20,0 г агар-агару або агару Діфко, 5,0 г NaCl, 0,1 г глюкози, 2,0 г KH2PO4, 10,0 мл гліцерину розчиняють у дистильованій воді при нагріванні, доводячи кінцевий об'єм до 1,0 літра, рН - 6,9. Гаряче середовище розливають по пробірках і автоклавують при 120 град. Цельсію 30 хвилин. Після стерилізації агар у пробірках скошують. Готують розчини амідів у дистильованій воді: сечовина - 40,0 мг/мл, нікотинамід - 30,0 мг/мл, піразинамід - 20,0 мг/мл.
Розчини нікотинаміду і піразинаміду стерилізують у водяній бані при 100 град. Цельсію протягом 30 хвилин. Розчин сечовини фільтрують через бактеріальний фільтр (Зейця). Стерильний розчин амідів вносять по 0,25 мл у пробірки з живильним середовищем і лишають останні в горизонтальному становищі 2-3 доби, так, щоб розчин всмоктався в поверхню живильного середовища. (За підрахунками, кількість сечовини, нікотинаміду і піразинаміду на 1,0 кв. см поверхні середовища складає відповідно - 1000, 750 і 500 мкг/кв. см).
У пробірки з амідами засівають 0,2 мл густої зависі культури випробовуваних мікобактерій (1,0 мг/мл). Посіви інкубують при 37 град. Цельсію. Як тільки з'явиться ріст (через 2-3 тижні) додають 0,5 мл реактиву Несслера. Поява іржавого забарвлення свідчить про позитивну реакцію (про наявність у бактерій відповідної амідази). Контролем є посіви в пробірках без амідів.
Різні види мікобактерій відрізняються по ферментативній активності стосовно різних амідів. Ці розходження подані в табл. 3.2.
Таблиця 3.2 - Амідазна активність окремих видів мікобактерій---------------------------------------------------------------------| Група | Види | Аміди || |----------------------+--------------------------------||За Раньоном| Мікобактерій |Сечовина|Нікотинамід|Піразинамід||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| |М. Tuberculosis | + | + | + ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| |M. Bovis | + | - | - ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| I |M. Kansasii | + | + | - ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| II |M. Gordonae (m. Aquae)| -/+ | - | - ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| II |M. Scrofulaceum | + | + | + ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| III |M. Avium | - | + | + ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| III |M. Xenopi | - | + | + ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| III |M. Intracellulare | - | + | + ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| III |M. Terrae | - | + | + ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| IV |M. Fortuitum | + | +/- | +/- ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| IV |M. Smegmatis | + | + | + ||-----------+----------------------+--------+-----------+-----------|| IV |M. Phlei | + | + | + |---------------------------------------------------------------------Позначення: + реакція позитивна, - реакція негативна,
+/- реакція може бути позитивною або негативноюДля штамів кислотостійких сапрофітів, що швидко ростуть (IV група), характерною є наявність формамідазної активності. Цей фермент відсутній у M.tuberculosis й у більшості атипових мікобактерій, які класифіковані за Раньоном.
Принцип реакції полягає в здатності формамідази розщеплювати формамід з утворенням аміаку, виділення якого уловлюється в реакції з фенолом і гіпохлоритом.
Хід дослідження (модифікована методика Дихно) аналогічний реакції на нікотинамідазу. Використовується 0,2 мл формаміду на 250,0 мл дистильованої води. Для проведення реакції необхідно мати інгредієнти високої якості.
3.2.2.3 Визначення нітратредуктазної активностіПри диференціюванні мікобактерій туберкульозу користуються також реакцією відновлення нітратів у нітрити. Реакція відновлення нітратів дає можливість диференціювати M.tuberculosis, які мають нітратредуктазу, від M.bovis, M.avium і від деяких атипових, у яких цей фермент відсутній. Виняток складають фотохромогенні мікобактерії (М. kansasii) і деякі з III і IV груп.
Принцип. Активність нітратредуктази визначається по кількості відновленого з нітрату нітриту, що дає кольорову реакцію з пара-диметиламінобензальдегідом.
Реактиви.
1. 0,067 М фосфатний буфер (рН-7, 1), що містить 0,1 % нітрату натрію.
2. 2,0 % розчин (вага/об'єм) пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % HCl.
3. 10,0 % розчин соляної кислоти.
Для реакції використовують 3-4-тижневі культури, вирощені на яєчному середовищі.
Хід дослідження. 50,0 мг вологої ваги 3 - 4-тижневої культури суспендують в 5,0 мл (можна суспендувати 10,0 мг культури в 1,0 мл) 0,067 М фосфатного буферу (рН - 7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію, і інкубують при 37 град. Цельсію 15 - 16 годин. Утворення нітриту перевіряється додаванням 2 крапель 2,0 % розчину пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % HCl + 1,0 мл 10,0 % HCl. Поява жовтого забарвлення свідчить про належність культури до M.tuberculosis (метод Тсукамура).
Крім активності вказаних ферментів для відрізнення M.tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій можна використовувати різну активність окисно-відновних ферментів.
