4. Казеїново-вугільний агар
Для приготування 1 куб. дм середовища КВА необхідні наступні інгредієнти:
Кількість гідролізату казеїну, яку беруть для приготування казеїново-вугільного агару, не є постійною, а змінюється в залежності від вмісту амінного азоту. Кількість гідролізату, яку варто взяти для приготування середовища, визначають у такий спосіб: якщо, наприклад, у казеїновому гідролізаті міститься 800 мг % амінного азоту, а у виготовленому середовищі повинно міститися його 150 мг %, то роблять розрахунок:
(1000 куб. см х 150 мг %) / 800 мг % = 187 куб. см
гідролізату на 1 куб. дм середовища
Казеїновий гідролізат і дистильовану воду (приблизно 600 куб. см) змішують в емальованій каструлі відповідної ємкості і нейтралізують 20% їдким натром до pH 7,0 за бромтимоловим синім (до зеленого кольору). Потім вносять наважки різних солей за прописом. Крохмаль попередньо розчиняють у невеликій порції гарячої води і вносять у вигляді розчину. Агар-агар промивають під струменем водопровідної води протягом декількох годин або замочують на 1-2 години і вносять у суміш, після чого кип'ятять 10 хв. для розплавлення агар-агару. Потім до суміші додають цистин або цистеїн, дріжджовий діалізат або дріжджовий екстракт. Встановлюють pH 7,3 і вносять активоване вугілля, ретельно перемішуючи. Середовище розливають у флакони або пробірки. Стерилізують при 110 град. C протягом 20 хв. Середовище у флаконах після стерилізації охолоджують до 45-50 град. C, ретельно перемішують для рівномірного розподілу вугілля і розливають у чашки, а середовище в пробірках після охолодження і перемішування, скошують. Середовище, що залишилося про запас, у флаконах (матрацах) у міру необхідності розтоплюють на водяній бані або апараті Коха (текучою парою) до повного розплавлення агару. Зайве прогрівання середовища не рекомендується. Готове середовище повинне мати чорний колір, конденсаційна вода не повинна містити часток вугілля. Середовище, розлите в чашки Петрі, зберігається в холодильнику протягом тижня.
Для поліпшення якості поживного середовища одночасно з цистіном можна додати 0,03 г проліну або глютаміну на 1 куб. дм середовища.
5. Середовище із сухого казеїново-вугільного агару (КВА)
У 100 куб. см очищеної (дистильованої) води ретельно розмішують 4,5-5,0 г порошку, доводять до кипіння, автоклавують 30 хв. при 110 град. C. Середовище перемішують і розливають у чашки Петрі або пробірки. Повторне розтоплювання середовища не рекомендується.
Для поліпшення якості на 100 куб. см стерильного охолодженого КВА додають 3-5 куб. см стерильної дефібринованої крові барана, коня, великої рогатої худоби, кролика, людини. Середовище ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі або пробірки.
Замість крові для поліпшення росту можна додати, до автоклавування середовища, 0,5% активованого вугілля марки "А" або іншої марки одночасно з дріжджовим діалізатом або екстрактом (50 куб. см на 1 куб. дм середовища), попередньо нейтралізованим (за бромтимоловим синім до зеленого кольору) до pH 7,0.
6. Картопляно-гліцериновий агар (середовище Борде-Жангу), (розрахунок на 4 куб. дм середовища)
Картоплю ретельно миють щіткою з милом, обтирають спиртом і знімають ножем поверхневий шар, ретельно вирізуючи всі бруньки. Промивають дистильованою водою, нарізають на шматки і зважують необхідну кількість у чистий посуд. Картоплю в кількості 500 г заливають 1 куб. дм дистильованої води, варять до неповної готовності, додають 4% гліцерину і варять до повної готовності. Рідину, що залишилася, фільтрують через 6 шарів марлі, попередньо промитої і висушеної. До картоплі, що залишилася в каструлі, додають невелику кількість гарячої дистильованої води, струшують, дають недовго відстоятися і фільтрують через той же фільтр, після чого доводять об'єм рідини до первісного (1 куб. дм), додаючи гарячу воду (дистильовану) через той же фільтр. Картопляний відвар можна приготувати про запас, стерилізуючи при 120 град. C протягом 15 хв.
До 3 куб. дм дистильованої води додають 0,75% хімічно чистої NaCl (з розрахунку на 3 куб. дм) і 4% агар-агар (з розрахунку на всю кількість середовища). Суміш поміщають в автоклав, де агар-агар розплавляється текучою парою протягом години. Після відстоювання (у виключеному автоклаві) агар фільтрують через один шар марлі, не виливаючи осаду. Сольовий агар (3 частини) і картопляний відвар (1 частина) змішують у гарячому вигляді, розливають у флакони й одноразово стерилізують при 120 град. C протягом 30 хв. Реакцію середовища не перевіряють.
