Про організацію лабораторної діагностики сифілісу в Україні

Потім у ряд інших пробірок відмірюють по 0,5 мл раніше приготовлених розведень гемолітичної сироватки, починаючи з 1:1000, додають по 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду і 0,5 мл комплементу (комплемент у розведенні 1:10), а також 0.5 мл 3 % суспензії еритроцитів барана (табл. N 2), пробірки ставлять у термостат лри температурі 37 град. С на 1-у годину, періодично струшуючи.

Титром гемолітичної сироватки є найвище її розведення, що дало повний розчин 5 мл, 3% зависі еритроцитів барана у присутності комплементу. В даному випадку титр гемолітичної сироватки 1:1 (табл. N 2).

Для основного досліду І титрації інгредієнтів беруть розведення, підсилене проти одержаного титру втричі (потрійний титр). У даному прикладі 1:500 (0,1 на 50).

Кров беруть у барана шляхом пункції яремної вени не частіше 1-го разу за 10 днів, у кількості не більше 200 мл. Баран має бути у віці від 1-го до 5-ти років. Кров беруть у стерильну банку зі скляним намистом, яку струшують протягом 5-10 хв., потім кров фільтрують через подвійний шар марлі (відокремлюють згустки ниток фібріну, що утворилися).

Перед постановкою реакції еритроцити барана триразове відмивають ізотонічним розчином натрію хлориду шляхом центрифугування. Центрифугують 10 хв. при 1,5 тис. об/хв. Остання порція промивної рідини повинна бути безбарвною, надосадову рідину зливають; при наявності гемолізу еритроцити барана непридатні до вживання.

З щільного осаду еритроцитів готують 3 %, завись еритроцитів у ізотонічному розчину натрію хлориду (на 3 мл щільного осаду еритроцитів додають 97 мл ізотонічного розчину натрію хлориду).

Дефібриновану кров зберігають протягом 5-7 днів у холодильнику при температурі +4, +8 град. С.

Нерозведена дефібринована не відмита кров барана зберігається довше, ніж відмиті еритроцити.

Для збереження на значно довші строки рекомендують консервувати дефібриновану кров барана по методу Мигуліної. До 100 мл дефібринованої крові барана додають 15 мл суміші, приготованої за таким прописом: глюкози - 6,0 г, борної кислоти - 4,5 г. 100 мл ізотонічного розчину натрій хлориду; приготовлену суміш кип'ятять на водяній бані 3-й дні підряд по 20 хв. Консервована кров барана по методу Мигуліної придатна для використання протягом 3-4 тижнів. Перед постановкою реакції при використанні консервованої крові еритроцити необхідно відмивати ізотонічним розчином натрію хлориду.

Застосовують суміш сироваток крові, одержаної пункцією серця у 5-10 здорових морських свинок. Кров для кращого зсідання ставлять у термостат при температурі 37 град. С на 30 хв. Після утворення згустка, останній відділяють від стінок пробірки, яку вміщують у холодильник при температурі 4 град. С до наступного дня. Одержану прозору сироватку зливають і використовують як комплемент. Активність цього комплементу при зберіганні у холодильнику при температурі 4 град.С не змінюється протягом 1-2 діб.

Під час консервування сухої борної кислоти і сірчанокислотним натрієм комплемент зберігається у холодильнику при температурі 4 град. С 1-2 місяці (4,0 борної кислоти +5,0 г сірчанокислотного натрію на 100 мл комплементу).

Може бути використаний ліофільно висушений комплемент. Сухий комплемент випускають у ампулах по 1 мл. Розчинення сухого комплементу проводять у день постановки реакції ізотонічним розчином натрій хлориду при легкому струшуванні. В ампулу з сухим комплементом додають 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Потрібна для постановки реакції кількість комплементу змішують з кількох ампул єдиної серії.

Безпосередньо перед постановкою реакції Вассермана проводять титрування комплементу в присутності всіх інгредієнтів, що беруть участь у досліді.

