Про затвердження методичних рекомендацій "Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації"

ОГ - оптична густина лізату.

8. Робочий розчин гемолітичної сироватки готують змішуючи рівні об'єми розведеного розчину N 5 по трьохкратному титру гемолітичної сироватки до ЕБ (при титрі сироватки 1:1200, готують робоче розведення 1:400) та 3% суспензії ЕБ. При змішуванні гемолітичну сироватку приливають до суспензії ЕБ, а не навпаки. Суміш витримують при 37 град. С 30 хвилин для сенсибілізації еритроцитів.

9. 2% розчин сапоніна (2 г сапоніна розчиняють в 98 мл дистильованої води).

Сироватку отримують із крові, яку беруть без коагулянтів, відстоюють при кімнатній температурі протягом 1 години для зсідання еритроцитів. Потім центрифугують 10 хвилин при 3000 об/хв. та +4 град. С. Комплемент титрують одразу після одержання сироватки, при цьому всі операції по титруванні комплементу проводять в льодяній бані.

Досліджувану сироватку крові розводять 1:30 в розчині N 5 та розливають в 10 пробірок в кількості від 0,1 до 1,0 мл. Далі в кожній пробірці об'єм сироватки доводять розчином N 5 до 1,0 мл. Після чого в кожну пробірку додають 2,0 мл сенсибілізованих ЕБ. Додатково готують ще 3 контрольні проби: N 1 - контроль на 100% гемоліз (до 2,0 мл гемолітичної системи приливають 1,0 дистильованої води та 1 краплю 2% розчину сапоніна); N 2 - контроль на спонтанний гемоліз сенсибілізованих еритроцитів (беруть 2,0 мл гемолітичної системи та 1,0 мл розчину N 5); N 3 - контроль гемолізу досліджуваної сироватки (беруть 1,0 мл сироватки в розведенні 1:30 та 2,0 мл розчину N 5). Вміст пробірок добре перемішують і розміщують в термостаті при температурі +37 град. С 30 хв. Після цього пробірки переносять на 10 хв. в холодильник при +4 град. С для зупинки імунного гемолізу, а потім центрифугують 10 хв. при 2000 об/хв. Після центрифугування дослідних пробірок вимірюють оптичну густину їх надосадкової рідини на спектрофотометрі при довжині хвилі 541 нм проти проби надосадкової рідини в пробірці N 2 (контроль спонтанного гемолізу сенсибілізованих еритроцитів), контроль гемолізу досліджуваної сироватки знімають проти кювети з розчином N 5. Істинну оптичну густину кожної дослідної пробірки отримують віднімаючи від показника одержаної оптичної густини контролю гемолізу досліджуваної сироватки.

Варіант 1. Для кожного розведення сироваток дослідних пробірок розраховують ступінь гемолізу (У) та величину У/(1-У):

На логарифмічному папері будують графік залежності У/(1-У) по осі абсцис від об'єму досліджуваної сироватки в мл (вісь ординат). Для більшої точності беруть "У" між 0,20 та 0,80. Беручи до уваги, що величина І СН50 - це об'єм досліджуваної сироватки, який викликає лізис 50% сенсибілізованих еритроцитів, то в даних умовах постановки досліду на графіку знаходять той об'єм досліджуваної сироватки (те значення "Х"), при якому "У" = 1,0 х (0,5/1,0-0,5).

Варіант 2. На півлогарифмічному папері будують графік залежності між величинами Ух100 по осі абсцис та об'ємом сироватки в мл по осі ординат. Величина мл сироватки по осі ординат, яка відповідає величині 100хУ=50 по осі абсцис, і буде величиною СН50. Після отримання значення СН50 вираховують кількість одиниць СН50 в 1,0 мл досліджуваної сироватки виходячи з формули:

А - ступінь первинного розведення сироватки.

Наприклад, при первинному розведенні сироватки 1:30 та величині СН50 - 0,2 мл 1 мл досліджуваної сироватки вміщує: 30/0,2 = 150 СН50.

Активність комплементу виражають в гемолітичних одиницях.

4.1.7. Визначення активності лізоциму у сироватці крові турбідиметричним методом /18, 19/

Метод грунтується на властивості лізоциму гідролізувати р-1,4-зв'язки між N-ацетилмурамовою кислотою та N-ацетилглюкозаміном у полісахаридному компоненті клітинних стінок бактерій, в результаті чого настає лізис бактерій і зміна щільності досліджуваного субстрату, що визначається спектрофотометрично.

1. 0,9% ізотонічний розчин хлориду натрію

2. 0,06 М фосфатний буфер, рН - 6,2

3. Лізоцим кристалічний

4. Ацетоновий порошок Micrococcus lysodeicticus.

Вирощену на м'ясо-пептонному агарі 24-годинну культуру мікрококка суспендують у розчині хлориду натрію (0,15 М), фільтрують через двошаровий марльовий фільтр і відмивають на холоді центрифугуванням при 5000 об/хв протягом 20 хвилин - двічі - розчином хлориду натрія та 1 раз дистильованою водою. Осад, що складається з мікробної маси, переносять невеликими порціями, постійно розмішуючи, в десятикратний об'єм ацетону, інкубують у холодильнику 1-2 години при 2-4 град. С, потім фільтрують через два беззольних фільтри, змочені дистильованою водою, у воронці Бюхнера. Осад на фільтрі промивають холодним ацетоном, двічі ефіром і висушують на повітрі при кімнатній температурі. Після розмелення в фарфоровій ступці порошок фасують у пеніцилінові флакони і тримають закупореними при 3-4 град. С.

Стандартну суспензію тест-культури готують extempore таким чином: 50 мг ацетонового порошка M.lysodeicticus суспендують в 100 мл фосфатного буфера.