3.2.2.4 Диференціація мікобактерій за окисно-відновнимиферментамиУ окисно-відновних процесах мікробної клітини активну участь приймають такі ферменти, як каталаза і пероксидаза. У M.tuberculosis і M.bovis, чутливих до препаратів групи ГІНК (гідразиду ізонікотинової кислоти), виявляється активність обох ферментів паралельно. При цьому у чутливих культур спостерігається швидке активне виділення пухирців кисню, обумовлене діяльністю каталази, і забарвлення колоній у темно-коричневий колір, обумовлене діяльністю пероксидази. Поява коричневого пігменту пояснюється переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази. У культур M.tuberculosis, стійких до препаратів групи ГІНК, активність цих ферментів різко знижена, при визначенні каталазної активності пухирці кисню виділяються в невеликій кількості, повільно або майже відсутні, а при визначенні активності пероксидази колонії або ледь забарвлюються, або (при високому ступені стійкості до ізоніазиду) залишаються безбарвними. На відміну від M.tuberculosis, у атипових мікобактерій, незалежно від стійкості до ГІНК, каталазна активність завжди різко позитивна, пероксидазна ж, як правило, не виявляється.
Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно (модифікована методика Богена)Принцип каталазної реакції полягає в розщепленні перекису водню ферментом каталазою на воду й атомарний кисень, що супроводжується виділенням пухирців кисню і переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази.
Реактиви.
1. 0,5 % пірогалол: 50,0 мг чистого пірогалолу розчинити в 10,0 мл дистильованої води.
2. 2,0 % пергідроль. 0,2 мл пергідролю розвести в 10,0 мл дистильованої води.
Обидва розчини готують безпосередньо перед дослідом, змішують і наливають у пробірку так, щоб покрити культуру.
Хід дослідження. Обидва розчини зливають у колбу в рівній кількості і наливають по 6,0 - 8,0 мл суміші у пробірку з культурою. В залежності від кількості культур, що перевіряють, об'єм розчинів, які готуються, відповідно збільшують.
Облік реакції активності каталази проводять через 5 хвилин по активному виділенню пухирців кисню. Реакцію на пероксидазу враховують через 1,5-2 години по забарвленню колоній у темно-коричневий колір.
Ступінь активності каталази позначають по 3-бальній системі:
- +++ рясне виділення пухирців кисню в 1-шу хвилину;
- ++ помірне виділення пухирців кисню;
- + поодинокі пухирці.
При відсутності пухирців реакція вважається негативною (- ).
Активність пероксидази оцінюється також по 3-бальній системі:
- +++ темно-коричневе забарвлення колоній;
- ++ коричневе забарвлення колоній;
- + блідо-коричневе забарвлення колоній.
При негативній реакції колір колоній не змінюється.
Цінною реакцією для відрізнення M.tuberculosis від атипових мікобактерій є проба на термостабільність каталази.
Термостабільність каталазиКаталаза у кислотостійких мікобактерій різна. У вірулентних мікобактерій вона швидко і легко руйнується при нагріванні до 65 - 68 град. Цельсію. У атипових мікобактерій і кислотостійких сапрофітів вона термостабільна.
Визначення активності термостабільної каталазиГотують 3,0 мл густої зависі мікобактерій. 1,5 мл зависі переносять у центрифужну пробірку, яку нагрівають на водяній бані при 68 град. Цельсію протягом 10 хвилин. Потім пробірку охолоджують і на предметне скло наносять по 1 краплі зависі: на один кінець - непрогріту (служить контролем), на другу - завись після нагрівання. До цих двох зависів додають по 1 краплі пергідролю. Утворення пухирців свідчить про активність ферменту, відсутність - про пригнічення. На підставі цієї реакції легко відрізнити M.tuberculosis, у яких каталаза завжди термолабільна, від більшості атипових і кислотостійких сапрофітів із різко термостабільною каталазою.
Термостабільність каталази, так само як і її активність, враховується по 3-бальній системі.
Співвідношення окисно-відновних ферментів у різних видів мікобактерій показане в табл.3.3.
Таблиця 3.3 - Ідентифікація мікобактерій по окисно-відновнимферментам і ніациновій пробі---------------------------------------------------------------------------|Мікобактерії |Каталаза|Пероксидаза|Термостабільність|Ніацинова проба|| | | | каталази | ||------------------+--------+-----------+-----------------+---------------||Атипові | + + + | - | + | - ||------------------+--------+-----------+-----------------+---------------||M.tuberculosis, | | | | ||чутливі до | | | | ||ізоніазиду |+ + + | + | - | + ||------------------+--------+-----------+-----------------+---------------||M.tuberculosis, | | | | ||стійкі до | | | | ||ізоніазиду |+, + - | - | - | + ||------------------+--------+-----------+-----------------+---------------||M.bovis | + + | ++ | - | - |--------------------------------------------------------------------------- 3.2.2.5 Реакція гідролізу твіну-80Важливою реакцією для ідентифікації мікобактерій всередині II і III груп (за Раньоном), є реакція гідролізу твіну-80. Твін-80 зв'язує нейтральний червоний, і суміш до реакції має солом'яно-жовтий колір. Принцип реакції - у ензимному гідролізі твіну-80. При цьому відбувається звільнення нейтрального червоного і забарвлення відновлюється від рожевого до червоного. Позитивна реакція відзначається у M.aquae (на відміну від M.scrofulaceum, у яких реакція негативна), а з III-ї групи вона позитивна тільки у M.terrae.
Реактиви.
1. 1/15 М фосфатний буфер (рН - 7) - 100,0 мл.
2. Твін - 80 - 0,5 мл.
3. Основний нейтральний червоний, 0,1 % - 2,0 мл. Краще розчинити 0,1 г нейтрального не в 100,0, а в 85,0 мл дистильованої води.