Комплемент титрують обов'язково: а) у чистому вигляді (без антигенів), тобто у присутності лише гемолітичної системи і б) з усіма антигенами, що входять у дослід. Титрування комплементу проводять також у присутності інактивованої негативної сироватки крові людини.

При титруванні комплементу інгредієнти розводять у такому порядку:

1. Розводять гемолітичну сироватку по потроєному титру в ізотонічному розчині натрію хлориду.

2. З щільного осаду еритроцитів готують 3% завись в ізотонічному розчині натрію хлориду.

3. Розливають 3% завись еритроцитів барана та ізотонічній розчин натрію хлориду в 5 контрольних пробірок і розведену по потроєному титру гемолітичну сироватку (в другий контроль) табл. N 3.

4. Готують гемолітичну систему: розчин гемолітичної сироватки, розведений і по потроєному титру, приливають до рівного об'єму 3 % зависі еритроцитів барана і швидко перемішують, переливаючи з однієї колби в іншу.

5. Розводять антигени ізотонічним розчином натрі хлориду по вказаному на етикетці титру.

6. Розводять свідомо негативну інактивовану сироватку крові людини в співвідношенні 1:5 (2 мл сироватки + 8 мл ізотонічного розчину натрію хлориду).

7. Розводять комплемент 1:10 (1 мл комплементу + 9 мл ізотнічного розчину натрію хлориду).

Титрування комплементу проводять в 33 пробірках, поставлених по 11 шт. у три ряди. Два ряди пробірок для титрування комплементу в присутності двох антигенів і третій ряд - для титрування комплементу без антигенів "per se". П'ять контрольних пробірок: дві для контролю антигенів і по одній - для контролю комплементу, гемолітичної сироватки і ізотонічного розчину натрію хлориду на гемотоксичність заповнюють до об'єднання розчин гемолітичної сироватки і зависі еритроцитів барана (табл. N 3).

Комплемент розведений 1:10, розливають у 10 пробірок першого ряду в дозах (0,1; 0,16; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44; 0,5; 0,56; 0,6). Загальний обсяг вмісту пробірок доводять до 1-го мл відповідними об'ємами ізотонічного розчину натрію хлориду: 0,9; 0,84; 0,8; 0,76; 0,7; 0,64; 0,6; 0,56; 0,5; 0,44; 0,4. Одержану в кожній пробірці суміш старанно перемішують і переносять по 0,25 мл а два рада пробірок, що стоять позаду. Потім в усі 33 пробірки розливають по 0,25 мл інактивованої негативної сироватки крові людини, розведеної ізотонічним розчином натрію хлориду 1:5. Далі в 11 пробірок першого ряду приливають по 0,25 мл розведеного по титру трепонемного антигену; розведений по титру кардіоліпіновий антиген приливають по 0,2 мл в 11 пробірок другого ряду; ізотонічний розчин натрію хлориду приливають по 0,25 мл в 11 пробірок третього ряду.

Штатив пробірок струшують і додають по 0,5 мл гемолітичної системи в третій рад пробірок (без антигена), штатив з пробірками знову струшують і ставлять на 45 хвилин у термостат при температурі 37 град. С. Після інкубації в термостаті в 22 пробірках першого і другого рядів добавляють по 0,5 мл гемолітичної системи. Зміст пробірок знову струшують і ставлять у термостат при температурі 37 град. С на 45 хвилин. Як мине 45 хвилин, визначають робочу дозу комплементу в присутності антигенів, до якого роблять надбавку в межах 15-30% (в середньому 20 %) в залежності від проходження гемолізу. Враховують також титр комплементу без антигенів "per se".

Титром комплементу є його найменша кількість, що сприяє повному гемолізу еритроцитів барана в присутності антигену і негативної сироватки людини.

У даному випадку титр комплементу буде 0,3, а робоча доза комплементу - 0,36, тобто 3,6 % (табл. N 4).

Принцип реакції: реагіни, що є у сироватці крові хворих на сифіліс, мають властивість вступати в з'єднання з кардіоліпіновим антигеном. Специфічні антитрепонемні антитіла вступають в з'єднання з специфічними антигенами (ультразвуковий трепонемний антиген).