Перед виконанням дослідів тест-культуру необхідно перевірити на здатність лізоциму спричиняти лізис тест-культури. Для цього у пробірці змішують рівні об'єми (по 1 мл) суспензії тест-культури (1х10 в 6-му ступені клітин в 1 мл), виготовленої по бактеріальному стандарту каламутності, і розчину лізоцима з концентрацією 8 мкг/мл. У контрольну пробірку до тест-культури додають розчин хлориду натрію.

Культуру вважають придатною до роботи, якщо у пробірці з лізоцимом повний лізис клітин пройшов через 30 хвилин (при кімнатній температурі).

Приготувати робочі розчини лізоциму. Розчинити 100 мг кристалічного лізоциму у 100 мл 0,06 М фосфатного буфера (рН 6,2), а потім з цього розчину, який вміщує 100 мкг лізоциму в 1 мл, приготувати робочі розведення, необхідні для побудови калібровочної кривої.

Таблиця. Схема приготування робочих розчинів лізоциму

В кювету внести 1,5 мл щойно виготовленої суспензії мікрокока, 0,5 мл розчину хлориду натрія (0,3 М) і 1 мл розчину лізоциму визначеної концентрації. Вміст кювети швидко перемішати скляною паличкою та на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм визначити екстинцію через 15 с (Eo) та 180 с (Es).

Контролем служить буферний розчин, вміщений в кювету в об'ємі 3 мл.

Для побудови калібровочної кривої результати вимірювань відображають графічно, відкладаючи по осі абсцис концентрацію лізоцима (в мкг), а по осі ординат - різницю величини екстинції (Es - Eo).

Кров збирають у сухі пробірки, відстоюють протягом 15 хвилин при температурі 37 град. С. Центрифугують при 3000 об/хв 10 хвилин. Сироватку відбирають у чисті пробірки.

Готують розведення досліджуваних субстратів. До розчину хлориду натрію додають сироватку крові людини у співвідношенні 1:2 або 1:10. Вносять в кювету 1,5 мл свіжовиготовленої суспензії мікрокока, 0,5 мл розчину хлориду натрію (0,3 М), 1 мл сироватки крові у відповідному розведенні і вимірюють величину екстинції при 540 нм через 15 с і 180 с.

Вираховують різницю екстинції і по калібровочній кривій визначають концентрацію лізоциму в мкг/мл.

4.2. Клітинні реакції (клітинний імунітет)

4.2.1. Реакція гіперчутливості повільного типу (РГПТ) /10, 20/

Ця реакція є моделлю для визначення спроможності сенсибілізованих лімфоцитів виділяти лімфокіни (зокрема фактор який пригнічує міграцію макрофагів) і тестування функції макрофагів як ефекторів клітинного імунінету.

Інтенсивність РГПТ визначають по величині набряку у місці повторного введення антигену.

1. Фізіологічний розчин натрію хлориду

2. Еритроцити барана

Експериментальних тварин сенсибілізують одноразовим внутрішньочеревним введенням еритроцитів барана (ЕБ). Мишам вводять 10 в 6-му ступені, щурам 10 в 7-му ступені ЕБ в об'ємі 0,5 мл фізіологічного розчину натрію хлориду. Дослідний препарат вводять після сенсибілізації. Через 5 діб після сенсибілізації тваринам в підошву задньої лівої лапи (дослідної) вводять 10 в 8-му ступені еритроцитів барана в 0,02-0,05 мл фізиологічного розчину (завершальна ін'єкція), а в праву (контрольну) лапу вводять фізиологічний розчин натрію хлориду в такому ж об'ємі.

Оцінку реакції проводять через 24 або 48 годин. Визначають величину набряку, вимірюють товщину лап за допомогою мікрометра та визначають різницю мас дослідної (Д) і контрольної (К) лап. Для цього обидві лапи відрізають вище п'яточного суглоба після евтаназії тварин. Індекс реакції (ІР) обчислюють для кожної тварини за формулою:

Контрольні групи:

- тварини, які отримували тільки еритроцити барана;

- інтактні тварини, які не були імунізовані, але отримали завершальну дозу еритроцитарного антигену.

4.2.2. Реакція трансплантат проти хазяїна (РТПХ) /10, 21/

РТПХ дозволяє оцінити цитотоксичну функцію лімфоцитів (Т-кіллерів, NК-клітин) які забезпечують протипухлинний і противірусний імунітет.

Інтенсивність РТПХ оцінюють по величині регіональних лімфовузлів в ділянці введення ефекторних лімфоцитів.

1. Миші лінійні (СВА або C57B1/6)

2. Миші-гібриди 1-го покоління (СВА х C57B1/6)F1

Мишам-гібридам F1 в подушечку задньої лапи туберкуліновим шприцем вводять 1х10 в 6-му ступені - 25х10 в 6-му ступені клітин селезінки або лімфовузлів батьківського генотипу (наприклад C57Bl/6). В контрлатеральну лапу вводять таку ж кількість сингенних лімфоцитів (отриманих від тварин генотипу СВАхC57Bl/6). На 8 добу тварин забивають і визначають масу підколінних лімфовузлів в дослідній і контрольній кінцівках.

Для кількісної оцінки реакції визначають індекс збільшення лімфоузлів (ІЗЛ) по формулі:

Для мишей СВА х C57Bl/6 ІЗЛ становить 3,4-15,9 в залежності від дози імплантованих клітин.

4.2.3. Визначення кількості лімфоцитів та іх субпопуляцій

Для визначення кількості Т-, В-лімфоцитів та їх субпопуляцій в імунології використовують широкий асортимент методів різної складності.