Змішати усі три реагенти. Розлити по 4,0 мл у пробірки й автоклавувати при 120 град. Цельсію 15 хвилин. Протягом доби перевіряють на стерильність у термостаті і зберігають у холодильнику. Стабільність розчину - не більше 2-х тижнів.
Хід дослідження. Емульгують 3 бактеріологічні лопатки культури в пробірках із приготованим субстратом (твін-80 із нейтральним червоним). Пробірки поміщають у термостат. Реакцію перевіряють через 4 години, на 5-у і 10-у добу. Тест вважається позитивним, якщо рожево-червоне забарвлення з'явилося до 10-ої доби, негативним, якщо забарвлення не з'явилося (модифікована методика Вайна). Контролем є пробірка з середовищем без реактивів.
3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерійПри описанні біохімічних тестів ми зупинилися на найбільш простих пробах, що дають можливість відрізнити M.tuberculosis від атипових і розрізняти деякі види атипових мікобактерій всередині груп Раньона. При диференціації мікобактерій варто пам'ятати, що, крім використання комплексу тестів, застосованих при вивченні атипових культур, необхідно користуватися обов'язковими для кожного виду тестами (так звані ключові тести), проведення яких полегшує ідентифікацію культур. Наводимо ключові тести для окремих видів мікобактерій (табл.3.4).
Крім перерахованих тестів, для всіх безпігментних культур необхідно визначати ніацинову пробу, і якщо вона негативна, перевіряти амідазну активність. Використання описаних тестів дає можливість розділити атипові культури на патогенні для людини і випадкові супутні сапрофіти, які не впливають на захворювання.
Для клініки особливе значення мають наступні види атипових мікобактерій:
M.kansasii, M.marinum, M.scrofulaceum , M.xenopi,
M.avium, M.intracellularae, M.fortuitumДля атипових мікобактерій, крім вказаних нами особливостей (швидкості росту, пігментоутворення, морфології колоній і паличок, температурного оптимуму) характерними являються: негативна ніацинова проба, відсутність пероксидазної активності при високій активності каталази, виражена термостабільність каталази у більшості мікобактерій, ріст на живильних середовищах із паранітробензойною кислотою і саліциловокислим натрієм, відсутність в більшості випадків корд-фактору. Характерним також для атипових мікобактерій є первинна стійкість до більшості антимікобактеріальних препаратів.
Для відрізнення М.tuberculosis і М.bovis від нетуберкульозних мікобактерій, відмінності їх один від одного, а також для розрізнення атипових мікобактерій всередині груп зручно користуватися розміщеними нижче схемами.
-------------------------------------------------------------------------------|Види мікобактерій| Тести | Результати тесту, властиві || | |для даного виду мікобактерій ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.tuberculosis |Швидкість росту | Повільний || |Ніацин | + || |Відновлення нітратів | + || |Каталаза при 68 град. Цельс. | - || |Утворення пігменту в темряві | - || |Ріст на середовищі з | - || |500 мкг/ мл ПНБ | ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.bovis |Швидкість росту | Повільний || |Ніацин | - || |Відновлення нітратів | - || |Каталаза при 68 град. Цельс. | - || |Утворення пігменту в темряві | - || |Ріст на середовищі з | - || |500 мкг/ мл ПНБ | ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.kansasii |Швидкість росту | Повільний || |Відновлення нітратів | + || |Каталаза при 68 град. Цельс. | + || |Утворення пігменту після | + || |освітлення | || |Гідроліз твіну-80 | + ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.scrofulaceum |Швидкість росту | Повільний || |Каталаза при 68 град. Цельс. | + || |Утворення пігменту в | + || |темряві | || |Гідроліз твіну-80 | - ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M. Gordonae |Швидкість росту | Повільний ||(m.aquae) |Відновлення нітратів | - || |Утворення пігменту в | + || |темряві | || |Гідроліз твіну-80 | + ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.xenopi |Швидкість росту | Повільний || |Відновлення | - || |нітратів | || |Утворення пігменту в | + || |темряві | || |Гідроліз твіну-80 | - ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.avium |Швидкість росту | Повільний || |Ніацин | - || |Відновлення нітратів | - || |Гідроліз твіну-80 | - ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.intracellulare |Швидкість росту | Повільний || |Ніацин | - || |Відновлення нітратів | - || |Гідроліз твіну-80 | - ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.gastri |Швидкість росту | Повільний || |Ніацин | - || |Відновлення нітратів | - || |Каталаза при 68 град. Цельс. | - || |Утворення пігменту на світлі | - || |Гідроліз твіну-80 | + ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.terrae |Швидкість росту | Повільний || |Ніацин | - || |Відновлення нітратів | + || |Каталаза при 68 град. Цельс. | - || |Утворення пігменту на світлі | + || |Гідроліз твіну-80 | ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.fortuitum |Швидкість росту | Швидкий || |Відновлення нітратів | + || |Утворення пігменту в | - || |темряві | || |Толерантність до 5 % NaCl | + ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.smegmatis |Швидкість росту | Швидкий || |Утворення пігменту в темряві | - || |Толерантність до 5 % NaCl | + ||-----------------+-----------------------------+-----------------------------||M.phlei |Швидкість росту | Швидкий || |Утворення пігменту в темряві | + || |Толерантність до 5 % NaCl | + |------------------------------------------------------------------------------- Схема 3.1 - основні тести для відрізнення m.Tuberculosis,m.Bovis від