Комплекси, що утворилися, сорбують комплемент, який вводять у реакцію. Індикація комплексів, що утворилися, досягається введенням гемолітичної системи гемолітична сироватка + еритроцити барана).

Примітка: -Г - затримка гемолізу, +Г - гемоліз.

ЯКІСНА РЕАКЦІЯ. У день постановки досліду проводять підготовчу роботу (зливання досліджуваних сироваток крові, її згусток, інактивація їх, відмивання еритроцитів барана від плазми, приготування ізотонічного розчину натрію хлориду).

Розводять інгредієнти: гемолітичну сироватку, еритроцити барана, антигени по титру, проводять титрування комплементу без антигенів для визначення його робочої дози.

Якісну реакцію (табл. N 5) для кожної досліджуваної сироватки крові проводять у трьох пробірках з двома антигенами. Водночас ставлять для контролю свідомо позитивну і слабопозитивну (4+, 2+) і негативну сироватку крові. Ковну досліджувану інактивовану сироватку крові, розведену 1:5 ізотонічним розчином натрій хлориду, розливають по 0,25 мл у три пробірки, з яких третя е контролем. До першої пробірки додають 0,25 мл трепонемного антигену, до другої - кардіоліпінового антигену, розведених по титру. До третьої (контрольної) - 0,25 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Комплемент, розведений по робочій дозі, додають по 0,25 мл в усі дослідні і контрольні пробірки. Попереднє змішування антигену і комплементу не рекомендують. Після первинної 45-хвилинної інкубації у термостаті при температурі 37 град. С додають в усі пробірки по 0,5 мл гемолітичної системи. Легким струшуванням змішують зміст пробірок і ставлять їх у термостат при температурі 37 град. С на 45-60 хвилин до настання гемолізу в контрольній пробірці. Реєструють результат реакції з антигенами гемолізу при наступі гемолізу в дослідних пробірках.

Результати реакції Вассермана оцінюють таким чином: повна або значна затримка гемолізу - +4, +3 позитивна реакція); часткова затримка гемолізу - +2 (слабопозитивна реакція); незначна затримка гемолізу - +1 - сумнівна реакція - -1, повний гемоліз - негативна реакція.

Оцінку результатів реєструють у книзі протоколів лабораторії хрестами, а результати видають словами - позитивний, слабопозитивний, сумнівний, негативний. Результат реакції слід давати по кожному антигену окремо. У випадку розходження результатів між антигенами необхідно проаналізувати правильність постановки реакції. При затримці гемолізу в контролі сироватки (третя пробірка, що не містить антигену), необхідне повторне дослідження з сироваткою, взятою з дотриманням правил забору крові, і при наступному антикомплементарному результаті (затримці гемолізу в контролі) необхідне розтитрування по схемі. Правильність протікання досліду оцінюють на основі результатів досліджуваних контролів:

а) контролю кожної сироватки крові - третій ряд пробірок (наявність гемолізу);

б) контролі досліду: свідомо негативної сироватки крові (гемоліз в усіх трьох пробірках); свідомо слабопозитивної сироватки (часткова затримка гемолізу [2+] в двох пробірках з антигенами і гемоліз у третій контрольній пробірці без антигена); свідомо позитивної сироватки - затримка гемолізу в двох пробірках з антигенами і гемоліз у третій пробірці (без антигенів).

Невірно вибрана доза комплементу (надлишок або нестача у досліді).

Неправильне зберігання досліджуваної сироватки крові.

Тривале зберігання досліджуваної сироватки крові.

Зберігання крові більше 24 годин на згусток.

Кожна сироватка, що дала затримку гемолізу на 4+, 3+ з кардіоліпіновим антигеном, в тій самій постановці досліду повинна бути досліджена кількісним методом (дослідження кількостей сироватки, що зменшується, при розведенні ізотонічним розчином хлориду натрію) для визначення титру реагинів (від 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640).