Для визначення Т- і В-лімфоцитів застосовують метод розеткоутворення. Феномен розеткоутворення був вперше описаний Nota і Zaalberg в 1964 році, який обумовлений взаємодією мембранних рецепторів лімфоцитів з індикаторними клітинами (найчастіше з еритроцитами барана). По кількості еритроцитів, адсорбованим одним лімфоцитом судять про ступінь активності Т- і В-клітин, оскільки феномен розеткоутворення обумовлений густиною рецепторів на їх поверхні. Визначення Т-лімфоцитів проводять в реакції Е-РОК, В-лімфоцитів - ЕАС-РОК /10, 19/.

Стабільність отриманих результатів методом розеткоутворення залежить від ряду умов: використання силіконових або пластикових пробірок, стандартних реактивів, точного дотримання умов постановки реакції, обережного перемішування, дотримання вказаної температури та часу інкубації, а також швидкості центрифугування.

Для визначення кількості лімфоцитів та їх популяцій широко використовують імунофлуоресцентний метод, результати якого можна оцінювати за допомогою мікроскопа (візуально), або проточного цитофлуориметра /22/.

Принцип ІФМ пов'язаний з утворенням специфічного сполучення антитіл з мембранними антигенами живих клітин, які є в суспензії.

В прямих методах ІФМ використовують специфічні до клітинних антигенів антитіла, які кон'юговані з флуоресцентною міткою. В непрямих методах ІФМ використовують спочатку немічені антитіла до клітинних антигенів, а потім мічені флуорохромом антитіла до імуноглобулінів. Непрямі методи чутливіші, ніж прямі.

Для того, щоб запобігти кеппінгу та шедингу (злущування) антигенів після взаємодії з антитілами до суспензії додають 0,2% розчин азиду натрію.

Дослідження проводять на лімфоцитах периферичної крові або клітинах лімфоїдних органів. Лімфоцити крові та клітини лімфоїдних органів вилучають загальноприйнятими методами /23/.

В рутинних токсикологічних дослідження рекомендується використовувати цитохімічні методи визначення кількості Т-, В- і "нульових" лімфоцитів, та популяцій Т-лімфоцитів за допомогою методів, наведених нижче.

4.2.4. Визначення активності кислої фосфатази методом азосполучення /24/

Кисла фосфатаза локалізується в лізосомах, переважно в нейтрофілах і лімфоцитах крові. Підвищення фермента у лімфоцитах спостерігається при сенсибілізації й алергічних захворюваннях. Даний метод дає можливість визначити не тільки активність фермента, але дозволяє судити про функціональний стан лізосомального апарата в лейкоцитах і проникливість мембран, й провести ідентифікацію Т-, В- і "нульових" лімфоцитів.

Кисла фосфатаза розщеплює нафтол-фосфат, при цьому утворюється вільний альфа-нафтол, який вступає в реакцію азосполучення з солями діазонію або парарозаніліном при рН 5,2. В результаті утворюються яскраво-червоні гранули або дифузне забарвлення в лімфоцитах та нейрофілах.

1. 10% розчин нейтрального формаліну.

2. Нафтол-AS-Bi-фосфат або нафтол-AS-MX-фосфат.

3. Диметилформамід.

4. 0,1 М розчин оцтовокислого натрію (1,36 г оцтовокислого натрію на 100 мл дистильованої води).

5. 2 М розчин соляної кислоти (20,64 мл концентрованої соляної кислоти додають до 79,36 мл дистильованої води).

6. Реактив парарозаніліну (4% розчин фуксину або фуксинсірчанистої кислоти в гарячому 2 М розчині соляної кислоти).

7. 4% водний розчин азотнокислого натрію.

8. 1% розчин метиленового зеленого. Фарба Романовського-Гімзе або 1% розчин метиленового синього.

9. Інкубаційне середовище готують перед застосуванням таким чином:

Готують розчин А (20 мг нафтол-AS-Bi-фосфату або нафтол-AS-MX-фосфату розчиняють в 0,5 мл диметилформаміда та 40 мл 0,1 М розчину оцтовокислого натрію). Розчин Б (діазотований парарозанілін) готують змішуванням 8 крапель парарозаніліна і 8 крапель 4% розчину азотнокислого натрію.

Розчин А змішують з розчином Б, фільтрують. рН розчину повинен бути в межах 5,2-5,4. При рН більше 5,4 розчин можна підкислити декількома краплями 1 М розчину соляної кислоти.

Мазки крові висушують на повітрі та фіксують в парах 10% розчину нейтрального формаліну 3 хв. Промивають у проточній воді, висушують. Сухі мазки крові розміщують в інкубаційному середовищі і витримують в термостаті при 37 град. С протягом 3-х годин. Потім мазки промивають в дистильованій воді. Ядра клітин дофарбовують одним з фарбників ядер (реактив N 8). Після дофарбування ядер мазки промивають дистильованою водою і висушують.

Активність ферменту виявляється у вигляді яскраво-червоних гранул або дифузного забарвлення в нейтрофілах і лімфоцитах. Облік реакції проводять за формулою Астальді і Верга:

цифри - ступінь інтенсивності реакції,

букви - число клітин з тією чи іншою інтенсивністю забарвлення,

100 - число підрахованих клітин.

В цих же мазках проводять цитохімічну ідентифікацію Т-, В- та "нульових" лімфоцитів. При цьому виділяють 3 типи реакції в лімфоцитах:

1. Відсутність продукту реакції на кислу фосфатазу (ферментонегативні клітини або В-лімфоцити);

2. Поодинокі (1-4, рідше більше) яскраві, чітко окреслені, великі або середніх розмірів гранули (Т-лімфоцити);

3. Множинні, дрібні, нечітко окреслені гранули, часто на фоні дифузного забарвлення ("нульові" лімфоцити).

Визначення типів реакції проводять в 100 лімфоцитах. Результати виражають у відсотках або абсолютних величинах (Г/л).