Перед уживанням до розтопленого й охолодженого до 45 град. C картопляно-гліцеринового агару додають стерильну дефібриновану кров у кількості 20-25% (цитратна і консервована кров непридатна).
7. Молочно-кров'яний агар
До 1 куб. дм водопровідної води додають 40-45 г агару, 10 г хлориду натрію і розтоплюють в автоклаві. Потім фільтрують через кілька шарів марлі. До гарячого агару додають рівну кількість знежиреного молока, підігрітого до температури 65-70 град. C, перемішують і витримують в апараті Коха при текучій парі протягом 30-40 хв., після чого фільтрують також в апараті Коха через кілька шарів марлі, дають відстоятися й обережно декантують верхній прозорий шар. Після цього середовище розливають у пляшки і стерилізують в автоклаві при 0,5 атм. протягом 40 хв. Перед уживанням до розплавленого й охолодженого до 44 град. C агару додають дефібриновану кров людини, коня, кролика або барана в кількості 20-25 %.
8. Поживний агар з тирозином
До 100 куб. см дистильованої води додають 3,5 г сухого поживного агару і 0,1 г тирозину, розплавляють над полум'ям пальника, розливають у пробірки і стерилізують при 0,5 атм. 20-30 хвилин.
9. Середовище Сімонса
Для приготування середовища Сімонса беруть:
| 1) дистильована вода | - 1 куб. дм; |
| 2) (NH4) HPO 2 4 | - 1,5 г; |
| 3) KH PO 2 4 | - 1,0 г; |
| 4) MgO х 7H O 4 2 | - 0,2 г; |
| 5) Na-цитрат | - 3,0 г; |
| 6) агар-агар | - 20,0 г |
У половині кількості дистильованої води розчиняють фосфорнокислий амоній, фосфорнокислий калій і сірчанокислий магній. В іншій частині води розплавляють агар. З'єднують обидві частини, попередньо зливши з осаду. Додають лимоннокислий натрій нейтральний, встановлюють pH 7,1-7,2. Додають індикатор - 1,6% розчин бромтимолового синього - 9,4 куб. см. Стерилізують при 0,5 атм. 30 хвилин.
10. Бульйон Хоттінгера із сечовиною
До 100 куб. см бульйону Хоттінгера pH 7,0 додають 1 г сечовини і 0,2 куб. см 1,6% спиртового розчину крезолового червоного, стерилізують текучою парою при 100 град. C протягом 15 хв. Посів роблять у 1 куб. см середовища петлею, витримують 24 години при 35-37 град. C.
11. Реактиви для визначення уреази (метод Закса)
Готують 2 реактиви.
Реактив A не стерилізують і зберігають при температурі 4-10 град. C, реактив B стерилізують в автоклаві текучою парою. Перед уживанням змішують 1 частину реактиву A та 19 частин реактиву B.
12. Розчин для змочування тампонів
У конічній колбі змішують 90-95 куб. см попередньо
приготованого 1/15 М розчину Na HPO (11,876 г на 1 куб. дм
2 4
дистильованої води) і 5-10 куб. см розчину KH PO (9,078 г на
2 4
1 куб. дм дистильованої води); до цієї суміші додають 0,5 г агар-агару, стерилізують при 1 атм. 20 хв. Потім у гарячу суміш додають 0,2 г активованого вугілля (наважку вугілля стерилізують окремо). Суміш готують про запас і зберігають у холодильнику до 2-х місяців.
13. Приготування і стерилізація тампонів
13.1. Сухі ватні тампони: на один кінець металевого дроту, що легко згинається, щільно намотують шар гігроскопічної вати. Довжина намотки повинна бути - 4-5 см (щоб уникнути аспірації вати). Кінець дроту з намотаного ватою (1-2 см) згинають під тупим кутом 110-120 град. Інший кінець дроту монтують у коркову або ватну пробку. Виготовлений тампон поміщають у пробірку і стерилізують в автоклаві при (112 +- 1) град. C протягом 30 хв. або в сушильній шафі при температурі 140-150 град. C протягом години.
13.2. Зволожені тампони: готують з дроту, що не іржавіє і легко згинається (краще алюмінієвого). Намотування вати, згинання і стерилізацію проводять так, як вказано для сухих тампонів. Стерильні тампони перед уживанням змочують у суміші (див. п. 12) шляхом дворазового занурення в пробірку з рідиною. Після змочування тампона його поміщають у пробірку, а потім використовують для взяття матеріалу. Зберігати 3 дні в умовах холодильника.