Кожну сироватку крові досліджують у 8 пробірках. У першу пробірку наливають 0,8 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, з другої по восьму пробірку - по 0,25 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. До першої пробірки вносять 0,2 мл досліджуваної сироватки крові, вміст змішують, потім 0,25 мл забирають, а по 0,25 мл з переносять до другої і восьмої пробірок. Після змішування переносять 0,25 мл з другої пробірки у третю, з третьої у четверту і т.д. до сьомої пробірки, з якої 0,25 мл розведеної сироватки крові вилучають. Потім приливають по 0,25 мл кардіоліпінового антигену, розведеного по титру з першої по сьому пробірки. Після легкого струшування в усі пробірки приливають по 0,25 мл комплементу, розведеного за робочою дозою. Первинна інкубація у термостаті при температурі 37 град. С триває 45 хвилин, після чого до всіх пробірок приливають по 0,5 мл гемолітичної системи. Струсивши пробірки, їх вміщують у термостат при температурі 37 град. С на 45-60 хвилин і після настання гемолізу у восьмій (контрольній) пробірці реєструють результати реакції.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ. Титром реагинів досліджуваної сироватки є розведення, яке дало повну затримку гемолізу -+4 або значну затримку гемолізу - +3.

В аналізах, які видає лабораторія, при наявності позитивної реакції вказують, з яким титром досліджуваної сироватки одержано позитивну реакцію. Наприклад: 1:10 - 4+, 1:20 - 4+, 1:40 - 4+, 1:80 - 4/3+, 1:160 - 2+ - відповідь сироватка позитивна у титрі 1:80.

Кількісне визначення реагинів має значення при оцінці ефективності протифілітичного лікування. Швидке зниження титру реагинів свідчить про успіх терапії. Титр реагинів, що довго не знижується, вказує на відсутність ефективності терапії і необхідність її зміни.

Принцип. У спинномозковій рідині хворого на сифіліс можуть бути антитіла. реагіни, здатні вступати в реакцію зв'язування комплементу з відповідними антигенами. Реакцій ставлять з непрогрітою спинномозковою рідиною через відсутність в ній комплементу. Каламутну або з домішкою крові рідину центрифугують зливають з осаду.

Спинномозкову рідину паралельно досліджують у трьох дозах:

1. Цільну.

2. Розведену ізотонічним розчином натрію хлориду 1:2.

3. Розведену ізотонічним розчином натрію хлориду 1:5.

Реакцію проводять з двома антигенами: трепонемним і кардіоліпіновим паралельно з кожним розведенням за схемою.

Через відсутність антикомплементарних властивостей спинномозкової рідини для дослідження комплемент в реакцій вводять по титру (перша доза, що розчинює, без звичайної надбавки) (табл. N 7).

Результати реакції враховують окремо для кожного антигену і розведення спинномозкової рідини. Результати реакції Васермана з спинномозковою рідиною оцінюють таким чином: повна і значна затримка гемолізу 4+, 3+ позитивна реакція; часткова затримка гемолізу 2+ - слабопозитивна реакція; незначна затримка гемолізу 1+ - сумнівна реакція; гемоліз - негативна реакція.

1. Невірний вибір дози комплементу-відсутність або надлишок комплементу.

2. Неправильне зберігання спинномозкової рідини.

3. Тривале зберігання спинномозкової рідини.

МІКРОРЕАКЦІЯ ПРЕЦИПІТАЦІЇ З ІНАКТИВОВАНОЮ СИРОВАТКОЮ І КАРДІОЛІПІНОВИМ АНТИГЕНОМ (ТИПУ ВДРЛ) - див. методику постановки відбіркових мікрореакцій преципітації.

Якісну реакцій для кожної досліджуваної сироватки крові проводять у трьох пробірках з двома антигенами. Кожну інактивовану сироватку крові, розведення 1:5 ізотонічним розчином хлориду натрію, розливають по 0,25 мл у три пробірки: до першої додають 0,25 мл трепонемного антигену, до другої - кардіоліпіновий антиген, Розведений за титром, до третьої контрольної - 0,25 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Легким струшуванням змішують вміст пробірок і витримують при температурі 18-20 град. С 10 хвилин. Потім в усі пробірки додають комплемент 0,25 мл, (робочу дозу комплементу для РЗК на холоді вираховують з 50% надбавкою в робочій дозі. одержаній під час титрування комплементу для РЗК в умовах термостату). Міст пробірок знову струмують і разом з гемолітичною системою ставлять у холодильник на 15-20 годин при температурі 4 град. С.