Абсолютну кількість Т-, В- і "нульових" лімфоцитів можна розрахувати за формулою:

В - процент усіх лімфоцитів;

С - процент популяцій лімфоцитів (Т-, В- або "нульових");

0,001 - коефіцієнт перерахунку в Г/л.

4.2.5. Визначення активності кислої неспецифічної естерази /25/

Фермент кисла неспецифічна естераза локалізується головним чином у лізосомах лімфоцитів і гідролізує ефіри карбонових кислот. Метод дозволяє за інтенсивністю і характером реакції ідентифікувати субпопуляції Т-лімфоцитів: Т-хелпери і Т-супресори.

Із сполуки альфа-нафтилацетату при кислому рН під впливом кислої неспецифічної естерази утворюється вільний нафтол, який дає кольорове забарвлення з парарозаніліном.

1. 10% розчин нейтрального формаліну.

2. Альфа-нафтилацетат натрію.

3. Ацетон х.ч.

4. 4% водний розчин нітриту натрію (готують перед використанням).

5. 4% розчин парарозаніліну (фуксин для фуксинсірчанистої кислоти на 1 М розчині соляної кислоти).

6. 0,067 М фосфатний буфер (9,51 г натрію фосфорнокислого двозаміщеного та 7,035 г натрію фосфорнокислого однозаміщеного розчинити в дистильованій воді і довести об'єм до 1 л).

7. 2 М розчин їдкого натру.

8. Інкубаційне середовище (готують перед застосуванням):

Розчин А: 10 мг альфа-нафтил ацетату натрію розчиняють у декількох краплях ацетону і змішують з 40 мл 0,067 М фосфатного буферу.

Розчин Б: 1 мл 4% розчину нітриту натрію змішують з 1 мл 4% розчину парарозаніліну (проводять гексазотування у пробірці).

Розчини А та Б зливають, фільтрують та доводять рН інкубаційного середовища до 5,8 за допомогою 2 М розчину їдкого натру.

10. 1% розчин метиленового зеленого.

Свіжовиготовлені і висушені на повітрі мазки крові, або відбитки тимуса і селезінки фіксують в парах 10% розчину нейтрального формаліну 3 хв. Зафіксовані мазки інкубують при кімнатній температурі в інкубаційному середовищі (N 8) впродовж 5 годин. Після інкубації мазки промивають дистильованою водою і фарбують 1% розчином метиленового зеленого.

Активність кислої неспецифічної естерази виявляється тільки в лімфоцитах у вигляді гранул.

Локалізована великогранулярна реакція - Т-лімфоцити супресори; реакція слабка, дифузна, дрібногранулярна - Т-хелпери. Визначення реакції проводять в 100 лімфоцитах. Результати реакції виражають у процентах або в абсолютних величинах (Г/л). Розрахунок проводять за формулою:

А - кількість Т-лімфоцитів в Г/л,

В - процент Т-хелперів або Т-супресорів,

100 - кількість підрахованих лімфоцитів.

4.2.6. Реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ) під впливом Т- та В-клітинних мітогенів /20, 26, 27/.

Метод грунтується на здатності лімфоцитів до диференційного клітинного ділення під впливом антигенного стимулу in vitro. Інтенсивність реакції визначають за кількістю бластних форм клітин, які діляться в культурі.

1. Гепарин сухий без консерванта ("Спофа", Чехія)

2. Сироватка без консерванта (великої рогатої худоби або ембріональна теляча)

3. Середовище Ігла з глютаміном

4. Стандартні мітогени (ФГА, КонА, ЛПС та інші)

5. Пеніцилін, стрептоміцин

6. Метанол

7. Льодяна оцтова кислота

8. Фарба Романовського

Стерильно готують культуральне середовище, яке містить 80 мл середовища Ігла, 20 мл сироватки, 200 ЕД/мл пеніциліна і 100 ЕД/мл стрептоміцина. Середовище ділять на 2 рівні частини. До одної з них додають мітоген (20 мкг мітогену на 1 мл середовища), друга потрібна для контролю.

В стерильні дослідні пробірки асептично розливають по 4 мл середовища з мітогеном, в контрольні - по 4 мл середовища, яке не містить мітоген. В умовах асептики стерильною піпеткою, змоченою розчином гепарину (500 ЕД/мл або 1 г сухого перпарата на 6 мл дистильованої води) беруть кров і вносять по 0,2 мл в контрольну і дослідну пробірки. Культуру витримують 72 години в термостаті при 37 град. С (бажано в атмосфері 5% СО2).

Після 72-годинної культивації надосадову рідину видаляють, осад гомогенізують, вносять 5 мл фіксатора (3 частини метанола + 1 частина льодяної оцтової кислоти). Через 10 хвилин вміст пробірок переносять в центрифужні пробірки і центрифугують 15 хвилин при 1000 об/хв. Фіксатор видаляють, осад переносять на предметне скло, роблять мазок. Мазок висушують на повітрі, а потім фарбують (1 частину фарби змішують з 10 частинами дистильованої води) по Романовському протягом 40 хвилин. Потім промивають проточною водою.

Підраховують в мазку не менше 200 лімфоїдних клітин. Визначають відсоток бластних та перехідних до них форм (клітини діаметром 8-14 мкм), враховують також кількість мітозів.

У пробах без мітогену відсоток бластоутворення не перевищує 5%. Статистично вірогідне збільшення відсотка бласт-трансформації в контрольних пробах тварин, які отримували ксенобіотик, в порівнянні з інтактними тваринами, свідчить про мітогенні властивості ксенобіотика.

У дорослої людини через 72 год. після інкубації з ФГА 70-90% лімпоцитів трансформуються в бласти. У дітей до 1 року та у людей похилого віку кількість трансформованих лімфоцитів знижується до 50-60%.