інших мікобактерій----------------------------------------------------------------------------------| Тести |М.Tuberculosis| М.bovis | Інші || | | |Мікобактерії||------------------------------------------+--------------+---------+------------||Ніациновий тест | + | - | - ||------------------------------------------+--------------+---------+------------||Ріст на середовищі льовенштайна-єнсена із | - | - | + ||500,0 мкг/мл паранітробензойної кислоти | | | ||або саліциловокислого натрію | | | ||------------------------------------------+--------------+---------+------------||Реакція на термостабільність каталази | - | - | + ||------------------------------------------+--------------+---------+------------||Каталазна активність у гінк-резистентних | +, + -, - |+, - +, -| + + + ||штамів | | | |---------------------------------------------------------------------------------- Схема 3.2 - основні тести, що відрізняють m.Tuberculosis відm.bovis-----------------------------------------------------| Тести | M. Tuberculosis| M. Bovis ||-----------------------+----------------+----------||Ніацинова проба | + | - ||-----------------------+----------------+----------||Нікотинамідаза | + | - ||-----------------------+----------------+----------||Відновлення нітратів | + | - |----------------------------------------------------- Схема 3.3 - I група - фотохромогенні мікобактерії--------------------------------------------------------------------------------------| |25 град.|37 град. |45 град|Відновлення нітратів|Гідроліз твіну-80 || |Цельсію |Цельсію |Цельсію| | ||-----------------+--------+---------+-------+--------------------+------------------||M.kansasii | + | + - | - | + | + ||-----------------+--------+---------+-------+--------------------+------------------||M.simiae | + | + - | - | - | + ||-----------------+--------+---------+-------+--------------------+------------------||M.marinum | + | + - | - | - | - |--------------------------------------------------------------------------------------Для розрізнення всередині групи необхідні наступні тести:
утворення пігменту, гідроліз твіну-80, ніацинова проба (M.simiae + -), відновлення нітратів, ріст при 25 і 37 град. Цельсію.
Схема 3.4 - II група - скотохромогенні мікобактерії-----------------------------------------------------------------------------------------| Штами |25 град.|37 град. |45 град|Відновлення | Уреаза |Гідроліз твіну|| |Цельсію |Цельсію |Цельсію| нітратів | | - 80 ||----------------+--------+---------+-------+----------------+-----------+--------------||M.aquae | + | + - | - | - | + | + ||(m.gordonae) | | | | | | ||----------------+--------+---------+-------+----------------+-----------+--------------||M.aquae | + | + - | - | - | - | + ||----------------+--------+---------+-------+----------------+-----------+--------------||M.scrofulaceum | + | + - | - | - | + | - |----------------------------------------------------------------------------------------- Схема 3.5 - III група - нефотохромогенні мікобактерії (основі тести)------------------------------------------------------------------------| |25 гр|45 гр|Відновлення|Гідроліз|Каталаза 68 | Амідазна || |Цельс|Цельс| нітратів |твіну-80|град. Цельс.|активність ||------------+-----+-----+-----------+--------+------------+-----------||M.avium | + - | + - | - | - | + | Н; п ||------------+-----+-----+-----------+--------+------------+-----------||M.intracellu| + - | + - | - | - | + | Н; п ||lare | | | | | | ||------------+-----+-----+-----------+--------+------------+-----------||M.terrae | + | - | + | + | + | 0 ||------------+-----+-----+-----------+--------+------------+-----------||M.triviale | + | - | + | + | + | Н; п; 0* ||------------+-----+-----+-----------+--------+------------+-----------||M.xenopi | - | + | - | - | + | Н; п |------------------------------------------------------------------------ m. Terrae вайна - 0; M.terrae Тсукамура - Н; ПН - нікотинамід, П - піразинамід, 0 - негативна реакція.
Схема 3.6 - IV група - мікобактерії, що швидко ростуть(основні тести)-----------------------------------------------------------------------| |25 град. | 37 град.|45 град. |52 град. | Гідроліз || |Цельсію | Цельсію |Цельсію |Цельсію | твіну-80 ||-----------------+---------+---------+---------+----------+----------||M.fortuitum | + | + | - | - | + - ||-----------------+---------+---------+---------+----------+----------||M.phlei | + | + | + | + | + ||-----------------+---------+---------+---------+----------+----------||M.smegmatis | + | + | + | - | + |----------------------------------------------------------------------- 3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких бактерійКрім широкого використання для диференціації культур біохімічних тестів, при встановленні видової належності культур користуються біологічним методом.
Відомо, що чутливість експериментальних тварин до M.tuberculosis, M.bovis i M.avium - різна. Тому в лабораторній практиці експериментальні дослідження проводять на морських свинках, кроликах, білих мишах і курах.
Для зараження морських свинок під шкіру користуються двома дозами: 0,1 мг і 0,01 мг; кроликів - внутрішньовенно 0,1 мг і 0,01 мг і білих мишей - внутрішньовенно дозою 0,1 мг. Курей заражають у вену крила 0,1 мг і 1,0 мг.
М.tuberculosis, чутливі до препаратів ГІНК, призводять до загибелі морських свинок до 2-3-х місяців і білих мишей до 20-30-ої доби. На секції у свинок - картина важкого генералізованого туберкульозу з ураженням внутрішніх органів і лімфатичних вузлів, у білих мишей - ураження легень.
