| Інкубація протягом 30 хвилин при 37 град. С |
---------------------------------------------------------------------------
Облік результатів після витримування протягом 1 години при кімнатній температурі.
1.2. Реакція непрямої гемаглютинації
Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) є найбільш чутливим методом для виявлення протирикетсійних специфічних антитіл у сироватці крові. Суть методу полягає в тому, що еритроцити з адсорбованим на їх поверхні рикетсійним полісахаридним гаптеном аглютинуються специфічною сироваткою. На відміну від РЗК, реакція непрямої гемаглютинації буває позитивною тільки на протязі активної фази інфекції і в найближчі терміни реконвалесценції (до 6 місяців), завдяки чому РНГА дозволяє диференціювати свіжі або відносно недавні форми захворювання. При клінічній діагностиці і епідеміологічних дослідженнях рекомендується застосовувати паралельно РЗК і РНГА для диференціації свіжих антитіл від анамнестичних.
В РНГА використовують такі інгредієнти: досліджувану сироватку; стерильний фізіологічний розчин; рикетсійний антиген; еритроцити барана (або людини 0 (I) групи, (R -).
Для постановки РНГА застосовують антиген рикетсій, яким сенсибілізують свіжі еритроцити барана (або людини) безпосередньо перед дослідом або ж антигенний еритроцитарний діагностикум, котрий являє собою суспензію формалінізованих еритроцитів барана, сенсибілізованих рикетсійним антигеном.
Реакцію ставлять в об'ємі 0,5 мл в старанно вимитих і висушених стандартних полістеролових панелях з лунками або в пробірках, можна також ставити РНГА в мікроваріанті в планшетах з лунками типа "U" мікротитратора Такачі.
Порядок постановки РНГА. Сироватки перед дослідженням в РНГА розводять фізіологічним розчином 1:10 і інактивують при 56 град. С протягом 30 хвилин. Для адсорбції гетерогенних гемаглютинінів до інактивованої сироватки додають 0,05 мл осаду відмитих еритроцитів барана (або людини) на 1 мл розведеної 1:10 сироватки. Суміш старанно перемішують і залишають на 20 хвилин при кімнатній температурі, періодично струшуючи її. Потім сироватку центрифугують 10 хвилин при 2500-3000 об/хв. Надосадову рідину відсмоктують, переносять в чисту пробірку і використовують для постановки реакції, готуючи ряд розведень у фізіологічному розчині від 1:100 до 1:12800 і далі в об'ємі 0,4 мл.
Приготування еритроцитарного діагностикуму. Сухий антиген перед використанням в реакції розводять фізіологічним розчином в об'ємі, що вказаний на етикетці. До 4 мл розведеного або нативного рідкого антигена для РНГА додають 0,1 мл осаду відмитих еритроцитів барана (або людини). Після старанного перемішування суміш в пробірці поміщають на 1 годину в термостат (37 град. С), періодично, через 10-15 хвилин, перемішуючи для кращої адсорбції антигена на поверхні еритроцитів. Через годину суміш центрифугують протягом 10 хвилин при 2500 об/хв і повністю видаляють надосадову рідину. Осад ресуспендують в 10 мл фізіологічного розчину, старанно перемішуючи струшуванням. Таким чином, одержують 1%-у суспензію еритроцитів, сенсибілізованих рикетсійним антигеном. Такий діагностикум можна зберігати декілька днів при температурі 4 град. С без зниження його активності.
При використанні антигена для РНГА ДП "Львівдіалік" свіжі сенсибілізовані еритроцити можна зберігати у рефрижераторі (4 град. С) без відмивання в антигені до 20 днів, використовуючи еритроцити порціями для постановки реакції. Безпосередньо перед дослідом беруть частину суспензії еритроцитів з антигеном, еритроцити відділяють від антигена центрифугуванням і ресуспендують в фізіологічному розчині з розрахунком одержання 1%-ї суспензії.
Техніка постановки РНГА полягає в тому, що до приготовлених розведень досліджуваної сироватки в об'ємі 0,4 мл додають по 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму, тобто 1%-ї суспензії еритроцитів, сенсибілізованих рикетсійним антигеном. Після перемішування струшуванням, пробірки або панель із сумішшю поміщають на 2-3 години в термостат (37 град. С) або на 16-20 годин при кімнатній температурі (20 град. С).
Дослід повинен супроводжуватись такими контролями (табл. 6):
1) контроль досліджуваної сироватки: до 0,4 мл сироватки в початковому розведенні (1:100) додають 0,1 мл 1%-ї суспензії несенсибілізованих еритроцитів барана (людини);
2) контроль еритроцитарного діагностикуму: до 0,4 мл фізіологічного розчину додають 0,1 мл діагностикуму;
3) контроль нативних еритроцитів, використаних для виготовлення діагностикуму: до 0,4 мл фізіологічного розчину додають 0,1 мл 1%-ї суспензії еритроцитів барана (людини).
Паралельно з досліджуваними сироватками доцільно ставити РНГА з завідомо позитивною сироваткою відомого титру.
Облік результатів реакції проводять неозброєним оком по наявності або відсутності аглютинації еритроцитів. Реакцію вважають позитивною (оцінюють на "+"), якщо аглютиновані еритроцити збираються на дні лунки або пробірки у вигляді перевернутої парасольки з рівними або нерівними "фестончастими" краями. При струшуванні еритроцити відділяються від дна у вигляді конгломератів аглютинованих еритроцитів.
Реакцію вважають негативною (оцінюють на "-"), якщо еритроцити осідають на дно лунки або пробірки у вигляді диска (ґудзика) з чітким рівним краєм. При струшуванні еритроцити утворюють рівномірну гомогенну суспензію. В сумнівних випадках реакцію слід повторити. Достовірною реакція вважається при наявності негативних результатів в контролях - сироватки, діагностикуму і еритроцитів.
Титром досліджуваної сироватки вважають максимальне її розведення, яке викликає чітку аглютинацію сенсибілізованих еритроцитів. Позитивною РНГА слід вважати з розведення 1:100, діагностичним титром - 1:1000.
Пермське НВО "Біомед" виготовляє готовий для застосування антигенний еритроцитарний діагностикум для РНГА - суспензію 3%-х формалінізованих еритроцитів барана, сенсибілізованих рикетсійним полісахаридом. Еритроцитарний діагностикум комплектується 6%-ю суспензією несенсибілізованих (контрольних) формалінізованих еритроцитів барана для контролю досліджуваних сироваток і адсорбції із сироваток неспецифічних гемаглютинінів. Для розведення інгредієнтів реакції використовують формалінізований фізіологічний розчин (ФФР): 0,9%-й розчин хлориду натрію, до якого додають формалін з розрахунку 0,3 мл на 100 мл розчину.