1. Сироватки ембріонів корів

2. Середовище RPMI-1640

3. HEPES 4. 2-меркаптоетанол

5. Стандартні мітогени (ФГА, КонА, ЛПС )

6. 3H-тимідин

7. Фарба по Романовському-Гімзе

Для постановки РБТЛ під впливом мітогенів in vitro стерильно виділяють спленоцити. Спленоцити у концентрації 2х(10 в 6-му ступені)/мл культивують у середовищі RPMI-1640, яке містить 10% інактивованої сироватки ембріонів корів, 10 мМ 2-меркаптоетанолу, 20 мМ HEPES, ФГА (10 мкг/мл), або Кон-А (5 мкг/мл), або ЛПС (50-100 мкг/мл). Культуру інкубують 72 год при 37 град. С. За 4 год до закінчення інкубації до кожної проби вносять по 1 мкКюри 3H-тимідину. Підготовку проб для виміру рівня радіоактивності проводять за загальноприйнятою методикою. Результати подають у вигляді СРМ (кількість імпульсів за 1 хв на 10 в 6-му ступені клітин) або індексу стимуляції (відношення кількості імпульсів в досліді до кількості імпульсів у контролі) /19/.

Для визначення функціональної активності Т-клітин можна також використовувати РБТЛ у постановці за методом U.Junge et a1. /27/, за яким реєстрація результатів реакції проводиться візуально під мікроскопом. Для цього клітини інкубують, як і у першому випадку. Потім роблять мазки клітин на предметних скельцях, підсушують, фіксують 10 хв метиловим або абсолютним етиловим спиртом, фарбують за методом Романовського-Гімзе. Під мікроскопом (при збільшенні 7х10, 8х90) визначають відсоток нестимульованих, стимульованих та типових бластних форм лімфоцитів, підраховуючи 200-500 клітин лімфоїдного ряду.

4.3. Гуморальні реакції (гуморальний імунітет)

4.3.1. Визначення титру гетерофільних аглютинінів /26/

Гетерофільні аглютиніни відносяться до нормальних антитіл і є одним із факторів захисту організму - первинного, неспецифічного імунітету. Утворюються ці антитіла в результаті спонтанної імунізації антигенами, які широко розповсюджені у природі. Кількість гетерофільних аглютинінів визначають за допомогою реакції Пауля-Буннеля.

Реакція аглютинації базується на здатності антитіл (аглютинінів), що знаходяться в сироватці крові зклеювати у фізіологічному розчині еритроцити барана.

1. Фізіологічний розчин натрію хлориду

2. Еритроцити барана

Кров збирають у сухі пробірки, відстоюють протягом 15 хв. при температурі 37 град. С. Центрифугують при 3000 об/хв 10 хвилин. Сироватку вібирають у чисті пробірки.

0,25 мл сироватки, після інактивації на водяній бані при температурі 56 град. С протягом 30 хв, розводять таким чином: 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128.

До кожного розведення додають по 0,5 мл 3% суспензії еритроцитів барана. Після цього пробірки з розведеннями вміщують на 2 години в термостат при 37 град. С, а потім на 24 год. в холодильник. Визначеним титром вважають те розведення, при якому ще спостерігається аглютинація еритроцитів.

В нормі у здорових дорослих людей кількість гетерофільних аглютинінів зустрічається в середньому у розведенні сироватки 1:16, з коливаннями титру від 1:8 до 1:32. У лабораторних тварин титри гетерофільних аглютинінів нижчі, чим у людини - від 1:2 до 1:8.

4.3.2. Визначення титру гемаглютинінів і гемолізинів /28, 29/

Для визначення імуномоделюючої дії препарату проводять дослідження гемаглютинінів і гемолізинів після імунізації тварин еритроцитами барана або бактеріальним антигеном.

Досліди проводять на нелінійних мишах або мишах ліній СВА, С57ВL, ВАLВ/с з масою тіла 18-22 г. Імунізацію проводять оптимальною дозою антигену (еритроцити барана відмивають фізіологічним розчином і готують 3% завись) внутрішньочеревинно одноразово в об'ємі 0,2 мл/20 г маси.

Дослідний препарат вводять тваринам у 2-3 дозах (токсичній, пороговій і недіючій за загальнотоксичними показниками) одночасно з імунізацією. На 4-7-й день після імунізації у дослідних тварин збирають кров з орбітального синусу, центрифугують (10 хв, 1500 об./хв) і готують сироватку крові.

Реакція аглютинації базується на здатності антитіл (аглютининів), які знаходяться в сироватці крові імунізованих тварин, склеювати у фізіологічному розчині еритроцити барана.

а) Визначення титру гемаглютинінів /28/

1. Фізіологічний розчин хлориду натрію 2. Еритроцити барана

Для того, щоб уникнути імунного гемолізу, сироватку крові декомплементують підігріванням 30 хв при 56 град. С. Потім готують ряд послідовних розведень (1:10, 1:20, 1:40, 1:80 і т.д.) у пластикових панелях в об'ємі 0,2 мл і додають 0,1 мл 1% зависі еритроцитів барана та залишають при кімнатній температурі.

Оцінку реакції проводять через 2-4 год. При позитивній реакції еритроцити, що аглютинували, вистеляють дно лунки рівномірним шаром (мають вигляд парасольки). При негативній реакції усі еритроцити збираються разом і утворюють компактне суцільне коло з рівноокресленими краями. Результати реакції виражають титром антитіл - величиною, зворотньою останньому розведенню сироватки, яка ще аглютинує еритроцити.

Зниження титрів аглютинінів у сироватці дослідних тварин свідчить про пригнічуючу дію препарату на гуморальну ланку імунної відповіді, підвищення титру - про стимулюючу дію.

В нормі в середньому log2 титру аглютинінів у мишей лінії СВА на 7-й день після імунізації оптимальною дозою еритроцитів барана становить 8,9+-0,1, на 15 день - 9,4+-0,2; у мишей лінії C57BL - 7,2+-0,2, на 15 день - 7,7+-0,2 /16/.