Наступного дня зміст пробірок і гемолітичну систему витримують при кімнатній температурі 15 хвилин. Після чого додають в усі пробірки по 0,5 мл гемолітичної системи, знову струшують і вміщують у термостат при температурі 37 град. С на 45-60 хвилин. Облік результатів реакції проводять після настання гемолізу в контрольній пробірці досліджуваної сироватки. Ступінь затримки гемолізу відмічають у журналі плюсами, як і під час постановки РЗК в умовах термостату (табл. N 8).

Результати реакції слід давати по кожному антигену окремо. Реакцію зв'язування комплементу на холоді рекомендують при підозрі на сифіліс первинний серонегативний, прихований, третинний, уроджений, а також під час атипових клінічних проявах захворювання.

ПРИНЦИП. Реакція основана на феномені втрати блідими трепонемами рухливості у присутності іммобілізуючих протитрепонемних антитіл досліджуваної сироватки і комплементу в умовах анаеробіозу.

Постановці реакції попереджує підготовча робота.

Весь лабораторний посуд (піпетки, пробірки, флакони та ін), яки використовують для постановки реакції іммобілізації трепонем, має бути стерильним. Перед стерилізацією його миють без застосування дезинфікуючих засобів. Для цього після досліду пробірки і флакони занурюють і з доданням прального порошку типу "Лотос" у воду кімнатної температури кип'ятять протягом 40 хв., охолоджують до 40 градусів і миють водопровідною, спочатку теплою, а потім холодною водою, наливаючи її у кожну пробірку 5-7 разів, після чого один раз промивають дистильованою водою і висушують у сушильній шафі. Висушений посуд загортають у папір і стерилізують автоклавуванням протягом 1 години при 1,5 атмосферах. Після стерилізації посуд знову висушують у сушильній шафі і зберігають у шафі у боксі протягом 7 днів.

Перед взяттям крові обстежуваний не повинен одержувати медикаментами, що трепонемоцидно впливають на бліді трепонеми, особливо препарати пеніциліну, трихопол і ін. Прийом препаратів відміняють на строк (3-4 тижні) їхньої можливої затримки у організмі. Під час використання пеніцилінази припинення введення препаратів пеніциліну не обов'язкове.

Кров для реакції беруть з ліктьової вени натщесерце стерильно у суху, хімічно чисту і стерильну пробірку. Шкіру ліктьового згину перед прооколом протирають не спиртом, а ефіром. Взяту кров обробляють так само, як і для реакції Вассермана, але з дотриманням умов стерильності. В реакції використовують сироватку, інактивовану протягом 30 хв. на водяній бані при 56 град. С. При необхідності повторного дослідження однієї і тієї ж сироватки інактивування проводять повторно, зле протягом 15 хвилин. Перед дослідженням сироватку можна зберігати у холодильнику протягом 10-15 днів при температурі 10-20 град. С, а при температурі 4 град. С протягом 5 днів. Ніяких консервантів до сироватки не додають. При необхідності транспортування стерильно зняту зі згустку сироватку наливають в окрему ампулу, запаюють і пересилають до лабораторії РІТ.

Період від моменту постановки реакції до реєстрації її результатів триває 20 годин, тому для збереження життєздатності і хорошої рухливості мікроорганізмів необхідне середовище виживання. Рекомендують середовище N 2 ЦКВІ. Для приготування середовища беруть 50 г яловичого або кролячого м'яса відокремлюють від жиру і сухожилля, подрібнюють, заливають 100 мл водопровідної води і ставлять у холодильник на 24 години при 4 град. С для екстрагування. Наступного дня кип'ятять протягом 10 хвилин кроляче м'ясо і 20 хвилин яловичину, охолоджують і фільтрують через багатошаровий паперовий фільтр. Після фільтрування установлюють РН 7,2-7.4, додаючи 20% розчину їдкого натрію. Приготовлене середовище стерилізують автоклавуванням протягом 30 хвилин при 2 атмосферах і ампулують. При умові збереження стерильності середовище придатне для використання протягом 12 місяців. Ампули з середовищем зберігають у холодильнику при 4 град. С. Кожну нову партію середовища попередньо порівнюють зі старою, з якою вже проводили досліди.