Таблиця 6
Схема постановки РНГА
------------------------------------------------------------------------------
|Інгредієнти, | Розведення сироватки | Контроль |
|мл | | |
| |--------------------------------------+-----------------------|
| |1:100|1:200|1:400|1:800|1:1600|1:3200 |сиро- |діагнос-|еритро-|
| | | | | | | |ватки |тикуму |цитів |
|-------------+-----+-----+-----+-----+------+-------+------+--------+-------|
|Сироватка |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 |0,4 | 0,4 | 0,4 | | |
|-------------+-----+-----+-----+-----+------+-------+------+--------+-------|
|Діагностикум |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 |0,1 | 0,1 | | 0,1 | |
|(1%-а | | | | | | | | | |
|суспензія | | | | | | | | | |
|сенсибілізо- | | | | | | | | | |
|ваних | | | | | | | | | |
|еритроцитів) | | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+-----+-----+------+-------+------+--------+-------|
|Фізіологічний| | | | | | | | 0,4 | 0,4 |
|розчин | | | | | | | | | |
|-------------+-----+-----+-----+-----+------+-------+------+--------+-------|
|Свіжі | | | | | | | 0,1 | | 0,1 |
|еритроцити | | | | | | | | | |
|(1%-а | | | | | | | | | |
|суспензія) | | | | | | | | | |
------------------------------------------------------------------------------
РНГА з готовим для застосування діагностикумом можна ставити в макроваріанті в об'ємі 0,5 мл і в мікроваріанті - в планшетах з лунками типа "U" мікротитратора Такачі. При постановці реакції в макроваріанті еритроцитарний діагностикум і контрольні еритроцити використовують у вигляді 1,5%-ї суспензії, тобто діагностикум розводять в 2 мл ФФР, а контрольні еритроцити - в 4 мл. При постановці реакції мікрометодом еритроцитарний діагностикум і контрольні еритроцити використовують у вигляді 0,5%-ої суспензії: інгредієнти розводять, відповідно, в 6 та 12 мл ФФР.
Для постановки РНГА досліджувану сироватку, попередньо інактивовану і виснажену формалінізованими контрольними еритроцитами, розводять в об'ємі 0,4 мл (у мікроваріанті - 0,05 мл) - 1:100 і далі, додають в кожне розведення по 0,1 мл діагностикуму (у мікроваріанті - 0,025 мл) і суспензію старанно перемішують. Облік результатів реакції проводять після зберігання при кімнатній температурі - відповідно 4-5 та 2-3 години. Реакція має супроводжуватись контролями: сироватки, еритроцитарного діагностикуму і обов'язково контролем позитивної тест-сироватки, що додається в комплекті діагностикуму.
Модифікацією РНГА, що забезпечує одержання результатів протягом 1 години, є реакція непрямого гемолізу (РНГ). Суть цієї реакції полягає в тому, що в систему РНГА (досліджувана сироватка + сенсибілізовані полісахаридним гаптеном свіжі еритроцити барана) додають комплемент, розведений 1:10 в об'ємі 0,1 мл. При позитивному результаті замість аглютинації еритроцитів спостерігається феномен гемолізу. Титри РНГ з позитивними сироватками співпадають з титрами РНГА. Результати апробації реакції непрямого гемолізу в Українському центрі з рикетсіозів МОЗ України дають підставу рекомендувати цей тест для практичного застосування при необхідності швидко одержати результат.
1.3. Реакція аглютинації рикетсій
Реакція аглютинації рикетсій (РАР) є найбільш простим і доступним методом лабораторної діагностики рикетсійних захворювань. Перевагою цього методу діагностики є мінімальне число компонентів реакції (досліджувана сироватка + антигенний діагностикум), що дозволяє застосовувати його в кожній лабораторії для первинної (скринінгової) діагностики. Однак РАР менш чутлива в порівнянні з РЗК і особливо РНГА, потребує високого ступеня очищення антигенних діагностикумів, не позбавлена певного суб'єктивізму в оцінці результатів при використанні безколірного антигена. Тому усі сироватки, котрі позитивно реагують в РАР, незалежно від титру реакції, а також з сумнівними результатами обов'язково повинні бути дослідженні в РЗК і РНГА.
Для постановки РАР необхідні такі інгредієнти: досліджувана сироватка, яка має бути неінактивованою, прозорою, без ознак гемолізу та свіжою (не більше 10 днів зберігання); корпускулярний антиген - безколірний з рикетсій, культивованих в курячих ембріонах, або антиген коричневого кольору з рикетсій Провачека, культивованих за методом Вейгля; стерильний фізіологічний розчин. Дозволяється застосовувати дві модифікації постановки РАР в макроваріанті: об'ємний - в об'ємі 0,4 мл і крапельний, запропонований Г.С.Мосінгом, в загальному об'ємі 6 крапель. В крапельному варіанті постановки РАР використовують антиген рикетсій, культивованих за методом Вейгля, з природним забарвленням коричневого кольору, що дозволяє більш об'єктивно оцінювати результати реакції, ніж при застосуванні незабарвленого антигена з яєчних культур рикетсій з курячих ембріонів.
При об'ємному способі постановки РАР досліджувану сироватку розводять фізіологічним розчином в ряді пробірок в об'ємі 0,2 мл, починаючи з 1:5. До різних розведень сироватки додають по 0,2 мл антигена, таким чином розводячи сироватку ще в два рази. Дослід супроводжують контролями: сироватки - 0,2 мл сироватки в розведенні 1:5 + 0,2 мл фізіологічного розчину; антигена - 0,2 мл фізіологічного розчину + 0,2 мл антигена. Штатив з пробірками поміщають в термостат (37 град. С) на 18-20 годин. Облік результатів проводять через 2-3 години зберігання при кімнатній температурі.
При крапельному способі постановки РАР в ряд спеціальних пробірок місткістю 0,8-1,0 мл пастерівською піпеткою дають фізіологічний розчин: в першу - 4 краплі, в решту по 3 краплі. Потім в першу пробірку додають 1 краплю сироватки, старанно перемішують, одержуючи розведення 1:5. Шляхом переносу по 3 краплі розведеної сироватки з першої пробірки - в другу, з другої - в третю і так далі - до шостої одержують ряд розведень сироватки в об'ємі 3 крапель (в першій пробірці в об'ємі 2 крапель).
До сироватки в різних розведеннях додають по 3 краплі антигена (в першу пробірку - 2 краплі), одержуючи розведення сироватки ще в 2 рази: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320.
Для контролю сироватки роблять розведення її фізіологічним розчином 1:10. Для контролю антигена до 3 крапель фізіологічного розчину додають 3 краплі препарату. Штатив з рядом пробірок струшують для змішування реагентів і поміщають в термостат (37 град. С) на 18-22 години. Після термостата пробірки видержують 2-3 години при кімнатній температурі, не струшуючи їх, щоб не зруйнувати ніжний аглютинат рикетсій на дні пробірок. Реакцію читають без аглютиноскопа. При позитивній реакції на дні пробірки утворюється темно-коричневий осад у вигляді перевернутої парасольки. Характер аглютинації рикетсій дрібнозернистий.
Облік результатів. Ступінь аглютинації рикетсій оцінюють по трьохплюсовій шкалі:
- повне просвітлення надосадової рідини і чіткий осад на дні пробірки позначають трьома плюсами (3+);
- неповне просвітлення надосадової рідини при наявності чіткого осаду позначають двома плюсами (2+);
- незначне просвітлення надосадової рідини і слабовиражений осад оцінюють одним плюсом (1+).
При визначенні титру реакції враховують результати на три і на два плюси.
Облік результатів при постановці реакції об'ємним способом проводять таким самим чином; на дні пробірки спостерігається безколірний аглютинат.
1.4. Метод флуоресціюючих антитіл
Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) відноситься до експресних методів діагностики. Він поєднує в собі високу специфічність імунологічного та високу чутливість люмінесцентного методів. Стосовно рикетсійних інфекцій використовують МФА для ідентифікації специфічних антигенів і антитіл. В практичних умовах застосовують прямий і непрямий МФА з диференціюючими кон'югатами на основі специфічних імуноглобулінів (сироваток).