М.bovis викликають загибель кроликів до 1,5-2-х місяців із ураженням нирок, легень, а також морських свинок (приблизно через 2 місяці) і білих мишей (на 20-30-у добу).
M.avium призводять до загибелі курей (на 30-50-у добу), кроликів (на 20-40-у добу), а у білих мишей викликають ураження легень, печінки і збільшення селезінки. У свинок відзначається лише інфільтрат під шкірою на місці введення культури, а іноді - невелике збільшення регіонарних лімфатичних вузлів. Варто пам'ятати, що у курей і кроликів туберкульозні ураження на органах частіше всього відсутні. На секції у кур видно різко збільшену печінку, а у кроликів - також і селезінку.
Підтвердженням того, що причиною загибелі тварин були М.avium, є мазки - відбитки з печінки, селезінки і кісткового мозку. У препаратах виявляється значна кількість поліморфних кислотостійких мікобактерій.
Ідентифікація мікобактерій туберкульозу по культуральним, біохімічним і біологічним методам надана в табл.3.5 (на стор. 50).
Таким чином, для відрізнення мікобактерій туберкульозу від інших кислотостійких мікобактерій використовують комплекс ознак: культуральні властивості, відсутність здатності до росту на яєчному середовищі з паранітробензойною кислотою або саліциловокислим натрієм, здатність до утворення корд-фактору, термолабільність каталази та й ін.
Перераховані ознаки відрізняють M.tuberculosis від атипових мікобактерій.
Атипові мікобактерії в більшості випадків не патогенні для лабораторних тварин. Патологічні зміни в органах можуть бути отримані в більшості випадків при внутрішньовенному або внутрішньочеревинному зараженні морських свинок, кроликів і мишей великими дозами бактерій (1,0 мг і більше). На практиці для відрізнення непатогенних мікобактерій від туберкульозних можна користуватися внутрішньошкірним зараженням морських свинок введенням зависі 0,1 мг мікобактерій у 0,2 мл фізіологічного розчину.
На введення М.kansasiі, M.scrofulaceum, М. intracellulare, М. avium і деяких інших розвивається виразка, яка самозагоюється, на відміну від генералізованого процесу, що виникає при внутрішньошкірному введенні M.tuberculosis i M.bovis.
При вивченні виділених штамів зустрічаються певні труднощі. Може мати місце одночасне виділення типових і атипових мікобактерій. У такому випадку, значення має кратність виділення атипових мікобактерій, рясність росту. Особливої уваги заслуговують випадки повторного виділення тільки атипових мікобактерій при відсутності типових. Питання про значення їх у етиології захворювання вирішується на підставі комплексу клініко-рентгено-бактеріологічних досліджень.
З усіх приведених методів дослідження жодний, сам по собі, не може відповісти на запитання про належність штаму до одного із видів. Тільки комплексне застосування ряду бактеріологічних, біохімічних, біологічних методів дослідження дає можливість правильно ідентифікувати виділені культури. При ідентифікації мікобактерій перед мікробіологами встають наступні питання: чи є виділені мікобактерії туберкульозними, і до якого виду вони належать.
Якщо виділяються культури, відмінні від туберкульозних, то необхідно уточнити, чи відносяться вони до атипових, і до якої групи по Раньону. В залежності від лабораторії, що обслуговує туберкульозні заклади, об'єм тестів, що використовуються при ідентифікації мікобактерій, підрозділяється на більш прості і доступні для кожного практичного закладу і більш детальні, що включають ряд біохімічних і біологічних досліджень. Останні проводяться у лабораторії при обласному протитуберкульозному диспансері. 1-й комплекс досліджень включає наступні найбільш прості тести, на підставі яких вирішується питання про належність штаму до туберкульозних або атипових мікобактерій:
- швидкість росту;
- утворення пігменту;
- каталазо-пероксидазна активність;
- термостабільність каталази;
- ріст на середовищі з пара-нітробензойною кислотою;
- первинна медикаментозна стійкість.
2-й комплекс досліджень включає додаткові бактеріологічні і біохімічні тести: ріст у мікрокультурах, утворення ніацину, ациламідна активність, гідроліз твіну-80 і докладне вивчення культуральних і біологічних властивостей.
Біохімічний метод ідентифікації мікобактерій у сполученні з культуральним є швидким, доступним і надійним. Він повинен широко застосовуватися в бактеріологічних лабораторіях.
У таблиці 3.6 подана ідентифікація ряду видів мікобактерій за комплексом бактеріологічних і біохімічних тестів (на стор.50).