б) Визначення титру гемолізинів /29/ Реагенти 1. Фізіологічний розчин хлориду натрію 2. Еритроцити барана 3. Комплемент морської свинки Хід реакції

Сироватку тварин, як і при визначенні гемаглютинінів, декомплементують шляхом нагрівання 30 хв при 56 град. С. Потім готують ряд послідовних розведень (1:10, 1:20, 1:40, 1:80 і т.д.) у пластикових панелях в об'ємі 0,2 мл, додають 0,1 мл 1% зависі еритроцитів барана і 30 хв інкубують при 37 град. С. До суміші додають комплемент морської свинки, який розводять фізіологічним розчином 1:10. Суміш перемішують і інкубують при 37 град. С 1 год.

Найбільше розведення сироватки, яке спричиняє гемоліз еритроцитів, визначається як титр гемолізинів.

4.3.3. Виявлення кількості антитілоутворюючих клітин (АУК) в селезінці (метод Єрне і Нордіна) /19, 30/

Метод базується на здатості антиеритроцитарних антитіл (гемолізинів), які секретуються антитілоутворюючими клітинами імунізованих тварин, лізувати в присутності комплемента еритроцити барана, поміщені разом з клітинами селезінки в агарозний або агаровий гель.

При використанні агара Дифко необхідно видалити домішки промиванням. Для цього 7 г сухого агара вносять в колбу, додають 0,5 л дистильованої води і розплавляють агар на кип'ячій бані до просвітління розчину. Агар виливають у лотки (товщина шару - 0,5 см), охолоджують, розрізають на кубики (0,5х2 см), поміщають в ексикатор і заливають дистильованою водою. Відмивають впродовж 10 днів, змінюючи воду 2-3 рази в день.

В день дослідження готують 0,7% розчин із промитого і попередньо розплавленого агара (до 10 мл розплавленого агара додають 8 мл дистильованої води, 2 мл десятикратного розчину Хенкса і 2 краплі 7,5% розчину карбоната натрію (рН 7,0-7,2)). Розчин агара розливають по 2 мл в пробірки і ставлять у водяну баню (45 град. С).

Перед застосуванням еритроцити барана тричі відмивають в ізотонічному розчині хлориду натрію (центрифугують при 3000 об/хв протягом 5 хв). Із осаду готують 20% суспензію еритроцитів.

За 4-5 днів до постановки експерименту проводять імунізацію мишей (лінії СВА, C57BL) еритроцитами барана внутрішньочеревинно, одноразово в оптимальній дозі 10 в 8-му ступені в 0,2 мл ізотонічного розчину хлориду натрію. Препарат вводять в різних дозах разом з антигеном.

Тварин усипляють ефірним наркозом. Видаляють селезінку, готують гомогенат за допомогою гемогенізатора у 5 мл середовища 199. Суспензію клітин фільтрують через капроновий фільтр. Визначають число ядровміщуючих клітин в 1 мл суспензії і у всій селезінці.

В пробірки з агаром, що знаходяться на водяній бані (45 град. С) додають 20% суспензії еритроцитів барана із розрахунку 0,027 мл суспензії на 1 мл розчину. Ретельно перемішують і суміш розливають в пробірки по 2,25 мл, які попередньо розміщують у водяній бані при 45 град. С. Інкубують не більше 20-30 хв. Потім в пробірки добавляють 0,1 мл спленоцитів, обережно перемішують, щоб уникнути пухирців повітря і швидко виливають у теплі (37 град. С) чашки Петрі рівномірним шаром. Витримують 10-15 хв. при кімнатній температурі, потім ставлять в термостат при 37 град. С на 60-90 хв. Після інкубації в кожну чашку вносять по 3 мл комплемента морської свинки. Сухий комплемент розводять ізотонічним розчином хлориду натрію до 1:4, свіжозаморожений - до 1:10, розподіляючи по всій поверхні агара і клітин, інкубують чашки в термостаті при 37 град. С ще 30-40 хв. Після інкубації комплемент зливають.

Визначають кількість макроскопічних зон гемолізу еритроцитів навколо окремих АУК і підраховують число продуцентів антитіл в розрахунку на певну кількість клітин (наприклад - 10 в 6-му ступені) або цілий орган.

У нормі середнє число АУК в селезінці мишей СВА на 5 добу після імунізації еритроцитами барана складає 160,0+-7,0 з розрахунку на 10 в 6-му ступені спленоцитів, мишей C57BL - 72,0+-4,0.

4.3.4. Визначення концентрації імуноглобулінів класів IgG, IgA, IgM у сироватці крові (за методом Mancini) /26, 31/

Концентрацію різних класів імуноглобулінів у сироватці крові визначають методом радіальної імунодифузії в гелі.

Імуноглобуліни дифундують в агар, який містить специфічну сироватку і утворюють кільце преципітації, ширина якого прямопропорційна кількості імуноглобулінів.

1. Агар Дифко

2. Моноспецифічні антисироватки до імуноглобулінів IgG, IgA,

IgM

Агар відмивають від домішок (див. п. 4.3.3). В цукровій склянці змішують агар з відповідною антисироваткою в співвідношенні 3:1 при 55-56 град. С. Швидко виливають агар на пластинки рівним шаром, охолоджують. В шарі агару пробойником вирізують лунки діаметром 2 мм, який містить відповідну моноспецифічну антисироватку. В кожну лунку вносять по 5 мкл досліджуваної сироватки. В перші 3 лунки вносять стандарти також по 5 мкл у зростаючій концентрації. Пластинку кладуть в ексикатор (волога камера) в горизонтальному положенні на 24-48 годин при 4 град. С або при кімнатній температурі (для IgG, IgA - 24 год., для IgM - 48 год.) після чого вимірюють діаметр кілець преципітації.