Для діагностики рикетсійних захворювань на основі виявлення специфічних антитіл в крові хворих і перехворілих людей (або тварин) необхідно використовувати непрямий метод флуоресціюючих антитіл (нМФА). Для індикації збудника (антигена) можуть бути використані як прямий, так і непрямий варіанти МФА. Цей метод діагностики більш складний порівняно з пробірочними серологічними тестами, потребує використання спеціальних інгредієнтів і обладнання, в тому числі люмінесцентного мікроскопа, та відповідного досвіду роботи. Однак, враховуючи універсальність методу, можливість швидкого (протягом 1-2 годин) виявлення і серологічної ідентифікації антигенів або антитіл, в тому числі з диференціацією класів імуноглобулінів, МФА має бути застосований в повсякденній роботі практичних лабораторій, в першу чергу лабораторій відділів ОНІ обл (міськ) санепідстанцій.
Інгредієнти і обладнання, необхідні для постановки МФА
- Рикетсійні корпускулярні антигени або готові слайди антигенів на предметних скельцях.
- Специфічні імунні сироватки проти рикетсій (людини і лабораторних тварин).
- Люмінесціюючі специфічні сироватки проти рикетсій, мічені флуоресцеїн-5-ізотіоціанатом (ФІТЦ).
- Люмінесціюючі антивидові сироватки проти імуноглобулінів людини та різних тварин, мічені ФІТЦ.
- Бичачий альбумін, мічений родаміном.
- Забуферений фізіологічний розчин рН 7,2-7,4.
- Спирт 96%.
- Ацетон.
- Етиловий ефір (суміш Нікіфорова).
- Дистильована вода.
- Люмінесцентний мікроскоп.
- Предметні скельця, чашки Петрі, фільтрувальний папір.
Для приготування забуференого фізіологічного розчину в 1 л ізотонічного розчину хлориду натрію розчиняють 1,513 г двозаміщеного фосфорнокислого натрію і 0,204 г однозаміщеного фосфорнокислого калію.
1.4.1. Прямий метод флуоресціюючих антитіл. Фарбування препаратів та облік результатів проводиться відповідно настанови до люмінесціюючої специфічної (антивидових) сироваток проти рикетсій мічених флуоресцеїн-5-ізотіоціанатом (ФІТЦ).
1.4.2. Непрямий метод флуоресціюючих антитіл. Непрямий метод флуоресціюючих антитіл (нМФА) використовують з метою виявлення специфічних антитіл у хворих на рикетсіози людей і тварин та перехворілих. Одночасно можна проводити диференціацію класів імуноглобулінів, тому нМФА може застосовуватись для діагностики свіжих і анамнестичних антитіл.
Етапи проведення нМФА:
1-й етап. Підготовка антигена. Для нМФА використовують корпускулярні антигени рикетсій. В ампулу з сухим антигеном за день до приготування додають 1 мл дистильованої води з метою насичення корпускул рикетсій вологою. Наступного дня з цього основного розведення готують робоче розведення в фізіологічному розчині, щоб в мазку з такого розведення антигена виявлялось орієнтовно 100-200 рикетсійних корпускул в полі зору мікроскопа; мазки досліджують в прямому методі флуоресціюючих антитіл.
На предметні скельця, старанно вимиті та знежирені в суміші Нікіфорова, наносять невеликі краплі антигена у відповідному робочому розведенні. На кожне скло наносять 8 крапель. Такої кількості крапель достатньо для дослідження 1-2 сироваток. Мазки добре висушують на повітрі, фіксують протягом 20 хвилин спиртом або ацетоном і зберігають до використання при температурі від 0 до 4 град. С. Препарати необхідно оберігати від вологи. Такі мазки придатні для роботи протягом місяця.
Перед використанням антигенних слайдів кожну пляму антигена обводять восковим олівцем, щоб створити орієнтир для мікроскопування і бар'єр-перепону розтіканню досліджуваної сироватки та флуоресціюючого антивидового кон'югата.
2-й етап. Створення системи специфічного комплексу антиген + антитіло з досліджуваною сироваткою. Досліджувані сироватки, попередньо інактивовані протягом 30 хв. при температурі 56 град. С, розводять у фізіологічному розчині дворазово - від 1:10 до 1:80, а при необхідності і більше.
Краплі із відповідних розведень сироватки наносять піпеткою Пастера у зворотному напрямку на плями антигена і витримують 45 хвилин у зволоженій камері (чашка Петрі із зволоженим дном) в термостаті при 37 град. С. Потім препарат промивають фосфатним буферним розчином (РН 7,2-7,4) протягом 10 хвилин і висушують на повітрі. При наявності антитіл в досліджуваній сироватці утворюється специфічний комплекс антиген + антитіло.
3-й етап. Ідентифікація специфічного комплексу флуоресціюючим кон'югатом. Після висушування на мазки наносять по краплі антивидовий (відповідно досліджуваній сироватці) люмінесціюючий імуноглобулін (сироватку) в робочому розведені (згідно даних на етикетці ампули). Мазки знову витримують у зволоженій камері 30 хвилин при температурі 37 град. С.
В якості антивидових кон'югатів використовують люмінесціюючі сироватки проти гамаглобулінів людини, кроля, морської свинки, барана та інші - відповідно до видової належності досліджуваних сироваток. Для гасіння неспецифічного свічення необхідно застосовувати бичачий альбумін, мічений родаміном, або 0,1%-й розчин Еванса, які змішують з антивидовою люмінесціюючою сироваткою в рівних об'ємах з розрахунком, щоб при змішуванні мати робочі дози інгредієнтів.
Після інкубації препарати промивають в двох порціях фосфатного буферного розчину протягом 10 хвилин, споліскують дистильованою водою і висушують на повітрі.
Для контролю в кожний дослід вводять пробу з позитивною і негативною сироватками, а також контроль антивидової люмінесціюючої сироватки, в якому на пляму антигена наносять тільки флуоресціюючий кон'югат.
Облік результатів реакції. Препарати досліджують в люмінесцентному мікроскопі: об'єктив 90х, окуляр 10х або 7х. Використовують фільтри для препаратів, оброблених кон'югатами флуоресцеїн-5-ізотіоціаната (ФІТЦ): первинні світлофільтри для МЛ-2: ФС 1-4; СЗС 7-2; БС 8-2; окулярний - зелений; для ЛЮМАМ: ФС 1-4; СЗС 21-2; ФС 1-6; окулярний зелений.
Проглядають не менше 10-20 полів зору. Оцінку результатів реакції проводять відповідно до яскравості флуоресценції рикетсійних корпускул і їх морфології, використовуючи умовну шкалу визначення за допомогою плюсів:
4+ - яскрава, виблискуюча флуоресценція;
3+ - виразна, яскрава флуоресценція з характерним зеленим забарвленням; морфологія рикетсій виявляється чітко, у окремо відділених корпускул проявляються чіткі ободки за рахунок більш яскравого свічення комплексу антитіл з поверхневим антигеном;
2+ - флуоресценція слабка, морфологія клітин і колір люмінесценції виявляється досить чітко;
1+ - флуоресценція дуже слабка, морфологія рикетсій розрізняється погано, колір не визначений;
- - флуоресценція відсутня
За титр сироватки приймають максимальне її розведення, котре обумовлює свічення рикетсій на "2+" при наявності свічення "3+" або "4+" в попередньому розведенні.