Таблиця 3.5 - Ідентифікація мікобактерій туберкульозу культуральними, біохімічними, біологічними методами----------------------------------------------------------------------------------------------------------------| Види |Ріст пасажних культур на |Морфо-|Колір| Біохімічні тести | Вірулентність для ||Мікобак-| різних середовищах при |логія |коло-| | тварин ||терій | різних температурах |коло- |ній | | || |-----------------------------|ній | |------------------------------------+---------------------|| | Яєчне |Середо- | Агар | | |Ніаци-|Ката-|Віднов-|Нікотина|Корд- |Мор-|Кро- |Миші|Кури || | середо- | вище |Гліце- | | |новий |лаза |лення |мідазна |фактор|ські|лики | | || | вище |Школь- |рино- | | | тест | |нітра- |актив- | |сви-| | | || | |нікової |вий | | | | | тів |ність | |нки | | | ||--------+-----------+--------+--------+------+-----+------+-----+-------+--------+------+----+-----+----+-----|| |25 |37 |45 | 37 |25 |37 | | | | | | | | | | | || |гр.|гр.|гр.|гр. Ц. |гр.| гр.| | | | | | | | | | | ||--------+---+---+---+--------+---+----+------+-----+------+-----+-------+--------+------+----+-----+----+-----||M.tuberc| - | + | - |+ груба | - | - | R |Кре- | + |+ + *| + | + | + | + | - | + | - ||ulosis | | | |плівка | | | |мовий| | | | | | | | | ||--------+---+---+---+--------+---+----+------+-----+------+-----+-------+--------+------+----+-----+----+-----||M.bovis | - | + | - |+ тонка | - | - | Rs |Білий| - |+ + *| - | - | + | + | + | + | - || | | | |плівка | | | |(сі- | | | | | | | | | || | | | | | | | |рий) | | | | | | | | | ||--------+---+---+---+--------+---+----+------+-----+------+-----+-------+--------+------+----+-----+----+-----||M.avium |-/+| + | + | + | - | - | S |Кре- | - |+ + +| - | - | - |+ - | + | + | + || | | | |придоний| | | |мовий| | | | | | | | | || | | | | ріст | | | | | | | | | | | | | |----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Позначення: + ростуть, - не ростуть, -/+ деякі культури ростуть; + реакція позитивна, - реакція негативна; + вірулентні, + - слабо вірулентні, - не вірулентні.
(у чисельнику - більшість штамів, у знаменнику - меншість);
* - у штамів, чутливих до ізоніазиду.
Таблиця 3.6 - ідентифікація кислотостійких мікобактерій бактеріологічними і біохімічними тестами--------------------------------------------------------------------------------------------------------------| | Мікобактерії || |---------------------------------------------------------------------------------------------|| Тести |Туберкульо-| Атипові || | зні |---------------------------------------------------------------------------------|| |-----------| I група | II група | III група | IV група || |M.tube|M.bo| | | | || |rculos|vis |-----------+-------------+--------------------------------+----------------------|| |is | |M.kan|M.mar|M.scrof|M.gor|M.avi|M.intrac|M.xen|M.ter|M.tri|M.for|M. |M. || | | |sasii|inum |ulaceum|donae|um |ellula- | opi | rae |viale|tui- |phlei|smegmatis || | | | | | | | |rae | | | |tim | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Швидкість |Повіль|Пові|Пові-|Пові-|Повіль-|Медл.|Пові-|Повільн.|Пові-|Пові-|Пові-|Швид-|Швид-| Швидко ||росту | но |льн.| льн.| льн.| но | |льн. | |льн. |льн. |льн. | ко | ко | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Ніацин | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Утворення | - | - | - | - | + | + | - | - | -/+ | - | - | - | + | -/+ ||пігменту у | | | | | | | | | | | | | | ||темряві | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Утворення | - | - | + | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - ||пігменту на | | | | | | | | | | | | | | ||світлі | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Каталазна | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + ||активність | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Пероксидазна | + | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - ||активність | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Термостабільні| - | - | + | | + | + | | + | + | + | + | + | + | + ||сть каталази | | | | | | | | | | | | | | ||680 | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Гідроліз твіну| -/+ | - | + | + | - | + | - | - | - | + | + | +/- | + | + ||80 | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Відновлення | + | - | + | - | - | - | - | - | - | + | + | + | + | + ||нітратів | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Уреаза | + | + | + | + | + | -/+ | - | - | - | - | - | +/- | + | + ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Нікотинамідаза| + | - | + | + | + | - | + | + | + | -/+ | - | +/- | + | + ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Піразинамідаза| + |-/+ | -/+ | + | + | - | + | + | + | -/+ | - | +/- | + | + ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Ріст на | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | + | + | + ||середовищі з | | | | | | | | | | | | | | ||5 % NaCl | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Ріст на | - | - | +/- | +/- | + | + | +/- | +/- | +/- | + | + | + | + | + ||середовищі з | | | | | | | | | | | | | | ||500 мкг/ мл | | | | | | | | | | | | | | ||саліцил. | | | | | | | | | | | | | | ||Натрію | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Ріст на | - | - | +/- | +/- | + | + | +/- | +/- | +/- | + | + | + | + | + ||середовищі з | | | | | | | | | | | | | | ||500 мкг/ мл | | | | | | | | | | | | | | ||паранітробенз.| | | | | | | | | | | | | | ||Кислотою | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Ріст на | - | - | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + ||середовищі з 2| | | | | | | | | | | | | | ||мкг/ мл тібону| | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Утворення | + | + | -/+ | -/+ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - ||корд-фактору | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Ріст на | - | - | +/- | + | + | + | -/+ | +/- | - | + | + | + | + | + ||середовищі | | | | | | | | | | | | | | ||л.-й. 22-25 гр| | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Те ж 37-38 гр.| + | + | + | +/- | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Те ж 45 гр.Ц. | - | - | - | - | - | - | +/- | -/+ | -/+ | - | - | - | + | + ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Ріст на агарі | - | - | - | - | -/+ | +/- | - | - | - | - | - | + | + | + ||22 гр. Цельс. | | | | | | | | | | | | | | ||--------------+------+----+-----+-----+-------+-----+-----+--------+-----+-----+-----+-----+-----+----------||Те ж 37 гр. Ц.| - | - | - | - | +/- | +/- | - | - | - | - | - | + | + | + |--------------------------------------------------------------------------------------------------------------Позначення:
Для росту на середовищі: + ріст усіх культур, - ріст відсутній, +/- більшість культур дають ріст, -/+ більшість культур не дає росту.