Реакція іммобілізації протікає лише при умові надлишку комплементу. В реакції застосовують свіжий комплемент морської свинки. Кількість його значною мірою залежить від середовища вживання блідих трепонем. При використанні середовища N 2 ЦКВІ в мікроанаеростатному методі кількість комплементу становить 27 % від загального об'єму реагентів, які використовують у реакції, а при постановці в меланжерах 40%.

Для одержання комплементу кров беруть обов'язково у кількох морських свинок так само, як для реакції Вассермана, але з дотриманням умов стерилізації. Після одержання сироватки, її наливають у стерильні пробірки по 1-4 мл і досліджують на стерильність. Для цього 1 мл сироватки морської свинки залишають у термостаті при 37 град. С на добу. У випадку бактеріального забруднення комплемент бракують. щ Пробірки з комплементом зберігають у холодильнику при -10 град. С протягом 2-3 тижнів. Повторно заморожування і відтанення не рекомендують. Не можна застосовувати в реакції іммобілізації блідих трепонем консервований комплемент, оскільки він токсичний для мікроорганізмів.

Ліофільно висушений без консерванту комплемент морської свинки може бути використаний в реакції, але за якістю він гірший від свіжого.

Як антиген в реакції використовують завись блідих трепонем з раннього орхіту кролика (7-9 доба після зараження). Використовують бліді трепонеми штама Нікольса, які щотижнево пасерують на кроликах. Заражених кроликів тримають у світлих приміщеннях, які провітрюються. Годують повноцінною їжею, яка містить вітаміни (морква обов'язкова). Для зараження слід брати здорових кроликів-самців вагою 2,5-3 кг з негативними результатами серологічних реакцій на сифіліс (РЗК і РІТ). За 1-2 доби до зараження у кроликів вистригають шерсть у нижній частині живота, внутрішній поверхні стегна і мошонки. Для одержання раннього специфічного орхіту кролика заражують введенням у середину кожного яєчка по 1 мл зависі блідих трепонем. У зависі повинно бути більше 500 мікроорганізмів у кожному полі зору мікроскопа при використанні окуляра 7х і об'єктиву 40х.

Введення тваринам кортизону для придушення імуногенезу хоч і не є суворо обов'язковим, але застосування його дозволяє збільшити в орхіті числа блідих трепонем. Кортизон вводять внутрішньом'язово в дозі 20 мг перед зараженням і в наступні дні по 10 мг.

З появою орхіту засвідчують збільшення розмірів яєчка і ущільнення його. Для видалення яєчок кролика прив'язують до станка, обезкровлюють пункцією серця, якщо кролик при цьому не гине, його забивають повітряною емболією - введенням 20 мл повітря у серце або вену вуха. Яєчко виводять через паховий канал в мошонку, поглажуючи по животу від середини вниз до мошонки. Поверхню шкіри мошонки накривають стерильною гумовою серветкою з розрізами, через які виводять яєчка. Шкіру мошонки над яєчками протирають тампоном, змоченим ефіром, піднімають її пінцетом спочатку над одним яєчком і роблять розріз ножицями, через який виводять яєчко разом з оболонкою, відрізають його біля основи ножицями і вміщують у стерильну чашку Петрі. Далі в умовах боксу кожне яєчко звільняють від оболонок, придатки і жиру. Вміщують у стерильний бокс, розрізають на 10-15 частин, заливають 5 мл ізотонічним розчином хлориду натрій і одержану завись досліджують під мікроскопом у темному полі зору на наявність блідих трепонем. Для цього на предметне скло пастерівською піпеткою наносять по краплі рідини з кожного яєчка. При наявності трепонем шматочки яєчок разом з середовищем з середовищем з бюксу переносять у флакон місткістю 50 мл і струшують у струшувачі для вимивання мікроорганізмів з тканини яєчок. Час струшування залежить від числа виявлених мікроорганізмів. При наявності 5-10 блідих трепонем у полі зору струшування триває протягом години, а при наявності 30-40 - лише 20-30 хвилин. Після струшування зміст флакону переносять у стерильну центрифужну пробірку і центрифугують протягом 5 хвилин при 1000 об/хв для осідання еритроцитів і шматочків тканини яєчок. Надсадову рідину переносять у іншу стерильну пробірку і з неї готують препарати на предметному склі, які досліджують у темному полі (як уже було описано), визначаючи приблизно число блідих трепонем у кількох полях зору.