14. Порядок використання антибіотиків
Для пригнічення сторонньої мікрофлори при посіві досліджуваного матеріалу використовують пеніцилін (або цефалексин). їх застосовують як при обробці поверхні поживного середовища розлитого в чашки Петрі, так і шляхом внесення антибіотика в середовище. Для обробки поверхні середовища використовують антибіотик з розрахунку 7,5 МО, наносячи його на поверхню середовища шпателем, або вносячи його в розтоплений і охолоджений КВА з розрахунку 25-50 МО на 100 см середовища. Пеніцилін розводять безпосередньо перед взяттям матеріалу. Для цього у флакон з антибіотиком додають стерильний фізіологічний розчин для одержання основного розведення пеніциліну. При вмісті у флаконі 500,000 МО, в нього додають 1 куб. см фізіологічного розчину, а при вмісті 1 млн. МО - 2 куб.см. Отримане основне розведення антибіотика у флаконі можна зберігати в умовах холодильника при +4 град. C не більше тижня. Для одержання необхідних для роботи концентрацій антибіотика 0,1 куб. см основного розведення з флакона розчиняють у 9,9 куб. см стерильного фізіологічного розчину. 1 куб. см такого розчину містить 5000 МО на 1 куб. см фізіологічного розчину.
Схема розведення пеніциліну:
1 пробірка - фізіологічний розчин 9,9 + 0,1 куб. см основного розведення антибіотика = у 1 куб. см 5000 МО;
2 пробірка - фізіологічний розчин 8,5 + 1,5 розчину з першої пробірки антибіотика = у 1 куб. см 750 МО;
3 пробірка - фізіологічний розчин 4,5 + 0,5 розчину з другої пробірки антибіотика = у 1 куб. см 75 МО.
З третьої пробірки наносять 0,1 куб. см (7,5 МО) на поверхню поживного середовища у кожній чашці, ретельно втираючи шпателем. Розчин із третьої пробірки можна використовувати для внесення його усередину середовища. Для цього 4 куб. см (300 МО) антибіотика додають на 1 куб. дм середовища (з розрахунку 30 МО на 100 куб. см середовища). Це ж розведення можна використовувати для додавання до змочуючих рідин з розрахунку 0,1 куб. см на 10-12 куб. см рідини.
Робоче розведення антибіотика (в останній пробірці) використовують тільки в день приготування.
Додаток N 4
КОНТРОЛЬ ЯКОСТІ
поживних середовищ
1. Методика кількісного визначення азоту
Принцип методу оснований на блокуванні формальдегідом при pH 7,0 вільних аміногруп і титруванні лугом еквівалентної кількості карбоксильних груп. Початок і кінець титрування визначають потенціометрично.
| Реактиви: | їдкий натр 0,1N розчин; соляна кислота 0,1N розчин; формалін (40% розчин формальдегіду). |
Перед кожним визначенням pH формаліну доводять до 7,0.
Хід визначення. Для аналізу використовують певний об'єм "B" рідкого зразка або розчину сухого зразка з вмістом амінного азоту 1,5-5 мг.
"B" дорівнює:
1) для рідких гідролізатів низького ступеня розщеплення (0,1-0,2% амінного азоту) - 3 куб. см;
2) середнього ступеня розщеплення (0,3-0,6% амінного азоту) - 1 куб. см;
3) високого ступеня розщеплення (0,7-1,3% амінного азоту) - 0,6 куб. см;
4) для рідких поживних середовищ (0,08-0,14% амінного азоту) - 3 куб. см;
5) для рідких екстрактів (0,02-0,04% амінного азоту) - 10 куб. см.
При аналізі сухих зразків, таких як сухі гідролізати, сухі поживні середовища, сухі екстракти з вмістом амінного азоту 1,5-4,0%, "B" дорівнює 10 куб. см 1% розчину (наважка зразка "C", що аналізується, складає 100 мг).
У склянку місткістю 50 куб. см наливають об'єм "B" розчину зразка, що аналізується, і доводять загальний об'єм дистильованою водою до 20 см. Електроди потенціометра занурюють у досліджуваний розчин, pH якого доводять до 7,0 за допомогою 0,1N розчину NaOH або 0,1N розчину соляної кислоти. Під час визначення електроди повинні залишатися зануреними в розчин. До нейтралізованого розчину додають 2 куб. см нейтрального формаліну, перемішують і, не виймаючи електродів, титрують вміст 0,1N розчином їдкого натру до pH 9,1. При титруванні варто використовувати мікробюретку на 5 куб. см.