Достовірною вважається реакція при відсутності свічення рикетсій в мазку антигена, обробленому лише флуоресціюючою антивидовою сироваткою в робочому розведенні, а також при відповідних результатах з позитивною і негативною сироватками.
2. Індикація та ідентифікація збудників рикетсійних захворювань
Методи діагностики збудників передбачають індикацію та ідентифікацію патогенних рикетсій у біологічних субстратах від хворої людини або тварин, а також в переносниках, органах дрібних ссавців, заражених експериментальних тварин та об'єктах довкілля.
Класичні методи виявлення та ідентифікації збудників рикетсійних захворювань шляхом зараження лабораторних тварин (морських свинок, білих мишей), курячих ембріонів, лабораторних культур вошей дефібринованою кров'ю або суспензією із згустків крові хворого, внутрішніх органів диких тварин, переносників (вошей, кліщів) та інших є високо специфічними і чутливими. Через значну трудомісткість та необхідність наявності спеціальних умов для роботи з рикетсіями II групи патогенності біологічні проби не можуть бути застосовані в практичних лабораторіях.
На місцях необхідно використовувати експресні методи діагностики збудників рикетсійних захворювань: метод флуоресціюючих антитіл (прямий і непрямий варіанти), реакцію непрямої гемаглютинації з імуноглобуліновим еритроцитарним діагностикумом та модифікацію РНГА з антигенним еритроцитарним діагностикумом - реакцію нейтралізації антитіл (РНАТ). При проведенні діагностичних досліджень біологічного матеріалу в експресних методах доцільно, по можливості, використовувати одночасно прямий або непрямий варіант МФА та один із варіантів РНГА.
2.1. Метод флуоресціюючих антитіл
Метод флуоресціюючих антитіл (МФА) використовують для виявлення рикетсійних антигенів в біологічних субстратах і об'єктах оточуючого середовища. Можна досліджувати: мазки крові (краще з суспензії згустку крові), мазки-відбитки внутрішніх органів дрібних ссавців, плаценти тварин, мазки з кишківників вошей, кліщів або суспензії з них та інші.
Порядок постановки МФА такий. На старанно вимитому та знежиреному предметному склі роблять тонкі мазки або відбитки досліджуваного матеріалу. Після висихання мазки фіксують етиловим спиртом або ацетоном протягом 30 хвилин. На мазку синім восковим олівцем роблять кола (залежно від кількості досліджуваних антигенів) діаметром 0,5 см, щоб створити перепону розтіканню люмінесціюючої сироватки.
В прямому варіанті МФА на відзначені олівцем поля фіксованих і висушених мазків наносять по краплі розведених люмінесціюючих сироваток проти пошукуваних антигенів рикетсій. Розведені сироватки попередньо змішують в рівних об'ємах з бичачим альбуміном, міченим родаміном, з розрахунку, щоб в суміші інгредієнти були в робочому розведенні, вказаному на етикетках ампул. Бичачий альбумін, мічений родаміном, застосовують для гасіння неспецифічного свічення.
На одне (контрольне) поле мазка наносять гетерологічну люмінесціюючу сироватку в суміші з бичачим альбуміном. Мазки у зволоженій камері (чашці Петрі), для попередження висихання кон'югата, поміщають на 30 хвилин у термостат (37 град. С). Після інкубації мазки промивають протягом 10 хвилин у фосфатному буферному розчині (РН 7,2-7,4) для видалення залишків флуоресціюючих сироваток. Після споліскування дистильованою водою препарати висушують на повітрі і досліджують в люмінесцентному мікроскопі (об'єктив 90х, окуляр 10х або 7х), використовуючи фільтри для препаратів, оброблених кон'югатами з флуоресцеїн-5-ізотіоціанатом. В мазках виявляються рикетсії у вигляді яскраво флуоресціюючих коко-бацилярних корпускул зеленого кольору.
Облік результатів проводять за умовною 4-плюсовою шкалою. Результат оцінюють як позитивний при виявленні в окремих полях зору не менше 5 рикетсій з інтенсивним свіченням збудника не менше, ніж на 3+, при негативному контролі.
В непрямому варіанті МФА на відзначені олівцем поля фіксованих і висушених мазків наносять по краплі специфічні нефлуоресціюючі (нативні) сироватки лабораторних тварин (наприклад, кроля або морської свинки) проти пошукованних рикетсійних антигенів, в чотирьохразовому титрі (титр сироватки вказано на етикетці ампули або визначають безпосередньо в РЗК; наприклад, при титрі 1:320 беруть розведення 1:80). Один мазок залишають для контролю. Мазки у зволоженій камері (чашці Петрі) поміщають на 45 хвилин у термостат (37 град. С). Потім мазки промивають фосфатним буферним розчином (рН 7,2-7,4) протягом 10 хвилин і висушують на повітрі.
Після висушування на мазки наносять антивидовий (відповідно використаній специфічній сироватці) люмінесціюючий гамаглобулін (сироватку) в робочому розведенні (умови розведення позначені на етикетці ампули). Мазки у зволоженій камері зберігають 30 хвилин при температурі 37 град. С. Для гасіння неспецифічної флуоресценції до антивидового гамаглобуліну (сироватки) додають у рівних співвідношеннях бичачий альбумін, мічений родаміном. Після експозиції препарати промивають у двох порціях фосфатного буферного розчину протягом 10 хвилин, споліскують дистильованою водою, просушують на повітрі і мікроскопують в люмінесцентному мікроскопі.
В якості позитивного і негативного контролів необхідно вводити в дослід контроль відомих антигенів, а також контроль люмінесціюючої антивидової сироватки, в якому на одне поле досліджуваного мазка наносять тільки антивидовий люмінесціюючий гамаглобулін (сироватку).
Оцінку результатів мікроскопії проводять, як і в прямому методі, за 4-плюсовою шкалою.
МФА в непрямому варіанті для виявлення і ідентифікації рикетсій необхідно використовувати нарівні з прямим варіантом у випадках відсутності специфічних люмінесціюючих сироваток проти окремих видів рикетсій для прямого методу (наприклад, волинської гарячки) або при інших обставинах.
2.2. Реакція непрямої гемаглютинації з імуноглобуліновим рикетсійним еритроцитарним діагностикумом.
РНГА з імуноглобуліновим еритроцитарним діагностикумом призначена для виявлення і ідентифікації рикетсійних антигенів в матеріалах різного біологічного походження: заражених вошах, кліщах, внутрішніх органах інфікованих тварин, курячих ембріонах та в об'єктах оточуючого середовища. Рекомендується застосовувати метод при відсутності умов для діагностики збудників методом флуоресціюючих антитіл або паралельно з МФА.
Імуноглобуліновий рикетсійний еритроцитарний діагностикум (виробництва Пермського НВО "Біомед") являє собою ліофільно висушену 3%-у суспензію формалінізованих і тонізованих еритроцитів барана, сенсибілізованих імуноглобуліном проти рикетсій. В комплекті до діагностикуму додається сухий гамаглобулін до відповідних рикетсій для реакції гальмування непрямої гемаглютинації (РГНГА), яка використовується для контролю основного досліду. Для розведення інгредієнтів і постановки реакції використовують фізіологічний розчин з формаліном: до 100 мл фізіологічного розчину додають 0,3 мл формаліну.