Рівень імуноглобулінів визначають за калібрувальною кривою, яка виражає залежність між рівнем імуноглобулінів та діаметром кілець преципітації.

Підрахунок проводять за формулою І.І.Жури /32/.

4.3.5. Скринінг-тест для оцінки патогенних властивостей циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) /33/

Метод грунтується на властивості різних за розміром ЦІК вибірково преципітиюватися 3% або 4% розчином поліетиленгліколя (ПЕГ). Непрямим показником розміру ЦІК є коефіціент "К" - співвідношення концентрацій ЦІК, які осаджує 4% розчин ПЕГ, до концентрації ЦІК, які осаджує 3% розчин.

1. 0,1 М боратний буфер, рН=8,4

2. 10% розчин поліетиленглюколю (ПЕГ М.м. 6000) в 0,1 М боратному буфері, рН 8,4.

3. 0,1 М розчин їдкого натру

0,1 М боратний буфер, рН=8,4 готують змішуванням 4,5 об'ємів 0,05 М розчину бури (Na2B4O7.10H2O - 19,0 г/л) з 5,5 об'ємами 0,2 М розчину борної кислоти (H3BO3 - 12,37 г/л).

Кров збирають у сухі пробірки, відстоюють протягом 15 хв. при температурі 37 град. С. Центрифугують при 3000 об/хв 10 хвилин. Сироватку відбирають у чисті пробірки.

Сироватку крові розливають по 0,2 мл у дві пробірки (N 1, N 2). Потім у пробірку N 1 приливають 3,3 мл боратного буфера і 1,5 мл розчину ПЕГ, а у пробірку N 2 приливають 2,8 мл боратного буфера і 2 мл розчину ПЕГ (кінцева концентрація ПЕГ у пробірці N 1 - 3%, N 2 - 4%). Вміст пробірок ретельно перемішують і вміщують пробірки в холодильник при +4 град. С на 16 годин. Після інкубації пробірки центрифугують при 2000 g та +4 град. С протягом 20 хвилин. Видаляють супернатант, до осаду приливають 2,0 мл розчину NaOH та спектрофотометрують при довжині хвилі 280 нм.

Кількість ЦІК виражають величиною оптичної густини досліджуваних розчинів. Визначивши рівень ЦІК при 2-х концентраціях ПЕГ вираховують їх співвідношення - коефіціент "К":

Е - величина оптичної густини при концентрації ПЕГ 3%,

Е - величина оптичної густини при концентрації ПЕГ 4%.

При "К"<1,1 - ЦІК вважають великими, при "К">1,5 - малими, а при 1,1<"К"<1,5 - ЦІК вважають середніми за молекулярною масою.

4.4. Інші показники стану імунної системи

4.4.1. Визначення маси та клітинності лімфоїдних органів

Лімфоїдні органи (селезінку і тимус) виділяють після завершення введення препарату, зважують і визначають коефіцієнт маси лімфоїдних органів (КМ) за формулою:

Для визначення клітинності роблять певну наважку того чи іншого лімфоїдного органу і гомогенізують у 3% розчині оцтової кислоти. Після гомогенізації тканини органу підраховують кількість каріоцитів у камері Горяєва (млн/1 мг тканини).

Клітини кісткового мозку отримують з кісток стегна мишей чи щурів. Вилучають кістки стегна, відокремлюють їх від м'яких тканин, ножицями зрізають епіфізи. Кістковий мозок вимивають шприцем з тонкими голками для внутрішньошкірних ін'єкцій. Клітинну завись пропускають крізь голки різного діаметру. Підраховують кількість клітин у камері Горяєва, визначають їх кількість в зависі та загальний вміст у вилученій тканині.

4.4.2. Морфологічні дослідження

При вивченні імунотоксичної дії пестицидів в субхронічних та хронічних експериментах проводять морфологічні дослідження лімфоїдних органів (селезінки, тимуса, лімфатичних вузлів) з використанням гістологічних, гістохімічних та імуногістохімічних методів.

Важливим є також дослідження морфологічних змін лімфоїдних органів в дослідах на антигенну стимуляцію (еритроцитами барана). Для контролю використовують тварин без імунізації та на тлі імунізації антигеном. В останньому випадку морфологічні дослідження проводять на 7-й день після імунізації еритроцитами барана.

Спочатку визначають абсолютну та відносну масу лімфоїдних органів, як вказано в п. 4.4.1. Після цього (для приготування парафінових зрізів) шматочки органів фіксують у 10% розчині нейтрального формаліну та рідині Карнуа. Для приготування напівтонких та ультратонких зрізів фіксацію проводять у 2,5% розчині глутаральдегіду і вподальшому проби занурюють в аралдитепон /34, 35/.

Обробку експериментального матеріалу проводять у відповідності з загальноприйнятими методами в гістології.

При морфологічному дослідженні увагу звертають на розмір органів, збереженість їх структури, розподіл клітинних популяцій. У лімфовузлах підраховують кількість та визначають розмір гермінативних центрів, інтенсивність забарвлення Т-залежних ділянок.

Для дослідження морфології органів забарвлення парафінових зрізів проводять гематоксиліном та еозином, а аралдитепонових напівтонких зрізів толуїдиновим блакитним /35, 36/. Ультратонкі зрізи досліджують за допомогою електронної мікроскопії, що дозволяє виявити ультраструктурні зміни на субклітинному рівні.

При морфологічних дослідженнях лімфоїдних органів також широко застосовують гістохімічні методи, які дозволяють виявити ДНК та РНК у лімфобластних та плазматичних клітинах, активність ряду ферментів (естерази, фосфатази), що дає можливість виявити порушення в розподілі клітинних популяцій /35, 37/. Використовують також складніші імуноморфологічні, імунофлуоресцентні і імуноферментні методи з використанням моноклональних антитіл та мічених антигенів для детального аналізу розподілу клітин в лімфоїдних органах /38/.