Вміст амінного азоту в досліджуваному зразку в % (X) обчислюють за формулою:
1) для рідкого зразка:
X1 = (A х K х 1,4 х 100) / (B х 1000), де
A - кількість 0,1N розчину NaOH у 1 куб. см, використане на титрування досліджуваної проби;
K - поправка до титру 0,1N розчину NaOH;
1,4 - кількість амінного азоту в мг, еквівалентне 1 куб. см 0,1N розчину NaOH;
100 - коефіцієнт перерахунку у відсотки;
B - кількість рідкого зразка в куб. см, взяте на аналіз;
1000 - коефіцієнт перерахунку мг у г;
2) для сухого зразка:
X2 = (A х K х 1,4 х 100) / C, де
C - наважка сухого зразка, що аналізується, в мг, яка міститься в об'ємі "B", що титрують;
інші позначення дивися вище.
2. Підготовка культур збудника кашлюку для перевірки якості поживних середовищ
B. pertussis, висушена з замороженого стану під вакуумом, може зберігатися дуже довгий час в ампулі при температурі не вище 10 град. C. Ампулу з висушеним штамом розкривають стерильно над лотком. Верхній кінець ампули нагрівають на полум'ї пальника і знімають парафін, потім шматочком стерильної вати, змоченим у стерильній воді, обережно торкаються до відтягнутого кінця ампули так, щоб утворилась невелика тріщина, і також мокрою ватою обводять навколо носика ампули. Після утворення кругової (або не повністю кругової) тріщини, легким ударом пінцета видаляють кінець ампули.
Після розкриття ампули в неї асептично вносять 0,2-0,3 куб. см стерильного фізіологічного розчину. Після розчинення сухого вмісту ампули його переносять пастерівською піпеткою на чашку з поживним середовищем і 48-72 години вирощують при температурі 35-37 град. C.
У перших пересівах мікроби мають дещо знижену життєздатність. Для відновлення повної життєздатності потрібно 2-3 пасажи на оптимальних поживних середовищах. Рекомендується для роботи користуватися культурою після другого або третього пересівання. Надалі культури В. pertussis зберігають на середовищі Борде-Жангу або КВА з 10% крові, пересіваючи 1 раз на 3-4 тижні. Дозволяється користуватися культурою не більше 10-го пасажу.
3. Контроль ростових якостей середовища із сухого казеїново-вугільного агару (КВА)
У зв'язку з досить складним прописом казеїново-вугільного середовища і великою чутливістю його до режиму стерилізації, варто періодично перевіряти якість готового середовища. З цією метою необхідно використовувати щойно виділені культури B. pertussis.
У стерильних пробірках роблять 8 різних розведень суспензії 2-3-добової культури. Густина суспензії в 1 пробірці повинна відповідати 5 млрд. мікробних тіл у 1 куб. см за стандартом мутності. В 2-6 пробірки наливають по 4,5 куб. см стерильного фізіологічного розчину, у 7-му наливають 2 куб. см і в 8-му - 1 куб. см. Поверхню однієї з двох чашок Петрі з досліджуваним середовищем ділять на 2-4 або 8 секторів (у залежності від поживного середовища): 0,5 куб. см суспензії з 1 пробірки переносять стерильною піпеткою в 2 пробірку і цією ж піпеткою наносять 0,1 куб. см суспензії на сектор 1. Іншою стерильною піпеткою перемішують вміст другої пробірки, переносять із неї 0,5 куб. см у 3-ю пробірку і 0,1 куб. см наносять на сектор 2 і т. д. Для кожного розведення слід вживати окрему стерильну піпетку, перемішуючи нею вміст пробірки. У 8-му пробірку переносять із 7-ої 1 куб. см суспензії, також перемішуючи стерильною піпеткою і наносять 0,1 куб. см на сектор 8.
Чашку Петрі обережно, кришкою догори (щоб краплі не злилися) ставлять у термостат і витримують протягом 3-5 діб. Якщо середовище приготоване правильно, то на перших трьох секторах ріст має вигляд суцільних бляшок, на секторах 4, 5 і 6 виростають близько розташовані колонії, а на секторах 7 і 8 - невелика кількість ізольованих колоній. Якщо немає росту на останніх двох секторах, то середовищем користуватися не можна.
При використанні поживних середовищ з додаванням крові, чашки Петрі поділяють на два сектори, а при використанні сухих середовищ КВА з додаванням дріжджового екстракту - на 4 сектори.
У лабораторіях районних СЕС перевірку якості поживного середовища можна проводити за полегшеним методом. Посів колоній B. pertussis роблять на 1/16 поверхні чашки із середовищем КВА, розлитим у чашки Петрі. Усього перевіряють 5-10 колоній. Облік росту культури проводять через 48 годин. У випадку росту культури по всьому сектору - середовище доброї якості, при рості на 1/2 сектора - уповільнений ріст B. pertussis; ріст тільки на посівній площі - середовище непридатне.
Схема приготування розведень B. pertussis для перевірки якості КВА