Дослідження невідомого біологічного матеріалу необхідно проводити після попередньої інактивації його протягом 30 хвилин при температурі 56 град. С. Робота з неінактивованим матеріалом потребує дотримання протиепідемічного режиму роботи з матеріалом, зараженим або підозрілим на зараження збудниками інфекційних захворювань I та II груп патогенності.
Порядок постановки реакції. Готують для дослідження в РНГА суспензію на фізіологічному розчині. Кліщів однієї партії розтирають у фарфоровій ступці з розрахунку 1 мл фізіологічного розчину на 50 кліщів. Суспензію центрифугують протягом 10 хвилин при 1000 об/хв. Надосадову рідину досліджують в РНГА.
Воші, при необхідності, препарують і досліджують окремо кожну, готуючи з відпрепарованих кишечників суспензію в 1,5 мл фізіологічного розчину. При неможливості відпрепарувати кожну вошу, їх розтирають по 10-15 шт. в фарфоровій ступці в 1,5 мл фізіологічного розчину. Після центрифугування протягом 10 хвилин при 1000 об/хв надосадову рідину досліджують в РНГА. Внутрішні органи тварин або жовточні оболонки курячих ембріонів також розтирають в фарфоровій ступці для одержання 10%-ї суспензії у фізіологічному розчині, потім центрифугують протягом 10 хвилин при 1000 об/хв, надосадову рідину використовують для дослідження в РНГА.
Виготовлену, очищену та інактивовану суспензію біологічних субстратів розводять фізіологічним розчином з формаліном, починаючи з 1:2-1:4 до 1:32-1:64, в пробірках або лунках стандартних полістеролових панелей в об'ємі 0,4 мл. До розведень суспензії додають по 0,1 мл еритроцитарного імуноглобулінового діагностикуму. Сухий еритроцитарний діагностикум розводять фізіологічним розчином з формаліном в об'ємі, вказаному на етикетці ампули, і старанно струшують до одержання рівномірної суспензії еритроцитів. Панелі або пробірки з реагентами струшують і залишають при кімнатній температурі на 4-5 годин або до наступного дня, після чого враховують результат.
Реакція повинна супроводжуватись контролями:
1) Контроль досліджуваного матеріалу на відсутність неспецифічних результатів постановкою реакції гальмування непрямої гемаглютинації (РГНГА). Для цього готують послідовні розведення досліджуваного матеріалу, як і для РНГА. В кожну пробірку (лунку) додають по 0,05 мл 0,1% розчину специфічного імуноглобуліну (або гомологічну сироватку для РНГА в розведенні 1:40) і після експозиції 15 хвилин при кімнатній температурі додають по 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму.
2) Контроль еритроцитарного діагностикуму на відсутність спонтанної аглютинації еритроцитів: в 2 пробірки (лунки) з 0,4 мл формалінізованого фізіологічного розчину додають по 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму.
3) Контроль імуноглобуліну (використаної сироватки): до 0,4 мл фізіологічного розчину з формаліном додають 0,05 мл 0,1% розчину імуноглобуліну або сироватки в розведенні 1:40.
Облік результатів проводять по наявності або відсутності аглютинації еритроцитів.
При позитивному результаті ("+") аглютинат еритроцитів вистилає дно пробірки (лунки) в формі перевернутої парасольки, з тонким, нерівним краєм ("фестончастим").
При негативному результаті ("-") еритроцити осідають у вигляді диска або компактного кільця з чітким рівним краєм.
У випадках, коли на фоні рівномірно аглютинованих еритроцитів утворюється кільце з осаду неаглютинованих еритроцитів, результат оцінюється як сумнівний. Реакцію необхідно повторити.
Достовірний висновок РНГА про наявність специфічного антигена в досліджуваному матеріалі можна зробити, якщо:
- спостерігається чітка аглютинація діагностикуму з досліджуваним матеріалом в розведенні 1:2 і більше;
- в РГНГА спостерігається зниження титру специфічного антигена в досліджуваному матеріалі не менш ніж у 8 разів порівняно з РНГА;
- в контролях 2 та 3 спостерігаються негативні результати.
Для більш об'єктивного контролю реакції рекомендується також вводити в дослід контрольну постановку РНГА з відомим комерційним антигеном (для РАР або РЗК), специфічним до імуноглобулінового еритроцитарного діагностикуму. Для цього сухий антиген розводять фізіологічним розчином, з нього готують ряд розведень у фізіологічному розчині з формаліном - від 1:2 до 1:256 в об'ємі 0,4 мл і до кожного розведення додають по 0,1 мл еритроцитарного імуноглобулінового діагностикуму. Позитивні результати РНГА мають бути в розведенні специфічного антигена не менш 1:16.
РНГА з імуноглобуліновим еритроцитарним діагностикумом можна ставити також в мікроваріанті, використовуючи пластини з лунками для мікросерологічних реакцій. В такому випадку використовують 0,5%-у суспензію сенсибілізованих еритроцитів (відповідно до позначень на етикетці ампули); досліджувану суспензію розводять в об'ємі 0,05 мл і діагностикум добавляють по 0,025 мл; в РГНГА для контролю до досліджуваної суспензії додають 0,025 мл 0,1% розчину специфічного імуноглобуліну або специфічної сироватки (1:40), інші контролі також проводять у відповідному об'ємі.
2.3. Реакція нейтралізації антитіл
Для діагностики рикетсійних антигенів застосовують модифікацію РНГА - реакцію нейтралізації антитіл (РНАТ). Реакція, у постановці якої використовують антигенний еритроцитарний діагностикум для РНГА, основана на нейтралізації специфічних антитіл тест-сироватки антигеном рикетсій в досліджуваному матеріалі, внаслідок чого робоча доза тест-сироватки втрачає здатність викликати феномен специфічної аглютинації сенсибілізованих еритроцитів.
Для постановки РНАТ використовують антигенний еритроцитарний діагностикум для РНГА (свіжо сенсибілізованих або на основі формалінізованих еритроцитів) та специфічну тест-сироватку РНГА.
Перед постановкою основного досліду визначають робочу дозу тест-сироватки, що додається до еритроцитарного діагностикуму. Для цього сироватку титрують в РНГА, розводячи її з 1:50 до 1:1000 в об'ємі 0,2 мл. До розведень сироватки додають по 0,2 мл фізіологічного розчину і 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму. За результатами обліку РНГА визначають титр сироватки або одну гемаглютинуючу одиницю (ГАО). В досліді використовують дві гемаглютинуючі одиниці, тобто розведення сироватки, в 2 рази менше її титру.
Реакцію ставлять в пробірках або лунках стандартних полістеролових панелей. Досліджувану суспензію, попередньо інактивовану, розводять фізіологічним розчином, починаючи з 1:2 і далі - до 1:64, в об'ємі 0,2 мл. До розведеної суспензії додають по 0,2 мл тест-сироватки в подвійному титрі (2 аглютинуючі одиниці) і залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі (20-22 град. С). Через 30 хвилин в усі пробірки додають по 0,1 мл антигенного еритроцитарного діагностикуму. Після утримання в термостаті (37 град. С) протягом 2-3 годин або при кімнатній температурі (20-22 град. С) 16-20 годин враховують результати реакції.
Основний дослід РНАТ супроводжується контролями:
1) контроль еритроцитарного діагностикуму: до 0,4 мл фізіологічного розчину додають 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму;
2) контроль досліджуваного антигена: до 0,2 мл суспензії додають 0,2 мл фізіологічного розчину та 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму;
3) контроль робочої дози тест-сироватки: у дві пробірки (лунки) до 0,2 мл фізіологічного розчину додають 0,2 мл тест-сироватки - з однією та двома робочими дозами антитіл (аглютинуючими одиницями) та 0,1 мл еритроцитарного діагностикуму.