Завись блідих трепонем, яку тримають у пробірці, набирають у шприц і заражують підготовлених кроликів, вводячи завись у середину кожного яєчка.

Для приготування антигену завись блідих трепонем розводять стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію так, щоб у полі зору було 10-15 мікроорганізмів. Наприклад, якщо у зависі є 1000-1500 мікроорганізмів у кожному полі зору, тобто трепонеми густо вкривають усе поле зору, то на 9,9 мл середовища добавляють 0,61 мл зависі трепонем, одержують розведення в 100 разів.

МЕТОДИКА ПРИГОТУВАННЯ. Дефібровану баранячу кров або еритроцити барана в об'єкт, необхідному для роботи на даний день, центрифугують, плазму зливають, а осад тричі відмивають 6-7 об'ємами фізіологічного розчину. Під час останнього промивання надосадова рідина повинна бути безбарвною. З щільного осаду готують зависі еритроцитів барана в ізотонічному розчину хлориду натрію. Рівний об'єм гемолітичної сироватки, розведеної в ізотонічному розчині хлориду натрію за потроєним титром, наприклад, якщо на етикетці вказаний титр 1:1200, то для розведення буде 1:400, тобто 0,1 мл на 40 мл фізіологічного розчину об'єднують з 1 % зависсю еритроцитів барана. Розчин гемолітичної сироватки приливають до зависі еритроцитів барана і швидко змішують. Одержану гемолітичну систему витримують у термостаті 30 хвилин при температурі 37 град. С.

Роботу по постановці реакції проводять у боксі. Кожну сироватку досліджують у двох пробірках-дослідній і контрольній. В обидві пробірки вносять по 0,05 мл досліджуваної сироватки і по 0,35 мл антигену. До дослідної пробірки наливають 0,15 мл активного комплементу, а до контрольне і таку саму кількість інактивованого комплементу. Після заповнення зміст пробірок змішують легким струшуванням і вміщують у мікроанаеростат.

З мікроанаеростату за допомогою вакуумного насосу видаляють атмосферне повітря і заповнюють його газовою сумішшю з балону, в якому міститься азот (95 частин, і вуглекислий газ (5 частин)). Під час заповнення мікроанаеростатів газовою сумішшю стежать за тим, щоб стрілка манометру не опускалася до нульового рівня. У цьому випадку вдається уникнути підвищення тиску всередині анаеростату, який спостерігається при переміщенні його з кімнати, де температура 35 град. С, а також дозволяє стежити за герметичністю цього приладу. Мікроанаеростат з пробірками вміщують у термостат при температурі 34-35 град. С на 18-20 годин.

Під час постановки реакції використовують 5 контрольних досліджень свідомо позитивної і негативної сироваток з попереднього досліду, активного і інактивованого комплементу і середовища виживання для блідих трепонем. Контрольну негативну сироватку застосовують для висновку про ступінь рухливості блідих трепонем у даному досліді. Контрольну позитивну сироватку для оцінки ступеня імобілізуючої активності в умовах даного досліду. Сироватки досліджують за вище описаною методикою. Дослідження активного і інактивованого комплементу і середовища проводять для ви значення їхнього впливу на рухливість блідих трепонем (табл. N 9).