1. Петров Р.В. Иммунология / Издание второе стереотипное. - М.: Медицина. - 1987. - 415 с.

2. Бабаева А.Г. Традиционные и нетрадиционные представления о роли системы иммуногенеза в организме // Вестник АМН СССР. - 1986. - N 1. - С. 22-28.

3. Вершигора А.Е. Основы иммунологии. - Киев: Вища школа. - 1980. - С. 227-241.

4. Алексеева О.Г., Дуева Л.А. Аллергия к промышленным химическим соединениям. - М. - Медицина. - 1978. - 272 с.

5. Дуева Л.А., Коган В.Ю., Суворов С.В., Штеренгарц Р.Я. Промышленные аллергены. М. - Центр международных проектов госкомприроды СССР 1989 - 203 с.

6. Определение состояния иммунологической реактивности организма при воздействии факторов окружающей среды / Методические рекомендации. - Киев. - 1976.

7. Методы лабораторной специфической диагностики профессиональных аллергических заболеваний химической этиологии. Методические рекомендации. - М. - 1980.

8. Методические указания к постановке исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздушной среде рабочей зоны и атмосферы. - М. - 1991.

9. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А. Проблемы нормы в токсикологии (современные представления и методические подходы, основные параметры и константы) / Под ред. И.М.Трахтенберга. Издание 2 перераб. и дополн. - М. - Медицина. - 1999. - 204 с.

10. Биохимические, иммунологические и биофизические методы в токсикологическом эксперименте (Методическое руководство). - Киев. - МЗ СССР, ВНИИГИНТОКС. - 1989. - 184 с.

11. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. В.В.Меньшикова. -М. - Медицина. - 1982. - 576 с.

12. Методические рекомендации. - Новосибирск. - 1980.- 15 с.

13. Stelzner A. Иммунологические методы. - М. - Медицина.- 1987. - с.

14. Бумагина Т.К., Шмелев Е.И. // Лаб. дело. - 1981. - N 4.- С. 200-202.

15. Киндзельский Л.П., Бутенко А.К., Афанасьева В.В. и др. // Вопросы онкологии. - 1986. - N 6.- С. 86-87.

16. Goodman H.S. A general method for quantitation of immune cytolys // Nature. - 1961.- V. 190. - P. 269-272.

17. Зейфарт М. Титрование комплемента // Иммунологические методы / Перевод с немец., под ред. Г.Фримеля. - М. - Мир. - 1979. - С. 133-135.

18. Функциональная диагностика в урологии и нефрологии /Киев Здоров'я 1977 - С. 83-85/.

19. Иммунология: Практикум / Е.У.Пастер, В.О.Овод, В.Н.Позур, Н.Е.Вихоть. - К. - Вища школа. - Изд-во при Киев. ун-те. - 1989. - 304 с.

20. Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля. - М. - Мир. - 1987. - 472 с.

21. Тесепов В. Реакция "трансплантат против хозяина" на мышах гибридах первого поколения /Иммунологические методы/ Под ред. Г.Фримеля - М - Мир - 1979 - С. 182-187.

22. Иммунологические методы исследования / Под ред. И.Лефковитса, Б.Перниса. - М. - Мир. - 1988. - 528 с.

23. Лимфоциты. Методы / Под ред. Дж. Клауса; пер. с англ.- М. - Медицина - 1990 - 395 с.

24. Кисляк Н.С., Ленская Р.В. Клетки крови у детей в норме и патологии. - М. - Медицина. - 1978.- 176 с.

25. Mueller J.et.all. // Europ.J.Immunol.- 1975.- V.5.- N 4.- P. 270 - 274.

26. Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С. Иммунологические исследования в клинике. - Киев. - Здоров'я. - 1978. - 160 с.

27. Junge U., Hoekstra V., Wolfe L., Dienhardt F. Microtechnique for quantitative evaluation of in vitro lymphocyte transformation // Clin. Exp. Inununol. - 1970. - V.7. - N 3. - Р. 431-437.

28. Мальберг К. Реакция гемагглютинации // Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля. - М. - Мир. - 1987 - 472 с.

29. McGregor D.D., Gowas J.I. The antibody response of rats depleted of lympho-cytes by chronic drainage from the thoracic duct // J. Exp. Med. - 1963. -V.118. - N 2.- P. 303-320.

30. Jerne N.K., Nordin A.A., Henry C. Cell - bound antibodies.- Wistar Institute Press.- 1963.- 109 p.

31. Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств. Издание официальное. М. - 1984. - 37 с.

32. Жура И.И., Охримович Л.М., Михайлишин М.С., Бакалюк О.И. Применение математического анализа при количественном определении иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии // Лаб. дело. - 1985. - N 2. - С. 123-124.

33. П.В.Стручков, Н.А.Константинова, В.В.Лаврентьев, А.Г.Чугалин // Лаб. дело. - 1985. - N 7. - С. 410-412.

34. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - Л. - 1969. - 422 с.

35. Пирс Е. Гистохимия теоретическая и прикладная. Пер. 2 англ. изд. М. - 1962. - 962 с.

36. Immunotoxicology and immunopharmacology. Editors J.H.Dean, M.J. Luster, A.E.Munson HarryAmos.- 1985 by Raven Press Books, 1185 Avenue of the Amerias, New York- 551 p.

37. Гайер Г. Электронная гистохимия / Пер. с нем. И.Б.Бухвалова под ред. и с предисловием проф. Н.Т.Райхлина. - М. - 1974. - 488 с.

38. Diagnostic Immunopathology. 2nd Ed. // Eds R.B.Colvin, A.K.Bhan, R.T.McCluskey - New York. - 1995. - 820 p.