Результат реакції оцінюють по наявності або відсутності феномена гемаглютинації, так само, як і при постановці РНГА з відповідним еритроцитарним діагностикумом. Однак інтерпретація результатів РНАТ протилежна інтерпретації РНГА. Позитивною РНАТ вважається у випадку відсутності аглютинації сенсибілізованих еритроцитів і негативною - при наявності чіткої аглютинації сенсибілізованих еритроцитів.
Титром антигена в досліджуваній суспензії вважають максимальне його розведення, яке обумовлює нейтралізацію антитіл двох гемаглютинуючих одиниць тест-сироватки.
Достовірною РНАТ вважається при умові відсутності гемаглютинації в контролі еритроцитарного діагностикуму і досліджуваного антигена та позитивних результатах РНГА в контролі тест-сироватки.
3. Порядок застосування серологічних методів
3.1. Діагностика рикетсіозів групи висипного тифу. Для лабораторної діагностики рикетсіозів групи висипного тифу: епідемічного (вошивого) висипного тифу і його рецидивної форми - хвороби Бриля та ендемічного (щурячого) висипного тифу необхідно застосовувати лабораторні тести: реакцію зв'язування комплементу (РЗК); реакцію непрямої гемаглютинації (РНГА); реакцію аглютинації рикетсій (РАР); непрямий метод флуоресціюючих антитіл (нМФА).
Реакцію зв'язування комплементу вважають основним методом лабораторної діагностики рикетсіозів групи висипного тифу, оскільки вона ефективна для поточної і ретроспективної діагностики та внутрішньогрупової диференціації збудників. Комплементзв'язуючі антитіла в крові зберігаються десятиріччями після перенесення висипнотифозної інфекції, тому РЗК, як і нМФА, використовують в епідеміологічних дослідженнях для пошуку джерел інфекції і вивчення імунологічної структури населення. Для виявлення активних форм інфекції діагностичний титр РЗК становить 1:160, при ретроспективній діагностиці реакцію враховують з розведення сироватки 1:10.
Реакція непрямої гемаглютинації у хворих на висипний тиф (хворобу Бриля) визначається, як правило, у високих титрах: 1:1000-1:25600 і вище. Реакція специфічна при розведенні сироватки 1:100, діагностичний титр її дорівнює 1:1000. На відміну від РЗК, РНГА буває позитивною тільки протягом активної фази висипнотифозної інфекції і в найближчі строки реконвалесценції (до 6 місяців). Це дозволяє використовувати РНГА для диференціації свіжих антитіл від анамнестичних, що визначаються в РЗК.
Реакція аглютинації рикетсій є найпростішим методом діагностики висипного тифу (хвороби Бриля). РАР буває позитивною при свіжих формах інфекції. Після перенесеного захворювання зберігається протягом року, інколи більше, тільки в невисоких титрах (1:10-1:20). Діагностичний титр РАР дорівнює 1:40 - при використанні діагностикуму рикетсій, культивованих за методом Вейгля, Львівського ДП "Львівдіалік", або 1:160 - при використанні антигена рикетсій, культивованих в курячих ембріонах, Пермського НВО "Біомед".
Непрямий метод флуоресціюючих антитіл при висипнотифозній інфекції є більш чутливим в порівнянні з РЗК: вже на першому тижні визначається в титрах 1:320-1:2560, на 10-15-й дні - 1:2560-1:10240. Багаторічний досвід застосування нМФА при висипному тифі дає підставу рекомендувати цей універсальний і перспективний метод усім лабораторіям, в яких є умови для постановки реакції - для верифікації гострих форм інфекції, ретроспективної діагностики і диференціації класів специфічних імуноглобулінів.
За даними Українського центру з рикетсіозів, специфічні антитіла проти рикетсій Провачека у хворих на висипний тиф (хворобу Бриля) починають виявлятись вже в кінці першого (5-7-й дні) і на початку другого тижня захворювання. В невисоких титрах антитіла визначались: в РЗК (1:10-1:80) - в 32,1% випадків, РНГА (1:100-1:400) - в 30,1%, РАР (1:5-1:20) - в 28,9% випадків. В середніх титрах антитіла виявлялись: в РЗК (1:160-1:640) - в 46,1% випадків; РНГА (1:800-1:3200) - 46,1%; РАР (1:40-1:80) - 42,7% випадків. Частина сироваток вже в цей період захворювання реагувала у високих титрах: по РЗК - 1:1280 - 5120, РНГА - 1:6400-1:26500, РАР - 1:160-1:320. В кінці 2-го і на початку 3-го тижня захворювання спостерігалось зростання титрів антитіл у всіх серологічних реакціях. Комплементзв'язуючі антитіла визначались майже у всіх хворих в титрах 1:640-1:1280, гемаглютиніни - 1:1600-1:25600, аглютиніни - 1:160-1:320.
Таким чином, у хворих на висипний тиф (хворобу Бриля) специфічні антитіла у всіх серологічних тестах виявляються майже в однакові терміни від початку захворювання (наприкінці першого тижня), але найбільш високими бувають в РНГА. Характерно більш раннє (на 1-2-й дні) виявлення антитіл у хворих на рецидивну форму висипного тифу (хворобу Бриля) в порівнянні з хворими на епідемічний висипний тиф. В динаміці хвороби титри антитіл підвищуються, досягаючи максимуму в кінці другого тижня (14-15-й дні). Для РНГА характерно швидке підвищення титрів в період розпалу хвороби і відносно швидкий спад їх в період реконвалесценції. Інші серологічні реакції характеризуються відносно помірним підвищенням і помірним зниженням в період реконвалесценції, при цьому РЗК та нМФА в низьких титрах (1:10-1:40-1:80) зберігаються багато років і навіть десятиліть.
Серологічні реакції з рикетсійними антигенами бувають позитивними не тільки при типових формах висипного тифу, але й атипових і стертих, коли за клінічними даними діагностувати рикетсіоз неможливо. При цьому антитіла, незалежно від клінічної форми, виявляються в кінці першого тижня захворювання.
При серологічній діагностиці висипного тифу необхідно проводити повторні дослідження сироваток крові хворого, щоб прослідкувати динаміку утворення антитіл: звичайно, на 6-7-й день хвороби, повторно - через 3-5 днів. При такому динамічному дослідженні особливе значення мають не стільки абсолютні значення титрів серологічних реакцій, скільки їх зміни в напрямку підвищення або зменшення. Випадки одноразового виявлення антитіл в діагностичних титрах може бути свідченням наявності висипнотифозної інфекції.
У деяких хворих спостерігається "випадіння" окремих серологічних реакцій. Тому необхідно досліджувати сироватки у двох серологічних реакціях одночасно, наприклад, в РАР або РЗК і РНГА. Поєднання РЗК і РНГА дозволяє, поряд з виявленням, проводити диференціацію свіжих антитіл від анамнестичних, що надзвичайно важливо для клінічної і ретроспективної діагностики. Об'єктивні дані щодо диференціації антитіл можна одержати також дослідженням сироватки в нМФА з визначенням класів специфічних імуноглобулінів.