Для утворення пігменту: + культури утворюють пігмент, - культури не утворюють пігмент, -/+ окремі культури утворюють пігмент.
Для біохімічних реакцій: + реакція позитивна, - реакція негативна, +/- більшість культур дають позитивну реакцію, -/+ більшість культур дають негативну реакцію.
4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробіркиBBL MGITПринцип. Пробірка BBL MGIT для виявлення росту мікобактерій містить модифікований бульйон 7Н9 Міддлбрука, доповнений OADC-збагаченням BBL MGIT, який підтримує ріст мікобактерій та забезпечує їх виявлення, і сумішшю антибіотиків BBL MGIT PANTA. Трубка BBL MGIT містить флуоресцентну сполуку, запаяну в силікон на дні круглодонної пробірки розміром 16,0 х 100,0 мм. Ця сполука реагує на присутність кисню, розчиненого в бульйоні. Вихідна концентрація кисню не дає яскравого світіння. У випадку присутності в дослідній пробі мікобактерій та їх розмноження, відбувається активне поглинання О2 й виділення СО2, що дає можливість спостерігати яскраву флюоресценцію за допомогою 365-нм УФ-трансосвітлювача або довгохвильового УФ-світла (лампа Вуда).
Реактиви.
Індикаторна пробірка BBL MGIT для виявлення росту M.tuberculosis містить 110,0 мкл флуоресцентного індикатора і 4,0 мл бульйону 7Н9 Міддлбрука. Індикатор містить пентагідрат хлористого трис-4,7-дифеніл-1,10-фенантролінрутенію в силіконовій основі. Пробірки промиті 10,0 % СО2 і закриті поліетиленовими ковпачками.
Вміст в 1,0 л дистильованої води:
модифікований бульйон 7Н9 Міддлбрука - 5,9 г ;
казеїновий пептон - 1,25 г ;
гліцерин - 3,1 мл.
BBL MGIT OADC призначено для збагачення бульйону Міддлбрука з метою швидкого росту мікобактерій і містить 15,0 мл OADC-збагачення.
Вміст в 1,0 л дистильованої води:
- О - олеїнова кислота - 0,6 г;
- А - альбумін бичачий - 50,0 г;
- D - декстроза - 20,0 г;
- С - каталаза - 0,03 г.
Ампула BBL MGIT PANTA містить ліофілізовану суміш антимікробних агентів для пригнічення росту супутньої мікрофлори.
Вміст в 1 ампулі ліофілізованої PANTA:
поліміксин В - 6000 од.; амфотеріцин В - 600,0 мкг; налидиксова кислота - 2400,0 мкг; триметоприм - 600,0 мкг; азиоцилін - 600,0 мкг.
Перед вживанням додати в ліофілізовану ампулу з сумішшю антибіотиків MGIT PANTA 3,0 мл стерильної дистильованої води. Також необхідно перевірити кожну пробірку MGIT з метою виявлення забруднення або пошкодження. Викинути будь-які пробірки, якщо вони є непридатними або дають флюоресценцію до використання.
Зберігання реактивів. Індикаторні пробірки BBL MGIT для виявлення росту мікобактерій зберігати при 2 - 25 град. Цельсію, не заморожувати. Бульйон повинен бути прозорим і безбарвним. Не використовувати бульйон, якщо він каламутний. Пробірки MGIT, які зберігаються так, як вказано на етикетці, можна засівати аж до дати закінчення терміну придатності та інкубувати на протязі восьми тижнів.
OADC BBL MGIT необхідно зберігати в темряві при 2 - 8 град. Цельсію; уникати заморожування або перегрівання. Не відкривати до вживання.
Ампули з ліофілізованою сумішшю антибіотиків зберігати при 2 - 8 град. Цельсію. Після розведення суміш PANTA можна використовувати на протязі 72 годин (при 2 - 8 град. Цельсію), або на протязі 6 місяців (при - 20 або більш низький температурі). Після розморожування суміш PANTA слід використовувати негайно; невикористану частину викинути.
Індикаторним експрес-методом на наявність M.tuberculosis можна досліджувати всі види клінічних проб (легеневих, або позалегеневих), крім сечі та крові. Обробку проб слід проводити N-ацетил-L-цистеїном з гідроокисом натрію (NALC - NaOH).
Хід дослідження.
1. Безпосередньо перед дослідженням приклеїти на пробірку MGIT етикетку з номером проби, відкрутити ковпачок пробірки MGIT й в асептичних умовах додати 0,5 мл MGIT OADC і 0,1 мл розведеної суміші антибіотиків MGIT PANTA.
2. Додати 0,5 мл концентрованої суспензії попередньо обробленої проби. Об'єм проби більше 0,5 мл може збільшити обсіменіння неспецифічною мікрофлорою. Після внесення матеріалу пробірки щільно закрити ковпачками і добре перемішати. Інкубувати в термостаті при 37 град. Цельсію.
3. Показання пробірок враховувати щодня, починаючи з другого дня інкубації. Для інтерпретації результатів застосовують пробірки з негативним (К-) і позитивним (К +) контролем.