Слід враховувати, що при застосуванні в ранні строки хвороби антибіотиків широкого спектру дії (тетрациклінів, рифампіцину) може спостерігатись не тільки зниження титрів серологічних реакцій, а й запізнення їх появи.
Обстеженню на висипний тиф підлягають:
- усі хворі, яким клінічно ставиться діагноз висипного тифу або хвороби Бриля;
- хворі, у яких гарячка триває більше 5-ти днів (незалежно від віку) і клінічно не може бути виключений діагноз висипного тифу (грип, тифо-паратифозні захворювання, пневмонія, менінго-енцефаліт, менінгіт та інші); при цьому необхідно мати на увазі, що наявність анамнестичних даних про перенесення в минулому епідемічної форми висипного тифу (так звана група ризику);
- провізорно госпіталізовані хворі з підозрою на наявність висипного тифу;
- особи, що спілкувались з хворими на висипний тиф - для виявлення джерела інфекції.
Досвід показує, що загальна кількість серологічних досліджень названих вище контингентів хворих становить 0,2-0,3% від загального числа населення регіону, може вважатись достатньою для виявлення усіх випадків висипнотифозної інфекції.
Диференціація епідемічної форми висипного тифу та хвороби Бриля (первинна і повторна висипнотифозна інфекція) проводиться на основі визначення у хворих класів специфічних імуноглобулінів (IgG та IgM) в нМФА із застосуванням антивидових проти IgG та IgM флуоресціюючих глобулінів (сироваток). При первинній інфекції спостерігається утворення спочатку макроглобулінів - IgM, а пізніше мікроглобулінів - IgG. При повторній інфекції (хворобі Бриля) вже на початку антитілоутворення спостерігається інтенсивне формування мікроглобулінів - IgG.
Однак наявність специфічних макроглобулінів класу M (IgM-антитіла) не завжди свідчить про епідемічну форму висипного тифу, особливо у хворих, які давно перенесли висипнотифозну хворобу. Виявлення специфічних імуноглобулінів класу G (IgG-антитіла) може бути характерним для хвороби Бриля тільки протягом перших трьох тижнів хвороби (до 19-го дня), оскільки і при первинній інфекції в пізніші строки спостерігається формування імуноглобулінів класу G.
В якості допоміжного методу диференціації первинної і повторної висипнотифозної інфекції використовують реакцію Вейль-Фелікса з протеєм ОХ19. При епідемічній формі висипного тифу ця реакція буває позитивною у високих титрах, при рецидивній формі - негативною або позитивною у низьких титрах. Для постановки реакції перевагу слід віддавати використанню живої культури протея ОХ19.
Внутрішньогрупова серологічна диференціація епідемічного і ендемічного висипного тифу основана на визначенні у хворого комплементзв'язуючих антитіл до двох антигенів - рикетсій Провачека і рикетсій Музера. Діагноз ендемічного висипного тифу ставиться при перевищенні титру РЗК досліджуваної сироватки з антигеном рикетсій Музера в порівнянні з титром даної сироватки відносно антигена рикетсій Провачека в 2-4-8 і більше разів. Діагностичний титр РЗК з антигеном рикетсій Музера - 1:160. В реакції мають використовуватись антигенні препарати однакової активності (2 або 4 антигенні одиниці) і дослід повинен супроводжуватись контрольною РЗК з стандартними сироватками проти двох антигенів.
3.2. Діагностика гарячки Ку. Для лабораторної діагностики гарячки Ку необхідно застосовувати реакцію зв'язування комплементу і непрямий метод флуоресціюючих антитіл; може застосовуватись також реакція аглютинації. Ці серологічні тести ефективні для діагностики гострих та хронічних форм гарячки Ку у людей, ретроспективної діагностики, виявлення інфекції у сільськогосподарських тварин, а також для серологічних досліджень в ендемічних вогнищах та вивчення інших питань епідемічного нагляду.
Реакція аглютинації вважається чутливою і специфічною при гарячці Ку. За допомогою цього методу можна виявляти свіжі захворювання, оскільки більш ніж у половини хворих аглютиніни появляються уже наприкінці 1-го тижня, а протягом 2-го тижня - у всіх хворих. Через 3 місяці від початку хвороби титри аглютинінів зменшуються в декілька разів, а через рік визначаються лише у окремих хворих. Запропоновано різні модифікації реакції аглютинації при гарячці Ку (макро- і мікроваріанти, з забарвленим або люмінесціюючим антигеном та інші). Однак для постановки реакції аглютинації необхідно мати високоочищені антигенні препарати з коксіел Бернета, оскільки при використанні звичайних корпускулярних антигенів можливі нечіткі та неспецифічні результати.
Для постановки реакції зв'язування комплементу та непрямого методу флуоресціюючих антитіл використовують корпускулярні антигени, одержані з коксіел Бернета з урахуванням фазового стану їх: II фази (глибинний) та I фази (поверхневий). Застосування коксіельозних антигенів з урахуванням їх фазового стану дозволяє виявляти специфічні антитіла, характерні для гострої та хронічної форм гарячки Ку, оцінювати ефективність лікування і прогнозувати перебіг хвороби. Промисловий випуск антигена коксіел II фази буде налагоджено в Пермському НВО "Біомед", експериментальні серії антигена I та II фаз виготовлені в лабораторії рикетсійних інфекцій Львівського НДІ епідеміології та гігієни.
Первинну лабораторну діагностику гарячки Ку слід проводити з використанням антигена коксіел Бернета II фази. Комплементзв'язуючі антитіла в крові до коксіел II фази в титрах 1:40-1:320, а іноді і вище, вияються з 2-го тижня хвороби у 65-70% хворих, на 3-му тижні - у 97%, у окремих хворих антитіла виявляються після 21-го дня і пізніше. Специфічні антитіла до антигена коксіел Бернета II фази виявляються у всі періоди хвороби. Після перенесеної інфекції анамнестичні антитіла в низьких титрах (1:10-1:20), як і при інших рикетсіозах, зберігаються протягом років (10 років і більше).
Комплементзв'язуючі антитіла до коксіел Бернета фази I формуються лише після 30-го дня від початку хвороби і тестуються протягом одного року, інколи до 2-3 років. При гострій формі гарячки Ку висота титрів антитіл до I фази збудника завжди менша, ніж до II фази, а при хронічній формі, навпаки, титри цих антитіл вищі або тотожні II фазі. Виявлення комплементзв'язуючих антитіл до коксіел Бернета I фази у високих титрах може свідчити про наявність хронічної Ку-рикетсійної інфекції і потребує додаткових досліджень з визначенням класів імуноглобулінів.
Висота титрів комплементзв'язуючих антитіл при гарячці Ку характеризуються значними коливаннями (від 1:10 до 1:2560) і залежить від важкості клінічного перебігу хвороби. Однак, при повторних дослідженнях сироватки хворого з інтервалом 10-12 днів спостерігається динаміка зростання їх рівня (в 2-4 рази і більше), що є підтвердженням діагнозу. При застосуванні антибіотиків етіотропної дії в ранній період хвороби, як і при інших рикетсіозах, може спостерігатись затримка утворення антитіл.
В непрямому методі флуоресціюючих антитіл специфічні антитіла до коксіел Бернета визначаються дещо раніше, ніж в РЗК, і в більш високих титрах, що свідчить про більшу чутливість цього серологічного тесту. З використанням люмінесціюючих кон'югатів проти глобулінів людини в нМФА можна визначати специфічні антитіла за класами імуноглобулінів, що надзвичайно важливо для диференціації свіжих антитіл від анамнестичних, визначення давності перенесеної хвороби та діагностики хронічних форм гарячки Ку.
Для гострої форми гарячки Ку характерні виявлення в крові специфічних імуноглобулінів класу М (IgM) до коксіел Бернета фази II наприкінці першого - початку другого тижня хвороби. В подальшому - поступове зростання концентрації імуноглобулінів класу G (IgG), які тестуються протягом багатьох років після одужання, а з 20-30-го дня поява також імуноглобулінів проти антигена фази I; однак, концентрація останніх залишається меншою, ніж до фази II і вони поступово зникають. Тому визначення в сироватці крові тільки імуноглобулінів класу G проти антигенів коксіел Бернета фази II свідчить про давню імунну відповідь, а наявність ще імуноглобулінів до фази I є свідчення про недавнє або свіже захворювання.
При хронічній формі гарячки Ку титри імуноглобулінів до коксіел Бернета фази I постійно зберігаються на однаковому або навіть більш високому, ніж до фази II, рівні. Характерна присутність поряд з імуноглобулінами класу G також імуноглобулінів класів М і А. Для остаточної верифікації наявності хронічної форми хвороби слід враховувати клініко-епідеміологічні, анамнестичні та інші дані.
Лабораторні дослідження на гарячку Ку проводяться від:
- хворих з гарячкою більше 5 днів, у яких за клінічними та епідеміологічними даними не може бути виключено діагноз Ку-рикетсійної інфекції;
- хворих з сільської місцевості, а також особи, професійно пов'язані з тваринництвом та переробкою продукції тваринництва, з захворюванням органів дихання (пневмонії, бронхіти, ГРВІ) у весняно-літній період;
- соматичних хворих з хронічними захворюваннями органів кровообігу, дихання, печінки, сечо-статевої системи, патологією вагітності та іншими хворобами невизначеної етіології - на ендемічних по Ку-рикетсіозу територіях.
- осіб з професійним ризиком захворювання на гарячку Ку під час профілактичних оглядів.
Парні сироватки з сумнівними результатами слід надсилати для контрольних досліджень в Український центр з рикетсіозів.
3.3. Діагностика рикетсіозів групи кліщової плямистої гарячки. Для лабораторної діагностики рикетсіозів групи кліщової плямистої гарячки, зокрема марсельської гарячки, яка зустрічається на території України, необхідно застосовувати РЗК з рикетсійним антигеном. Враховуючи спільність антигенної структури збудників рикетсіозів групи кліщової плямистої гарячки, для постановки РЗК допускається використання комерційного антигена R.sibirica, що дозволяє здійснювати діагностику і чітку диференціацію від інших груп рикетсійних інфекцій.
Комплементзв'язуючі антитіла у хворих починають виявлятися з 5-7-го днів хвороби, постійно виявляються з 10-го дня. Позитивні результати враховують з розведення сироватки 1:10 при умові зростання титрів в динаміці хвороби. Рівень РЗК при кліщових рикетсіозах буває невисоким - максимально 1:80-1:320, інколи 1:640. При ранньому застосуванні антибіотиків етіотропної дії можлива затримка утворення антитіл. Для підтвердження діагнозу слід обстежувати хворих в динаміці з інтервалом 1-2 тижні. При дослідженні сироваток в РЗК необхідно паралельно використовувати антиген рикетсій Провачека (або Музера) - для серологічної диференціації кліщового рикетсіозу від рикетсіозів групи висипного тифу.
При виявленні захворювань на нових ензоотичних територіях, а також при завізних захворюваннях, лабораторний діагноз може бути підкріплений епідеміологічним анамнезом та дослідженням переносників, зібраних у вогнищах інфекції. Виявлення рикетсій в переноснику, ідентифікація збудника є серйозним аргументом при діагностиці рикетсіозів групи кліщової плямистої гарячки.
Для ідентифікації рикетсій в кліщах застосовують прямий метод флуоресціюючих антитіл (МФА) з використанням комерційних люмінесціюючих сироваток проти R.sibirica. Сироватки хворих та партії кліщів з природних вогнищ необхідно надсилати для контрольних досліджень в Український центр з рикетсіозів.
За допомогою РЗК можливо проведення ретроспективної діагностики та вивчення імунологічної структури населення, оскільки комплементзв'язуючі антитіла в низьких титрах (1:10, інколи 1:20) у перехворілих зберігаються протягом багатьох років.
3.4. Діагностика волинської (п'ятиденної) гарячки. Для серологічної діагностики волинської (п'ятиденної) гарячки необхідно застосовувати реакцію зв'язування комплементу та непрямий метод флуоресціюючих антитіл. Специфічні антитіла проти Rochalimea (Bartonella) quintana серологічними методами визначаються у хворих, починаючи з другого тижня від початку захворювання і характеризуються динамічним зростанням в ході інфекційного процесу. Титри серологічних реакцій становлять при волинській гарячці 1:16-1:256. Позитивні результати враховують з розведення сироватки 1:8. Діагностичне значення має чотирьохкратне зростання титрів антитіл при дослідженні парних сироваток хворого в інтервалі 7-8 днів.
Найбільш інформативні дані при обстеженні хворих можна одержати при поєднанні двох серологічних тестів, що дозволяє на основі визначення класів специфічних імуноглобулінів (IgM та IgG) в нМФА проводити диференціацію свіжих антитіл від анамнестичних. Всі позитивні на волинську гарячку сироватки слід надсилати для контрольних досліджень Українському центру з рикетсіозів. Виявлені переносники (одежні або головні воші та ін.) у вогнищах інфекції необхідно надсилати в Український центр з рикетсіозів для дослідження на наявність збудника.
4. Зберігання та транспортування сироваток
Повне збереження властивостей сироваток забезпечується в умовах зберігання їх у замороженому (-35 град. С) або ліофільно висушеному стані.
Позитивні або з сумнівними результатами сироватки зберігаються на протязі 7-14 діб при температурі +4 град. С в ампулах або пробірках під гумовими корками (можливо ватними, залитими парафіном для запобігання їх висихання).
Більш тривалий термін зберігання сироваток забезпечує температура -20 град. С з подальшим розморожуванням при температурі +37 град. С.
Можливо зберігання сироваток (для серологічної діагностики) висушеними на фільтровальному папері при +18-37 град. С до 45 діб. Транспортування їх здійснюється поштою у подвійних конвертах.
Рідкі сироватки в ампулах або ліофільно висушені пакують у паперові серветки або вату, розміщують в металевий контейнер та транспортують в сумці-холодильнику нарочним.
Супроводжувальна документація оформлюється відповідно до "Положение о порядке хранения, учета, хранения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", затв. МОЗ СРСР 18.05.79 р.
В розробці Інструкції приймали участь:
- від Міністерства охорони здоров'я: Л.М.Мухарська, Е.А.Лауген;
- від Львівського НДІ епідеміології та гігієни МОЗ України: І.Н.Безкопильний, М.Д.Клімчук, І.І.Курганова, З.Г.Кушнір, Н.І.Басараб, Н.Г.Бек, М.С.Кіцара;
- від Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України: Л.В.Третьякова, І.В.Присяжнюк, Н.Б.Видайко, І.М.Капітанова;
- від Київської міської санітарно-епідеміологічної станції: Ж.А.Клімова, Е.Д.Нижня, Т.В.Белозерова.