Як негативний контроль (К -) використовується закрита незасіяна пробірка MGIT. В К- повинна спостерігатися дуже незначна флюоресценція або зовсім її не повинно бути.
Підготовка пробірки для К+:
Вилити бульйон Міддлбрука з незасіяної пробірки MGIT, наклеїти на пробірку етикетку з написом "Позитивна-контрольна", приготувати 0,4 % розчин сульфіту натрію (0,4 г на 100,0 мл стерильної дистильованої води), 5,0 мл цього розчину внести в пробірку MGIT, щільно закрити ковпачком й залишити на 1 годину при кімнатній температурі. Контрольні пробірки К + можна використовувати протягом 4 тижнів, зберігаючи при кімнатній температурі. В К + повинна спостерігатися яскрава флюоресценція (жовтогарячого кольору).
Облік показань пробірок.
1. Витягти пробірки з термостату, помістити їх під УФ-світло поряд з контрольними пробірками К + і К -. Рекомендується розміщувати під УФ-світлом один штатив з пробірками (4 по 10 пробірок) одночасно.
2. Флюоресценція виявляється як яскраво-жовтогарячий відтінок на дні пробірки і дає жовтогаряче відображення на меніску. Потім витягти цю пробірку MGIT з штативу і зрівняти з контрольними пробірками К+ і К-. Якщо флюоресценція в дослідній пробірці MGIT більше схожа на флюоресценцію в контрольній пробірці К+, то ця пробірка з позитивним результатом. Якщо ж флюоресценція більше схожа на флюоресценцію в контрольній пробірці К-, то ця пробірка з негативним результатом. Ріст можна також виявити по наявності неоднорідної каламутності, дрібних зерен або лусочок в культуральному середовищі.
3. Вміст пробірок з позитивними результатами слід пофарбувати за Цілем-Нільсеном. Наявність в мазку кислотостійких паличок рубінового кольору вказує на передбачувану присутність життєздатних мікобактерій в пробірці.
4. Облік показань пробірок з негативним результатом слід продовжувати щодня на протязі восьми тижнів, оскільки флюоресценція в пробірках MGIT може з'явитися протягом певного часу.
Пробірки з позитивним результатом можуть містити один або декілька видів мікобактерій. Мікобактерії, що швидко ростуть, можуть викликати флюоресценцію раніше мікобактерій, що ростуть повільно. Цей факт необхідно враховувати при ідентифікації мікобактерій.
Морфологію і пігментацію колоній можна визначати лише на щільних середовищах. Матеріал з пробірки MGIT з позитивним мазком кислотостійких паличок можна пересівати як на щільні, так і рідкі, живильні середовища з метою проведення в подальшому ідентифікації і визначення медикаментозної стійкості.
4.2 Визначення медикаментозної стійкості M.tuberculosis доантимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид,рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи BBL MGIT AST SIREСистема BBL MGIT AST SIRE являє собою швидкодіючий ручний якісний метод визначення чутливості M.tuberculosis до стрептоміцину, ізоніазиду, рифампіцину та етамбутолу.
Принцип. Індикаторна пробірка BBL MGIT для визначення медикаментозної стійкості M.tuberculosis представляє собою таку ж пробірку, як і у випадку для виявлення росту мікобактерій. Система BBL MGIT AST SIRE призначена для якісного аналізу протягом 3 - 14 днів. Цей аналіз грунтується на рості штаму M.tuberculosis в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, при порівнянні з пробіркою без препаратів. Спостереження за пробірками MGIT здійснюють щодня, починаючи з третьої доби після інокуляції. Відсутність флюоресценції в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, через дві доби після появи флюоресценції в контрольній пробірці, свідчить про чутливість M.tuberculosis до даного антимікобактеріального препарату. Флюоресценція в пробірці, яка містить антимікобактеріальний препарат, через дві доби або протягом двох діб після появи флюоресценції в контрольній пробірці, свідчить про стійкість мікобактерій до дії даного препарату.
Реактиви.
Комплект BBL MGIT AST SIRE містить по дві ліофілізовані ампули стрептоміцину, ізоніазиду, рифампіцину та етамбутолу.
Вміст в 1 ампулі ліофілізованого стрептоміцину - 160,0 мкг, ізоніазиду - 20,0 мкг, рифампіцину - 200,0 мкг, етамбутолу - 700 мкг.
Хід дослідження. В кожну ліофілізовану ампулу BBL MGIT з препаратом додати по 4,0 мл стерильної дистильованої води для отримання основних розведень препаратів: 40,0 мкг/мл для стрептоміцину, 5,0 мкг/мл для ізоніазиду, 50,0 мкг/мл для рифампіцину, 175 мкг/мл для етамбутолу.
Для визначення чутливості M.tuberculosis доантимікобактеріальних препаратів з використанням BBL MGITнеобхідно попередньо виділити чисту культуру бактерій на щільномуживильному середовищі Льовенштайна-Єнсена або Фінна-2.Далі слід приготувати суспензію M.tuberculosis.
1. Додати 4,0 мл BBL бульйону 7Н9 Міддлбрука в стерильну пробірку розміром 16,5 х 128 мм з ковпачком, яка містить 8 Ц 10 скляних кульок.
2. Зняти стерильною лопаткою з щільного живильного середовища якомога більше колоній, намагаючись не зачіпити середовище. Суспендувати колонії в бульйоні 7Н9 Міддлбрука. Каламутність суспензії повинна перевищувати стандарт Макфарленда 1.0.